专利名称：一种用于核酸测序的微流体基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与新一代低成本高通量核酸测序系统配套的微流体基因芯片，属 于生物医学工程设备制造技术和相关器件领域。
背景技术：
基因芯片是微阵列生物芯片中的一种，微阵列生物芯片主要指在固体基片上组装 的生物活性物质(包括核酸、蛋白质、细胞及微小组织等)构成的微阵列，以实现对化合物 (包括药物)、蛋白质、核酸、细胞以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的筛选或检测。 微阵列生物芯片的主要特点包括(1)可在一个较小的固体基片上组装大量的(IO6-IOki 种)生物活性物质，获取的信息量大，效率高；(2)消耗的生物试剂少，可节约大量的试剂费 用，成本低；(3)采用了微细加工技术，可以通过提高集成度，降低单个芯片的制备成本，实 现大批量生产；(4)结合微机械加工技术(MEMS)，可把生物样品的预处理，提取，扩增， 反应，以及信息检测相集成，制备成微型、全自动化、无污染、可用于微量试样检测的高度集 成的智能化生物芯片。生物芯片在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序列分 析上有着极其重要的意义。进入21世纪后，人类基因组计划的完成对当代的生物学研究和医学研究产生了 巨大的影响。人们能够从基因水平上认识生命现象的差异，疾病发生、发展的规律，以及药 物与生命体的相互作用。就基因序列分析而言，后基因组时代的重点已由单个物种的全基 因组序列测定转移到了对某一物种在基因组DNA序列层次上个体遗传差异及物种间遗传 差异的比较。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接 寻找疾病的易感基因突变位点，通过对于某一特定疾病的大量基因组样本中突变基因型的 大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型的信息，实现个体化医学。如何实现个体 全基因组DNA序列的快速有效低成本测定，已是当今国际基因组科学及其应用所面临的重 要挑战之一，也是我国生命科学和医学发展面临的又一次重大机遇。国家科技部在2006年 启动的“十一五” 863 “生物芯片”重点项目中对低成本快速人类全基因组的测序技术和相 关仪器的研究进行了重点支持。在新一代高通量低成本DNA测序技术中，一项核心技术是将数百万甚至数十亿个 待测的DNA片段密集地固定在固体基底表面，构建测序芯片。本发明针对目前新一代基因 测序技术，提出一种新的用于高通量DNA测序的基因芯片及其制备方法。该基因芯片把微 流体技术和微珠DNA芯片相结合，可标准化和批量化生产，可对大量核酸分子序列进行连 续快速测定，试样和试剂消耗量小，操作简便易行。

发明内容
技术问题本发明的目的是提出一种用于核酸测序的微流体基因芯片，以提高核 酸测序的通量，减少测序试剂的用量，降低基因测序的成本。技术方案本发明的用于核酸测序的微流体基因芯片包括多个微流体通道组成的一组反应池，微流体基因芯片由两层固体基底紧密结合而成，上层固体基底为一固体材料 基板，其表面加工有微流体通道反应池凹槽以及流体输入和输出孔，下层固体基底为一透 明固体材料基片；在透明固体材料基片的内侧表面固定有微小固体颗粒阵列，微小固体颗 粒阵列通过化学键与下层透明固体材料基片相连接；微小固体颗粒阵列上固定有大量的核 酸分子。所述的固体材料基板的材料为玻璃、石英、金属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材 或尼龙之一，或由它们中的二种或多种组成的复合物。下层透明固体材料基片的材料为透明的玻璃、石英、有机聚合物材料之一，或由它 们中的二种或多种组成的复合物，且下层透明固体材料基片与上层的固体材料基板相对的
