专利名称：肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法
技术领域：
本发明涉及细胞表面抗原的免疫测定方法，尤其是结合电化学分析技术建立了肿瘤细胞表面抗原的原位测定方法。
背景技术：
恶性肿瘤的发病率和死亡率的上升趋势正直接威胁着人类健康，它的早期诊断和治疗是提高肿瘤患者生存率的关键，早期诊断和疗效观察方法的研究已成为肿瘤防治研究的重要前沿领域之一。肿瘤相关抗原是一些因癌细胞代谢改变而产生并可指示癌变过程的物质，它们多是细胞癌变过程中出现的新抗原及过度表达的抗原，利用肿瘤相关抗原作为肿瘤标志物，通过免疫分析来进行恶性肿瘤的早期检出已成为肿瘤疾病诊断和病情监控的主要手段。以免疫细胞化学方法来检测和定位肿瘤细胞所特有的肿瘤标记物，越来越引起许多肿瘤病理学工作者的兴趣，正受到科研工作者的普遍关注与重视。
肿瘤的抗原性是肿瘤免疫学的核心问题。进入20世纪80年代，随着单克隆抗体技术的诞生，越来越多的细胞表面上具有免疫功能的分子被发现，为癌细胞的检出和肿瘤疾病的诊断提供了新途径。利用流式细胞术对细胞表面分化抗原的研究表明不同的肿瘤细胞具有各自的免疫表型，因而测定细胞表面抗原表达的水平，对于了解肿瘤细胞的增殖与分化情况和采取相应药物进行治疗具有重要的临床意义。
电化学分析技术具有许多优越性，如测试探头可微型化，不受体系浊度和颜色影响，方法灵敏度高、速度快、花费低、危害小等。它还具有检测仪器简单、易于微型化的特点，线性范围宽、灵敏度高，因而可直接将检测信号转换为直观易读的浓度值，便于非专业人士使用。目前，利用电化学方法对恶性肿瘤细胞表面分化抗原进行原位免疫测定未见报道。发展肿瘤细胞免疫表达和细胞因子的原位电化学免疫检测新技术，对肿瘤疾病的早期免疫临床诊断、疗效观察和指导治疗具有重要意义，对于分析化学特别是电分析化学的发展也具有推动作用。

发明内容
本发明目的是建立一种肿瘤细胞表面分化抗原的原位检测新方法。利用电化学分析简便、易行、价廉的特点，结合免疫分析高选择性、高灵敏度方法，发展肿瘤细胞免疫表达和细胞因子的原位电化学免疫检测新技术，为肿瘤疾病的诊断与治疗提供新途径。
本发明首先在电化学预处理的玻碳电极表面形成金胶-壳聚糖膜，构造生物兼容性好的仿生界面，用于肿瘤细胞在电极表面的固定。结合免疫学原理，通过两步温育反应将碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面，利用酶对底物的催化反应产生的电化学活性物质的安培响应测定肿瘤细胞表面抗原的含量，建立了一种肿瘤细胞表面免疫表达的原位电化学免疫检测新技术。
玻碳电极经电化学预处理活化后形成富氧层以增加电极表面的亲水性，有利于构造生物兼容性好的金胶-壳聚糖膜仿生界面。在此界面上，固定的肿瘤细胞可稳定地保持其天然状态。该方法改良后的界面使肿瘤细胞表面特异性分化抗原充分裸露，经两步温育过程将碱性磷酸酶(AP)标记抗体引入到细胞膜表面，催化1-萘酚磷酸酯(1-NP)水解产生具有电化学活性的1-萘酚，根据1-萘酚的氧化电流测定细胞表面的抗原，从而发展了一种肿瘤细胞免疫表达的原位电化学免疫检测新技术。
1.肿瘤细胞固定(1)对玻碳电极(GCE)表面进行电化学预处理，得到洁净、亲水的富氧基表面。
(2)在处理后的玻碳电极表面滴涂一定浓度的交联Mos-丁酰壳聚糖溶液，水解后自然成膜，如图1所示。
(3)将壳聚糖膜修饰电极(CS/GCE)浸入金胶溶液中30min取出，自然干燥后得到金胶-壳聚糖膜仿生界面。该界面的生物兼容性与浸泡金胶的时间及金胶的含量有关。CS/GCE在金胶溶液中浸泡时间越长，吸附的金胶纳米粒子越多；但时间太长，金胶溶液团聚且慢慢出现黑色沉淀，影响吸附到电极表面的金纳米粒子的性质。只有当吸附金胶的含量一定，才能得到分布均匀、稳定性高、生物兼容性好的功能膜。
(4)将肿瘤细胞悬浊液滴涂于上述金胶-壳聚糖膜修饰电极(Au-CS/GCE)表面进行肿瘤细胞的固定。
