专利名称：用于检测神经损伤的组合物、试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种对神经损伤的诊断有用的组合物或试剂盒。本发明还涉及一种使用该组合物或试剂盒检测(或者判定或鉴定)神经损伤的方法。
背景技术：
由于医疗技术的进步和社会环境的变化，近年来，随着年龄增长而发生或发展的 疾病备受关注。代表性地如生活习惯病，据说这些疾病是体内产生的微小变化随年龄的增 长而逐渐蓄积并发生、发展的。其中，以神经损伤为主要原因的疾病已成为严重的社会问 题。神经损伤是由于动脉硬化等原因引起向组织供给氧和营养的的末梢血管狭窄·闭 塞，血流停滞、不能将营养成分充分地供给至末梢组织，结果导致神经功能异常的状态。血 管障碍在血管丰富的器官·组织发生时引起神经损伤之类的严重问题，如果血管障碍在感 觉器官、特别是在眼组织发生时，有时导致失明。被称为房水的液体代替血液在眼睛中流动以运输营养等。房水在睫状体中生成从 khlemm氏管中排出。眼睛的形状被称作眼压的该房水的压力保持。眼压随时间或季节略 微变化，但基本保持一定的值。青光眼是一种由某种原因引起的视神经损伤、视野变窄的疾病，眼压上升被称为 是其病因之一，为高龄者的失明原因之一。随着近年的高龄者人口的急剧增加，患者数也持 续增加。由于青光眼是无症状的所以早期发现困难。由于是能导致失明的疾病，所以早期 进行诊断是非常重要的。一直以来，在青光眼的诊断中，主要进行眼底检查，在检查之前对 患者滴入用于扩大瞳孔的散瞳药，然后，医师使用眼底镜或眼底照相机直接观察视网膜。但 是，现状为当散瞳药引起瞳孔扩大时，房水的流动变差，眼压上升，不能说完全不存在使病 情进一步恶化的可能性。另外，不能说医师对视网膜的直接观察一定是客观的检测方法，由 于医师必须一个人一个人地对患者进行检查，所以难以将该检查应用于包括大量受试者的 集团检查。如上所述，现有的检查方法存在较多的问题，人们期望一种用于早期诊断的、能够 更客观且定量地显示患者的病态的发展程度和治疗中的经时变化、使患者负担少的高通量 的检测方法。。使用诊断标记的检测方法是客观的高通量方法之一。到目前为止公开了一种特 异性识别由小梁细胞产生的作为糖皮质激素诱导蛋白质的TIGR的抗体的青光眼的诊断法 (专利文献1)、和房水中的TGF-β的定量(非专利文献1)。上述方法不能使用上述标记以 相对高的特异性判定青光眼，并且由于以诊断目的取出困难的眼组织为样品，所以该方法 目前仍处于研究阶段。随着近年的基因组分析或蛋白质组分析的进步，已经报道了各种各样的新型标记候选。青光眼中，通过使用眼组织的蛋白质组分析，已经报道了各种各样的新型标记候选 (非专利文献2、非专利文献幻。但是，还没有通过使用血液样品的蛋白质组分析发现青光 眼的蛋白质标记的报道、并且未知使用青光眼患者的血液中的蛋白质标记诊断青光眼的方 法。人们期待如果能够开发出可以诊断青光眼的标记及可以使用该标记进行诊断的方法， 则可以扩大应用于神经损伤自身的诊断。
专利文献1 日本特表平10-509866非专利文献1 :Min SH,Lee Tl，Chung YS,Kim HK. ,Korean JOphthalmol. 2006Sep ； 20(3) :162-5. Transforming growth factor-beta levelsin human aqueous humor of glaucomatous, diabetic and uveitic eyes.非专利文献2 =Bhuattacharya SK, Crabb JS,BoniIha VL, Gu X, Takahara H, Crabb JW., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006Jun ；47 (6) :2508-14. . Proteomics implicates peptidyl arginine deiminase 2 andoptic nerve citrullination in glaucoma pathogenesis.非专利文献3 =Tezel G, Tang X，Cai J.，Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005S印； 46(9) :3177-3187. Proteomic identification of oxidatively modifiedretinal proteins in a chronic pressure-induced rat model of glaucoma.