一面为一水平面。所述的微小固体颗粒阵列是微球形、微杆状、微长条状或由它们中的二种或多种 组成的混合状，排列方式是单层排列，或是分层混合排列。下层透明基片上固定的微小固体颗粒阵列可以是带有金壳的复合结构颗粒。微小固体颗粒阵列上固定的待测的核酸分子，是聚合酶链式反应的扩增产物，或 是滚环扩增产物，或其它任何形式的待测序列核酸分子。所述的核酸分子的末端修饰有氨基、羧基或链霉亲和素。所述的化学键为氨基、羧基、醛基或巯基。在应用时在下层透明基片的外部设有荧光检测器，荧光检测器为光电耦合器件 C⑶或互补性氧化金属半导体CMOS中的一种。经过微流体通道中的生化反应，可用多种光 学波长来检测微小颗粒上的核酸分子中某一特定位置的碱基，从而确定微小固体颗粒上的 核酸序列。在上层材料基底外侧，放置温度调控装置，采用加热电极、半导体温控器件、光学 加热、气流控温中的一种。有益效果本发明提出的用于核酸测序的微流体基因芯片具有以下的优点
1本微流体基因芯片的一个十分重要的特征为在微流体通道中进行生化反应，从而实 现反应速度加快，反应更加充分，反应效率大大提高。2本微流体基因芯片的另一个重要特征为采用微小固体颗粒作为核酸载体，先将 被测的核酸分子固定在固体载体上，然后将其固定在固体平板基底上，由于每个微小固体 颗粒上能够固定大量的核酸序列，使得测序信号的强度得到提高；并且由于微珠能够紧密 的排列，从而能够检测更多微珠上的核酸序列，使得微流体基因芯片的检测通量大大提高。3本微流体基因芯片的第三个重要的特征为采用微流体通道设计，使得基因测序 等过程中生化反应所需要的试剂量大大减少，从而大量降低了成本。4本微流体基因芯片的第四个重要的特征为多通道结构设计，使得各个核酸样本 能够实现物理隔离，避免了各个样本间的交叉污染。5本微流体基因芯片运用微细加工技术，可进行批量化生产，生产成本低。6本微流体基因芯片能够进行生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序 列分析等多个领域的应用。


图1是本发明提出的微流体基因芯片的剖面结构示意图。图2是本发明提出的微流体基因芯片的俯视结构示意图(图示为含有三个微反应 池通道的微流体基因芯片)。图3是本发明提出的微流体基因芯片的反应池内部的局部放大图。
具体实施例方式本发明提出了一种用于新一代测序技术的微流体基因芯片。该芯片采用的基本结 构为由两个平行的基板组合构成的由若干个平行的微流体通道组成的结构，在微流体通道 的内侧上基板的一面或二面上排列有密集的微珠阵列，每个微珠表面上固定有核酸片段。 每个微流体通道的两端开有输入和输出孔，供流体的流入与流出。上述多个微流体通道可 以通过外部的芯片固定装置，串联或者并联在一起。该芯片包括上下两层固体平板基板(图1)。固体基板材料可以是硅，玻璃、石英、金 属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材、尼龙等。其中至少一种材料应为透明的平板材料。上层基 板材料表面可加工有一定深度的微型沟槽，此沟槽可在上下两层基底材料紧密结合后形成 上述的封闭的微流体通道，沟槽的两端有流体的输入和输出孔(图2)。下层固体基板为透光 率非常高的透明材料，如玻璃，石英等。下层透明基底表面进行化学基团修饰，如氨基修饰， 醛基修饰，聚赖氨酸修饰等。在与上层基底相对的表面组合形成微流体通道后，通过化学键 的作用在通道内侧的基板上固定一层密集排列的微小固体颗粒阵列，每个微小固体颗粒上 固定有大量核酸序列(图3)。本芯片的微流体通道中可进行多种生化反应，从而实现基因测序，基因捕获，基因 筛选等各方面的应用。实施方案1
用硅片基板材料作为上层基底材料，在硅片上涂覆一层光敏感的材料，根据设计好的 微结构光掩模板，进行光学曝光，显影后在硅片基板上形成光敏感材料的凹凸结果。用湿法 腐蚀或干法腐蚀在硅片基板上制备出微流体的结构，如输入和输出孔、流体池等。玻璃作为 下层透明材料。上层硅片基底材料上的各种微结构制作完成之后，将其与下层透明玻璃之 间进行紧密键合。之后在流道中进行化学修饰，使玻璃表面生成各种化学基团。再将表面 连接有大量核酸分子的微小磁性颗粒灌注到微流道中，通过化学键将其牢牢固定在下层透 明玻璃表面。实施方案2