2.肿瘤细胞表面抗原及细胞浓度的电化学免疫检测(1)免疫反应条件的优化，包括以下四个方面a)温育液中酶标抗体的含量为获得最优的检测范围和灵敏度，温育液中酶标抗体的含量要满足固定化细胞表面抗原结合所需的量。
b)缓冲溶液的pH值细胞在人体正常pH条件在才具有最佳活性，同时抗体上标记酶的活性也与溶液酸度有关，碱性磷酸酶在较低的pH条件下很不稳定。
c)温育时间免疫反应(抗原、抗体间的识别、结合)通常需要一定时间来完成，为保证测定的准确性和灵敏性，要求控制一定的反应时间确保免疫反应的完成。
d)温育温度免疫反应一般在人体或高等动物体内发生，其对温度较敏感。在适合的温度下(一般是常温或人体温度)，免疫反应达到最大效率。
(2)将得到的结合AP标记抗体的肿瘤细胞修饰电极于含1-NP检测溶液中进行电化学检测，AP催化1-NP水解产生具有电化学活性的1-萘酚，根据1-萘酚的氧化电流测定肿瘤细胞表面的抗原。
(3)改变固定化肿瘤细胞的浓度，在最佳免疫反应条件下测定不同细胞浓度时的电化学响应，进行肿瘤细胞的定量。检测原理见图2(以肿瘤细胞表面P-gp检测为例)。
对于不同的肿瘤细胞，产生的表面抗原具有不同的免疫反应条件或特征K562白血病细胞(K562/ADM细胞)表面P-gp抗原测定将P-gp鼠抗人一抗(P-gp MAb)和碱性磷酸酶标记羊抗鼠二抗(AP-P-gp MAb)的PBS溶液中分别温育，将碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面，得到AP-P-gp-K562/ADM-Au-CS/GCE。其它肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原和细胞浓度，如卵巢癌细胞表面的糖蛋白CA125、胰腺癌细胞表面的糖蛋白CA19-9、原发性肝癌细胞表面的甲胎蛋白(AFP)、结肠癌细胞表面的癌胚抗原(CEA)等都可以用该方法进行原位检测。而其它酶，如辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶、漆酶等标记的二抗和相应的可产生电化学响应的底物也可以用于肿瘤细胞表面抗原和细胞浓度的原位电化学免疫测定。
本发明的特点是结合免疫分析高选择性、高灵敏度方法，利用电化学分析简便、易行、价廉的特点，建立了一种肿瘤细胞表面分化抗原的原位电化学免疫检测新技术，为肿瘤细胞各种抗原表达水平的测定及肿瘤疾病的诊断与治疗提供了新途径。该方法较现有的肿瘤抗原分析方法，具有以下优点(1)电化学仪器操作简便灵活、成本较低、分析速度快，适用于临床快速检测；(2)利用壳聚糖这种天然高分子材料固定肿瘤细胞具有很好的应用前景，该材料价廉易得、低毒性、亲水性，且具有良好的化学稳定性和生物兼容性；(3)将制备和检测集于一电极表面，细胞所需量及其它试剂的耗量少，温育时间短，进而降低了测定成本；(4)该方法表现出很好的精确性、重复性和稳定性，制备方法简单，检测成本较现有的肿瘤细胞表面抗原的原位测定方法，如流式细胞技术，要低得多。
(5)不仅在理论上为肿瘤细胞表面抗原的原位测定建立了一种新方法，而且可望代替流式细胞仪发展新型的细胞免疫分析测定技术并向市场推广。
本发明通过化学修饰技术成功地将肿瘤细胞固定在金胶-壳聚糖膜仿生界面，该材料价廉易得、低毒性、亲水性，且具有良好的化学稳定性和生物兼容性，用于生物分子的固定具有很好的应用前景。结合免疫分析的特异性识别反应温育酶标抗体，通过酶对底物催化产生电活性物质进行安培检测，实现了肿瘤细胞膜表面抗原的原位检测。由于电化学检测操作简单、成本较低、分析速度快，可望实现临床肿瘤细胞表面各种抗原表达水平的快速测定，为肿瘤疾病的诊断与治疗提供了新途径。


图1为本发明Mos-丁酰壳聚糖膜的形成图2为本发明肿瘤细胞固定及表面P-gp抗原的原位电化学免疫测定方法的反应原理图具体实施方式