发明内容
上述已知的标记、及标记候选物缺乏特异性及/或灵敏性，并且还没有确立从生 物样品检测上述标记的有效方法，所以通常情况下不进行临床上的使用，因此强烈需要一 种特异性及灵敏性更高的神经损伤的标记。另外，人们期望一种能够更客观及定量地显示 出患者的病态的发展程度及术后的经时变化、使患者负担小的高通量检测方法。本发明的目的在于提供一种对伴随有神经损伤的疾病、特别是青光眼的诊断有用 的组合物、试剂盒、及使用该组合物或试剂盒的检测伴随有神经损伤的疾病的方法。本发明人等通过对青光眼患者和其他眼部疾病患者的血液样品进行蛋白质组分 析，发现了在青光眼患者中被特异性检测的血中蛋白质标记，并由此完成了使用该蛋白质 标记的青光眼的检测方法的发明。本发明具有以下特征。(1) 一种神经损伤的检测方法，包括定量或定性地测定及/或检测包含在来自受 试者的生物体样品中的多肽、其突变体或其片段中的任意1种或多种，所述多肽含有序列 号1 15所示的氨基酸序列。(2)如(1)所述的方法，其中，神经损伤为眼组织的神经损伤。(3)如⑵所述的方法，其中，眼组织的神经损伤为青光眼。(4)如⑴ (3)中任一项所述的方法，其中，上述多肽、其突变体或其片段的测定 及/或检测是使用质谱法进行的。(5)如(4)所述的方法，其中，上述测定及/或检测是使用能与上述多肽、其突变体 或其片段结合的物质进行的。(6)如(5)所述的方法，其中，上述可结合的物质为抗体或其抗原结合片段。(7)如(6)所述的方法，其中，使用的上述抗体为被酶、荧光物质、色素、放射性同位素或生物素中的任一种标记过的抗体。(8)如(6)或(7)所述的方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或 多克隆抗体或者其抗原结合片段。(9)如(1) (8)中任一项所述的方法，其中，所述生物体样品为血液、血浆或血清。(10) 一种用于诊断及/或检测神经损伤的组合物，含有选自抗体或其抗原结合片 段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针，其中，所述抗体或其抗原结合片 段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或 其片段的至少1种特异性结合。(11) 一种用于诊断及/或检测神经损伤的试剂盒，含有选自抗体或其抗原结合片 段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针，其中，所述抗体或其抗原结合片 段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或 其片段的至少1种特异性结合。(12)如(10)或(11)所述的用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒，其中，神经损 伤为眼组织的神经损伤。(13)如(12)所述的用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒，其中，眼组织的神经 损伤为青光眼。(14)抗体探针在(11) (13)中任一项所述的试剂盒的制造中的应用，其中，所述 抗体探针选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种，所述抗体 或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的 多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。< 定义 >本说明书中使用的用语具有以下定义。本说明书中所谓的含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽的突变体，是指在 序列号1 15所示的氨基酸序列或其部分序列中含有1或多个、优选为1或几个的氨基酸 的缺失、取代、添加或插入的突变体，或者是含有与该氨基酸序列或其部分序列具有约80% 以上、约85%以上、优选为约90%以上、较优选为约95%以上、约97%以上、约98%以上、约 99%以上同一性的氨基酸序列的突变体。本说明书中使用的“ ％同一性”的用语通常是指通过在2个氨基酸序列中引入空 隙、或不引入空隙进行编组(比对)时，两个序列共有的同一氨基酸残基或位置的数相对于 氨基酸残基或位置的总数的比例(％)。2个氨基酸序列的同一性可以使用数学算法确定， 所述算法的例子为 Karlin and Altshul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990,87 :2264 及作为 其改良版的 Karlin and Altshul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA1993,90 5873-58770 这种算 法被引入 BLASTN、BLASTX 等(Altshulet al.，J. Mol. Biol. 1990，215 :403)。为了得到与本 发明的序列号1 15所示的多肽的各氨基酸序列相同的氨基酸序列，使用例如分数=50、 字长=3的BLAST程序进行BLAST的蛋白质检索。另外，为了得到引入空隙的比对，可以使 用空隙引入 BLAST (gapped BLAST) (Altshul et al.，Nucleic Acid Res. 1997,25 :3389)。本说明书中使用的“几个”的用语是指约10、9、8、7、6、5、4、3或2的整数。本说明书中使用的“化学修饰衍生物”的用语，是指例如通过酶、荧光物质、色素、放射性同位素等标记的标记化衍生物；或者含有生物素化、乙酰化、糖基化、磷酸化、泛素 化、硫酸化等化学修饰的衍生物，但不限定于上述物质。