根据设计好的微结构，利用机械加工方法(如线切割加工，切削加工等工艺)，体硅加工 工艺，注塑加工工艺等或其他方法制备出相应的塑料或橡胶的精密模具。直接应用微铸造 技术，制备各种塑料或橡胶的微流体结构，如输入输出流道端口、流体池等。完成上层基底 材料的各种结构制备后，进行上下两层基底材料的封装，所用上层材料可为透明的或者不 透明的材料，下层材料为透明的材料，如玻璃、石英，高分子聚合物等。之后在流道中进行化 学修饰，使透明基底表面生成各种化学基团。再将表面连接有大量核酸分子的带有金壳的 微小固体颗粒灌注到微流道中，通过化学键将其牢牢固定在下层透明基底表面。实施方案3 上下两层玻璃平行基板，在平行基板之间放入间隔为20毫米、表面涂有硅胶的、直径 100微米的平行微细构件，在上下两层玻璃上加压加热，形成三层结构的微流体槽。在微流 体的两端用环氧树脂封闭，在每个流道的两端的一面玻璃板上各打一个孔，形成输入和输 出流道端口、流体池等。之后在流道中进行化学修饰，使透明基底表面生成各种化学基团。 再将连接有大量核酸分子的微小固体颗粒灌注到微流道中，通过化学键将其牢牢固定在上 下两层透明基底表面内侧。
权利要求
一种用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是该芯片包括多个微流体通道组成的一组反应池(1),微流体基因芯片由两层固体基底紧密结合而成，上层固体基底为一固体材料基板(2)，其表面加工有微流体通道反应池凹槽(3)以及流体输入和输出孔(4),下层固体基底为一透明固体材料基片(5)；在透明固体材料基片(5)的内侧表面固定有微小固体颗粒阵列(6)，微小固体颗粒阵列(6)通过化学键(7)与下层透明固体材料基片(5)相连接；微小固体颗粒阵列(6)上固定有大量的核酸分子(8)。
2.根据权利要求1所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是所述的固体材料 基板(2)的材料为玻璃、石英、金属、塑料、陶瓷、橡胶、凝胶、纸材或尼龙之一，或由它们中的 二种或多种组成的复合物。
3.根据权利要求1所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是下层透明固体材 料基片(5)的材料为透明的玻璃、石英、有机聚合物材料之一，或由它们中的二种或多种组 成的复合物，且下层透明固体材料基片(5)与上层的固体材料基板(2)相对的一面为一水 平面。
4.根据权利要求1所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是所述的微小固体 颗粒阵列(6)是微球形、微杆状、微长条状或由它们中的二种或多种组成的混合状，排列方 式是单层排列，或是分层混合排列。
5.根据权利要求1所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是下层透明基片上 固定的微小固体颗粒阵列(6)可以是带有金壳的复合结构颗粒。
6.根据权利要求1或5所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是微小固体颗 粒阵列(6)上固定的待测的核酸分子(8)，是聚合酶链式反应的扩增产物，或是滚环扩增产 物，或其它任何形式的待测序列核酸分子。
7.根据权利要求6所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征为所述的核酸分子 (8)的末端修饰有氨基、羧基或链霉亲和素。
8.根据权利要求1所述的用于核酸测序的微流体基因芯片，其特征是所述的化学键 (7)为氨基、羧基、醛基或巯基。
全文摘要
用于核酸测序的微流体基因芯片是一种用于核酸测序、基因捕获、基因筛选等领域的生物芯片。该芯片由多个微流体反应通道组成，通道表面具有微小颗粒6构成的DNA测序文库。微流体基因芯片由两层基板紧密结合在一起而形成，中间有微结构，组成通道式的流体反应池3，以及流体输入和输出孔4，下层基板为透明材料5，在与微流体反应池相对的下层材料表面有各种微小固体颗粒6，通过化学键与下层透明基底相连接。微小固体颗粒上固定有大量的核酸分子。经过微流体通道中的生化反应，可用光学检测手段来检测微小颗粒上的核酸分子的序列。
文档编号G01N21/64GK101948741SQ20101028822
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月21日 优先权日2010年9月21日
发明者吕华, 陆祖宏, 马晓冬 申请人:东南大学