以阿霉素诱导K562白血病细胞(K562/ADM细胞)表面P-gp抗原测定为例，当然一般的样品也完全可以被本发明方法检测1.K562/ADM细胞固定
(1)电极抛光将4mm盘状玻碳电极分别用1.0，0.3和0.05μm的α-氧化铝悬浆在麂皮上抛光呈镜面，二次水冲洗干净，再依次用1∶1硝酸、丙酮、二次水超声清洗，得到新鲜、洁净的电极表面。
(2)电极表面预处理将抛光后的玻碳电极在pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液中于+1.75V恒电位下氧化电解300秒后，再依次于+0.3～+1.3V和+0.3～-1.3V电位范围内循环扫描直至得到稳定电流值。取出电极，二次水冲洗后，氮气吹干。
(3)壳聚糖膜的形成取5μl1.0wt.％交联Mos-丁酰壳聚糖溶液，滴涂在经上述步骤处理的电极表面，水解成膜，得到壳聚糖膜修饰电极(CS/GCE)。
(4)金胶-壳聚糖膜的形成将CS/GCE浸入新制备的24-nm的金胶溶液中，30min后取出，自然干燥后得到金胶-壳聚糖(Au-CS)膜仿生界面。
(5)K562/ADM细胞固定取5μl2.0×106cells/ml细胞悬浊液滴涂于上述金胶-壳聚糖膜修饰电极(Au-CS/GCE)表面，实现K562/ADM细胞的固定，得到K562/ADM-Au-CS/GCE。
2.固定化K562/ADM细胞表面P-gp抗原免疫反应条件的优化分别改变温育溶液中抗体的含量、温育液的pH值、温育温度及温育时间，选择达到最大电流响应时对应的值作为最佳免疫反应条件，其检测过程为以BSA/EDTA/PBS为稀释液，将P-gp鼠抗人一抗(P-gp MAb)和碱性磷酸酶标记羊抗鼠二抗(AP-P-gp MAb)稀释至不同浓度。将K562/ADM-Au-CS/GCE依次在含有P-gp MAb和AP-P-gp MAb的PBS溶液中分别温育，通过两步温育反应将碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面，得到AP-P-gp-K562/ADM-Au-CS/GCE。
实验结果显示，最佳免疫反应条件为5μg/ml P-gp MAb，2μg/ml AP-P-gp MAb，pH7.4PBS，在35℃下温育60min。
3.细胞表面P-gp抗原的检测将AP-P-gp-K562/ADM-Au-CS/GCE置于含有0.25mM 1-萘基酚磷酸酯的1.0ml pH7.4 PBS中记录电化学响应，利用AP催化1-NP水解产生的1-萘酚的氧化电流测定K562/ADM细胞表面的P-gp抗原的含量。其制备过程与检测原理如图2所示。
4.K562/ADM细胞的定量在优化的实验条件下，改变用于固定的K562/ADM细胞浓度，在最佳免疫反应条件下测定不同细胞浓度时得到的电化学响应，根据电流与细胞浓度的对数间的线性关系进行K562/ADM细胞浓度的定量。
辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶、漆酶等标记的二抗和相应的可产生电化学响应的底物也可以用于肿瘤细胞表面抗原和细胞浓度的原位电化学免疫测定相应用于检测卵巢癌细胞表面的糖蛋白CA125、胰腺癌细胞表面的糖蛋白CA19-9、原发性肝癌细胞表面的甲胎蛋白(AFP)、结肠癌细胞表面的癌胚抗原(CEA)亦采用本发明的方法。
权利要求
1.肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是玻碳电极经电化学预处理活化后形成富氧层以增加电极表面的亲水性，以电化学预处理的玻碳电极表面形成金胶-壳聚糖膜，构造生物兼容性好的仿生界面，用于肿瘤细胞在电极表面的固定，结合免疫学原理，通过两步温育反应将碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面，利用酶对底物的催化反应产生的电化学活性物质的安培响应，即利用酶对底物的催化反应产生具有电化学活性的分子，根据该分子的安培响应测定肿瘤细胞表面的抗原的含量。
