专利名称：人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，特别是人类免疫缺陷病毒HIV(1+2型)抗体检测试剂盒。
背景技术：
艾滋病(AIDS)是Acquired Immune Deficiency Syndrome 的简称，S卩“后天(获得性)免疫缺乏症候群”。艾滋病是由艾滋病毒所引起的，艾滋病毒又称为人类免疫缺乏病毒(Human Immunodeficiency Virus)，简称HIV。自1981年首先在美国被发现至今近20 年的时间内，已经在全世界发生了非常广泛的流行，造成十分严重的危害。据《中国艾滋病防治联合评估报告(2007年)》统计，截至2007年10月底，全国累计报告艾滋病病毒感染者和艾滋病病人223501例，其中艾滋病病人6观38例，死亡报告22205例。根据联合国艾滋病规划署(UNAIDQ与世界卫生组织(WHO)共同发布的2007年艾滋病疫情更新报告O007AIDS Epidemic Update)，2007年全球HIV携带者约3320万人，250 万例为新发HIV感染，210万人死于艾滋病。AIDS仍是目前人类死亡的重要原因。同时女性感染的人数也急剧增加，这也意味着通过母婴传播，越来越多的婴儿感染HIV。HIV是绝对依赖病源学诊断的传染病，HIV检测是HIV防治工作的一个重要的组成部分；由于HIV有较长的潜伏期，只有通过病原学检测才能发现HIV，并有效地控制HIV通过血液、性接触和母婴途径传播。人类免疫缺陷病毒(HIV)自从1981年被发现以来，科学家们已进行了大量研究， 建立了各种检测方法。抗HIV试剂自问世以来，已逐步完善并被普遍用于血源筛查和临床诊断。当前市场上主要的HIV抗体诊断试剂为第三代试剂，在灵敏度和特异性方面均比前代试剂有很大提高。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于人类免疫缺陷病毒HIV(l+2型)抗体检测的时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。本发明采用铕标记技术，提供铕标记试剂盒，以提高方法的灵敏度及稳定性。本发明的技术方案是人类免疫缺陷病毒HIV (1+2型)抗体时间分辨免疫荧光分析法，包括下列步骤①固相抗体制备将HIV重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释至Ι-lOug/mL作为包被液， 包被反应板，形成固相抗体，并用封闭液(磷酸盐缓冲液及0.5% (W/V)的牛血清白蛋白 (BSA))封闭；②镧系元素离子标记抗原制备选用配对HIV重组抗原用常规方法进行镧系元素离子标记；③步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入HIV阴阳性对照或待测样品，以及用反应缓冲液稀释的标记抗原进行孵育，经荧光增强液解离后，最后进行荧光测定。步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为l-10ug/mL，步骤②中配对HIV重组抗原需在反应缓冲液(pH 7.8的50mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，内含0. 9% NaCl, 1% BSA, 0. 05%牛 IgG，20uM EDTA，0. 08%吐温(Tween) 20 和 0. 1 %NaN3 (反应缓冲液组分％指的是W/V))以体积比为1 21稀释。步骤②中的镧系元素离子优选为Eu3+。步骤③中反应缓冲液同②；且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。所用荧光增强液为β 二酮体。人类免疫缺陷病毒HIV(l+2型)抗体检测试剂盒，其特征是试剂盒包括包被抗原的缓冲液(碳酸盐缓冲液)、封闭液(磷酸盐缓冲液及0.5% (W/V)BSA)、反应缓冲液(pH 7.8 的 50mmol/L Tris-HCl,内含 0. 9 % NaCl, 1 % BSA，0. 05% 牛 IgG，20uM EDTA,0. 08% Tween20和0. 1 % NaN3)、工作洗涤液(磷酸盐缓冲液)、荧光增强液，以及作为包被抗原的 HIV重组抗体，镧系元素离子标记的HIV重组抗原。本发明使用双抗原夹心法，反应步骤包括试剂准备、加样反应、洗涤拍干、加增强液、测荧光值。本发明的有益效果是分析灵敏度高(符合或超过HIV国家参比品的要求)，检测时间短(IOOmin)，特异性好，与干扰物质的交叉反应小。


图1为本发明的反应原理图本发明采用双抗原夹心二步法。HIV重组抗原包被于96孔荧免板，阴阳性对照或样品中的HIV抗体与包被抗原于微孔内表面发生免疫反应；洗涤后，加入铕离子(Eu3+)标记的HIV抗原，免疫反应后，微孔表面的夹心免疫复合物与游离标记抗原通过洗涤分离。微孔表面免疫复合物中的Eu3+被荧光增强液解离后形成稳定的荧光配合物，荧光强度与阴阳性对照或样品中的HIV看题浓度呈正比例，通过Cutoff值可以判断HIV抗体阴阳性结果。图2为本发明操作流程图第一步复融铕标记抗原，第二步稀释铕标记物，第三步加入阴阳性对照和待测样品，第四步孵育，第五步洗板，第六步加入稀释后的铕标记，第七步孵育，第八步 洗板，第九步加入增强液，第十步检测。
