专利名称：化合物泽泻醇a的制备方法及其具有致肾毒性作用的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及具有致肾毒性作用的化合物泽泻醇A的制备方法、泽泻醇A对人肾小管上皮细胞株(HKC)体外细胞毒作用的应用。
背景技术：
泽湾为泽湾科植物泽湾oriental is (Sam. ) Juzep.的干燥块莖。首载于《神
农本草经》，历版《中国药典》均有收载。为临床除作为利水渗湿性中药，还被用作药膳、减肥保健品中，这使得它们得以被长期服用。近年来，泽泻在临床上虽广泛应用，人们只关注它的治疗功效，却忽略了其长期使用或过量使用后对肾脏造成的毒性作用，为临床安全用药留下隐患。现代临床实践与药理实验仅限于对中毒现象的描述，而其致肾毒性作用的 物质基础却不甚明确，目前，对于泽泻肾毒性的研究仅限于临床报道和初步的毒理学研究，对于毒性物质基础的研究却鲜有报道。因此更需要确认泽泻致肾功能损伤的毒效部位物质基础。在中药单体化合物的毒性研究方面，学术界虽然取得了一些进展，但由于纯品化合物的分离，结构鉴定以及量的富集需要一定的前期研究，以动物进行整体水平的实验成本较高，因而在某种程度上受到限制。体外细胞毒试验不仅减少实验动物数量和受试药物的用量，缩短试验周期，而且可缩小动物种属间的差异。尤其是源于人类组织细胞的体外试验模型，消除了动物与人类的种属差异，同时可在短期内得到试验结果，降低研发成本，有助于在细胞和分子水平阐明药物毒性作用机理。人肾小管皮上细胞株(ffic细胞)源于人肾小管上皮，具有肾小管上皮细胞特有的结构和功能，能表达肾小管特异性标志酶，且存活时间长、易于传代培养。
权利要求
1.具有致肾毒性作用的化合物泽泻醇A的制备方法，其特征是 (1)制备泽泻乙醇提取液 取泽泻，加入其重量3 5倍的70% 95%乙醇，冷浸10 15 h，加热回流提取4 6 h，过滤，反复21次，合并滤液，经旋转蒸发仪50 1蒸干溶剂，得泽泻乙醇提取液的浸膏； (2)制备氯仿萃取物 将泽泻乙醇提取液的浸膏用水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等体积萃取，各2 4次，合并氯仿萃取液，经旋转蒸发仪50°C蒸干溶剂，得到氯仿层萃取物； (3)化合物泽泻醇A的纯化 取氯仿萃取物，硅胶柱层析(200 300目)，用二氯甲烷-甲醇按照1:0，50:1，40:1，20:1，10:1，7:1，4:1，2:1，1:1，0:1的梯度洗脱，其中，按50:1洗脱得到的流分Fr. 73 Fr. 80 (Fr.为“流分fraction”的缩写，Fr. 73 Fr. 80指柱层析分离所得组分中第73至第80个组分)先经过进一步的硅胶柱层析，再经S印hadex LH 20 (葡聚糖凝胶)凝胶柱层析，得到的流分经制备型高效液相分离纯化，得到无色粉末状化合物泽泻醇A。
2.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)中乙醇的体积分数为80%。
3.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)中乙醇的加入量为泽泻重量的4倍。
4.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)中冷浸时间为12h。
5.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)中回流提取时间为5h。
6.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤(I)中加热回流次数为3次。
7.如权利要求I所述制备方法，其特征在于步骤⑵中萃取次数为3次。
8.权利要求I所述的泽泻醇A的体外肾毒性试验方法，其特征是 (1)使用MTT法测定泽泻醇A和马兜铃酸对HKC细胞的增殖抑制作用 取对数生长期的HKC细胞，将细胞密度调整至7 X IO3个/孔埋入96孔培养板，培养24 h后，加入受试样品(调整其浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ii g/ml)，每个浓度设置三个复孔，同时设置空白对照孔，置于37 °C、含5 % CO2的细胞培养箱中继续培养至24、48及72 h，每孔加入15 u I MTT (5 mg/ml)和85 U I培养液，继续培养4 h，吸弃上清液，每孔加入150 二甲基亚砜(DMSO)，微量振荡器振荡10 min将结晶完全溶解，酶标仪492 nm波长下测定各孔吸光度值(A值)，根据以下公式分别计算不同浓度受试样品对HKC细胞的增殖抑制率 增值抑制率(%) - [A492 (control) _-^492 (test) ] /-^492 (control) X 100 IC5tl值由LOGIT法计算得出； (2)Hoechst 33342-PI荧光双染法观察细胞形态学变化 取对数生长期的HKC细胞，将细胞密度调整至7 X IO3个/孔埋入96孔板，培养24 h后，加入受试样品(调整其浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 u g/ml),作用24,48和72h后，按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒说明书进行Hoechst 33342和PI双染，荧光显微镜下观察细胞形态变化。
9.化合物泽泻醇A具有致肾毒性作用的应用。
全文摘要
本发明提供一种具有致肾毒性作用的化合物泽泻醇A的制备方法和实验方法，所要解决的问题是现代临床实践与药理实验仅限于对中毒现象的描述，而其致肾毒性作用的物质基础却不甚明确。本发明的要点是(1)制备泽泻乙醇提取液；(2)制备氯仿萃取物；(3)化合物泽泻醇A的纯化；(4)使用MTT法测定泽泻醇A对HKC细胞的增殖抑制作用；(5)Hoechst33342-PI荧光双染法观察细胞形态学变化。本发明的积极效果是为中药泽泻的合理应用和致肾损伤的防治提供依据。
文档编号G01N21/64GK102675396SQ201210133989
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者于治国, 俞悦, 毕开顺, 耿璐璐, 陈晓辉, 马超 申请人:沈阳药科大学