2.根据权利要求1所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是在生物兼容性好的金胶-壳聚糖膜仿生界面上，固定的肿瘤细胞稳定地保持其天然状态。
3.根据权利要求1所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是改良后的界面使肿瘤细胞表面特异性分化抗原充分裸露，经两步温育过程将碱性磷酸酶(AP)标记抗体引入到细胞膜表面，催化1-萘酚磷酸酯(1-NP)水解产生具有电化学活性的1-萘酚，根据1-萘酚的氧化电流测定细胞表面的抗原。
4.根据权利要求1所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是在最佳免疫反应条件下，安培响应与用于固定的细胞浓度的对数有线性关系，进行肿瘤细胞浓度的定量。
5.根据权利要求1所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是以BSA/EDTA/PBS为稀释液，将P-gp鼠抗人一抗(P-gp MAb)和碱性磷酸酶标记羊抗鼠二抗(AP-P-gp MAb)稀释至不同浓度；将待量的样品测依次在含有P-gp MAb和AP-P-gp MAb的PBS溶液中分别温育，通过两步温育反应将碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面。
6.根据权利要求5所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是最佳免疫反应条件为5μg/ml P-gp MAb，2μg/ml AP-P-gp MAb，pH 7.4PBS，在35℃下温育60min。
7.根据权利要求6所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是碱性磷酸酶标记抗体结合到细胞膜表面的玻碳电极置于含有0.25mM1-萘基酚磷酸酯的1.0ml pH 7.4 PBS中记录电化学响应，利用AP催化1-NP水解产生的1-萘酚的氧化电流测定细胞表面的P-gp抗原的含量。
8.根据权利要求1和2所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是检测其它肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原和细胞浓度，如卵巢癌细胞表面的糖蛋白CA125、胰腺癌细胞表面的糖蛋白CA19-9、原发性肝癌细胞表面的甲胎蛋白(AFP)、结肠癌细胞表面的癌胚抗原(CEA)进行原位检测。
9.根据权利要求3和5所述的肿瘤细胞表面抗原的原位电化学免疫测定方法，其特征是用辣根过氧化酶、葡萄糖氧化酶、漆酶等标记的二抗和相应的可产生电化学响应的底物用于肿瘤细胞表面抗原和细胞浓度的原位电化学免疫测定。
全文摘要
本发明建立了一种肿瘤细胞表面分化抗原的原位电化学免疫检测新方法。通过化学修饰技术成功地将肿瘤细胞固定在金胶－壳聚糖膜仿生界面。本发明利用电化学技术简便、易行、价廉的特点，结合免疫分析高选择性、高灵敏度方法，通过固定化肿瘤细胞表面结合的酶对底物的催化反应产生具有电化学活性的分子，实现了肿瘤细胞膜表面抗原的原位安培检测。该方法将制备和检测集于一电极表面，细胞所需量及其它试剂的耗量少，温育时间短，测定成本低，检测速度和效率高。由于电化学仪器操作简单、成本较低、分析速度快，可望实现临床肿瘤细胞表面各种抗原表达水平的快速测定，为肿瘤疾病的诊断与治疗提供了新途径。
文档编号G01N27/403GK1588078SQ20041006473
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月24日 优先权日2004年9月24日
发明者鞠熀先, 杜丹 申请人:南京大学