具体实施例方式下面参照图1、2通过实施例对本发明作进一步说明。实施例人类免疫缺陷病毒HIV (1+2型)抗体检测1、在进行时间分辨免疫荧光分析检测法前需完成下列准备工作首先制备包被板，所用的包被板为特异性重组抗原包被的板，HIV包被板条的制备包括以下步骤(1)将纯化的HIV重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释，然后加入包被板条各孔内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后获得HIV重组抗原包被板条；(2)将HIV重组抗原包被板条装入专用的铝箔包装袋，封口并冷藏备用。其次是HIV重组抗原铕标记的制备，包括以下步骤(a)取待标记抗原加入透析袋中，放入配制好的pH 9. 5的碳酸盐缓冲液中，室温透析过夜；(b)次日，取出透析好的抗原用pH 9.5的碳酸盐缓冲液稀释至0.2-5/!^，按质量比为2 1的比例(DTTA-Eu(异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(III))抗原)边振荡边加入DTTA-Eu，室温下在振板机上慢速振荡1小时，然后在黑暗中静置48小时；(c)标记好的抗原与游离 DTTA-Eu 通过 S印hadex G50 (8cm) +Sepharose 6B (38cm) 色谱柱(1. 5X 50cm)分离，分离过程用核酸蛋白仪监控；(d)用小试管依次分段接受流出物，用分光光度计，在^Onm处测吸光度，同时测荧光强度，计算出Eu标抗原浓度；(e)用孔径0. 2um的过滤器过滤；(f)加入 0. 3% (W/V)优级纯 BSA，2-8°C保存。2、操作步骤1)试剂盒准备包被抗原的缓冲液(碳酸盐缓冲液)、封闭液(磷酸盐缓冲液及 0. 5% BSA(W/V))、反应缓冲液(pH 7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl,内含 0. 9% NaCl, 1% BSA, 0. 05%牛 IgG，20uM EDTA，0. 08% Tween20 和 0. 1 % NaN3)、工作洗涤液(磷酸盐缓冲液)、 荧光增强液(β 二酮体)，以及作为包被抗原的HIV重组抗体，镧系元素离子标记的HIV重组抗原。工作洗涤液配制将40mL磷酸盐缓冲液(25倍浓缩液)用蒸馏水或去离子水稀释至1，OOOmL备用。复溶HIV抗原-Eu3+ 在HIV抗原-Eu3+冻干品中加入1. OmL蒸馏水或去离子水，混勻后至少静置10分钟。2)编号将样品对应微孔按序编号，每板应设HIV抗体阴、阳性对照各2孔。3)加样分别在相应微孔中加入HIV抗体阴性对照、阳性对照及待测样品100μ L。4)第一步孵育室温QO 25°C )于慢档振荡60分钟。5)配制HIV抗原-Eu3+工作液(第二步孵育前1小时之内配制)对每一条12孔板，取75 μ L HIV抗原-Eu3+，加入1. 5mL反应缓冲液，充分混勻。6)第一次洗涤用工作洗液洗涤微孔板5遍，扣干。7)加HIV抗原-Eu3+工作液每孔加入100 μ L。8)第二步孵育室温QO 25°C )于慢档振荡40分钟。9)第二次洗涤用工作洗液洗涤微孔板5遍，扣干。10)荧光增强与测量在每个微孔内加入100 μ L荧光增强液，慢档振动5分钟，选择相应程序检测荧光。
权利要求
1.人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法，其特征是包括下列步骤①固相抗体制备将Hiv重组抗原用碳酸盐缓冲液稀释至Ι-lOug/mL作为包被液，包被反应板，形成固相抗体，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记重组抗原制备选用配对HIV重组抗原用常规方法进行镧系元素离子标记；③在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔加入HIV阴阳性对照或待测样品， 以及用反应缓冲液稀释的标记抗原进行孵育，经荧光增强液解离后，最后进行荧光测定。
2.根据权利要求1所述人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中配对HIV重组抗原需用反应缓冲液以体积比1 21稀释。
3.根据权利要求1所述人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法，其特征是步骤②中的镧系元素离子为Eu3+。
4.根据权利要求1或2所述人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法，其特征是反应缓冲液为 PH 7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl，内含 0. 9% NaCl，1 % BSA，0. 05%牛 IgG, 20uM EDTA，0. 08% 吐温 20 禾口 0. NaN3。
5.根据权利要求1所述人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法，其特征是且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。
6.人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其特征是试剂盒包括包被抗原的缓冲液、封闭液、反应缓冲液、工作洗涤液、荧光增强液，作为包被抗原的HIV重组抗原，镧系元素离子标记的HIV重组抗原。
7.根据权利要求6所述人类免疫缺陷病毒抗体检测试剂盒，其特征是包被抗原的缓冲液碳酸盐缓冲液；封闭液磷酸盐缓冲液及0. 5% BSA ；反应缓冲液PH 7. 8 的 50mmol/L Tris-HCl，内含 0. 9% NaCl，1 % BSA，0. 05%牛 IgG， 20uM EDTA, 0. 08 % 吐温 20 和 0· 1 % NaN3 ；工作洗涤液磷酸盐缓冲液；荧光增强液β 二酮体。
全文摘要
本发明公开了人类免疫缺陷病毒HIV(1+2型)抗体检测双抗原夹心时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒，其选用重组你作为包被抗原，用碳酸钠缓冲溶液稀释至1-10ug/mL作为包被液；配对HIV重组抗原用镧系元素离子标记作为标记抗原；实验时用反应缓冲液按1∶21稀释使用；在包被抗体的反应板上，每孔依次加入100uL的HIV阴阳性对照或待测样品、以及稀释的标记抗原，孵育后进行荧光检测。本发明还提供相应的试剂盒。本发明具有较高的灵敏度、特异性及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
文档编号G01N33/569GK102236021SQ20101015249
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者张小寒 申请人:上海新波生物技术有限公司