本说明书中使用的“用于诊断及/或检测的组合物或试剂盒”的用语，是指可以直 接或间接地用于下述用途的组合物或试剂盒诊断及/或检测青光眼等伴随有神经损伤的 疾病的罹患的有无、罹患的程度或改善的有无或改善的程度，或者筛选对青光眼等伴随有 神经损伤的疾病的预防、改善或治疗有用的候选物质。本说明书中作为检测或诊断对象的所谓的“生物样品”，是指取自生物体的、含有 或者可能含有随青光眼等伴随有神经损伤的疾病的发生而出现的靶多肽的样品，例如细 胞、组织、体液(例如血液、淋巴液、尿等)等样品。本说明书中所谓“特异性结合”是指抗体或其抗原结合片段只与本发明中作为青 光眼标记的靶多肽、其突变体或其片段形成抗原-抗体复合体，与其他的肽性或多肽性物 质实质上不形成该复合体。此处所谓的“实质上”，是指可能发生非特异性的复合体形成但 程度小。本发明中的青光眼等伴随有神经损伤的疾病的标记，由于在青光眼患者的血液等 生物体样品中被发现，但在白内障或老年黄斑变性等其他眼部疾病中基本上、或完全未被 发现，因此仅以该标记的存在或量为指标可以得到如下的显著的作用效果例如使用血液 可以容易地检测青光眼及伴随有神经损伤的疾病。本说明书包含作为本申请优先权基础的日本国专利申请2008-091522号的说明 书及/或附图
中记载的内容。
具体实施例方式以下更具体地说明本发明。<伴随有神经损伤的疾病的标记>本发明的使用检测组合物或试剂盒用于诊断及/或检测伴随有神经损伤的疾病 的标记，是含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片段。所述组合物 或试剂盒用于诊断或检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病。本发明的含有序列号1 15的氨基酸序列的多肽、其蛋白质号(Swiss-Prot注 册名及注册号)、及它们的特性均示于下述表1。所述多肽在青光眼患者血浆中被特异性 检测，在白内障及老年黄斑变性的患者的血浆中未被检测或者与青光眼患者血浆中相比 检测显著地减少。需要说明的是，序列表所示的上述多肽的氨基酸序列可以通过存取在 Swiss-Prot等数据库中而获得。[表 1]权利要求
1.一种神经损伤的检测方法，包括定量或定性地测定及/或检测包含在来自受试者的 生物体样品中的多肽、其突变体或其片段中的任意ι种或多种，所述多肽含有序列号ι 15 所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中，神经损伤为眼组织的神经损伤。
3.如权利要求2所述的方法，其中，眼组织的神经损伤为青光眼。
4.如权利要求1 3中任一项所述的方法，其中，所述多肽、其突变体或其片段的测定 及/或检测是使用质谱法进行的。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述测定及/或检测是使用能与所述多肽、其突变 体或其片段结合的物质进行的。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述可结合的物质为抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求6所述的方法，其中，使用的所述抗体为被酶、荧光物质、色素、放射性同 位素或生物素中的任一种标记过的抗体。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体或多 克隆抗体或者其抗原结合片段。
9.如权利要求1 8中任一项所述的方法，其中，所述生物体样品为血液、血浆或血清。
10.一种用于诊断及/或检测神经损伤的组合物，含有选自抗体或其抗原结合片段或 它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针，其中，所述抗体或其抗原结合片段或 它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片 段的至少1种特异性结合。
11.一种用于诊断及/或检测神经损伤的试剂盒，含有选自抗体或其抗原结合片段或 它们的化学修饰衍生物中的1种或多种的抗体探针，其中，所述抗体或其抗原结合片段或 它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的多肽、其突变体或其片 段的至少1种特异性结合。
12.如权利要求10或11所述的组合物或试剂盒，其中，神经损伤为眼组织的神经损伤。
13.如权利要求12所述的组合物或试剂盒，其中，眼组织的神经损伤为青光眼。
14.抗体探针在权利要求11 13中任一项所述的试剂盒的制造中的应用，其中，所述 抗体探针选自抗体或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物中的1种或多种，所述抗体 或其抗原结合片段或它们的化学修饰衍生物能与含有序列号1 15所示的氨基酸序列的 多肽、其突变体或其片段的至少1种特异性结合。
全文摘要
本发明涉及一种检测青光眼等伴随有神经损伤的疾病的方法以及用于诊断青光眼等伴随有神经损伤的疾病的组合物或试剂盒，其中，所述方法包括测定来自受试者的生物体样品中的序列号1～15所示的多肽、其突变体或其片段中的任意一种或多种。
文档编号G01N33/68GK102047113SQ200980119619
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者岩田岳, 松野圣, 棚桥一裕 申请人:参天制药株式会社, 独立行政法人国立病院机构