专利名称：一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法
技术领域：
本发明涉及鱼卵发育过程的观测方法。
背景技术：
鲑科鱼类具有肉质细嫩、营养丰富、可食部分大、无肌间刺、易于加工等特点，最重要的是肌肉中蛋白含量高，并且含有大量的不饱和脂肪酸，因此目前已逐渐成为了我国乃至世界上重要的高品质蛋白质和营养物质的来源之一。随着我国经济的发展，人民日常生活水平不断提高，青、草、鲢、鳙等传统的鱼类品种以不能够完全满足人们的消费需要，因此我国鲑科鱼类等高品质蛋白质鱼类养殖业发展十分迅速。由于市场的需求加大，国家也加大了对鲑科鱼类的生理、生化和发育生物学等方面的研发力度。我国对于鱼类卵子发育过程的观测研究主要是从青、草、鲢、鳙等传统温水性鱼类开始的，由于这些鱼类卵子卵径小和卵膜薄，因此普遍采用显微镜下直接观测和手工绘图的方法。随着科技的进步，高科技产品的开发，在随后的研究中逐渐用数码相机拍照替代了手工绘图这样就极大的提高了研究的直观性和准确性。但随着我国虹鳟等鲑科鱼类的不断开发，也给鱼类卵子发育的研究带来了新的挑战，由于鲑科鱼类大部分都是冷水性鱼类其产的卵子主要由蛋白构成，具有卵径大、卵膜厚、显微镜无法直接观测特征。早期学者对鲑科鱼类鱼卵发育的研究主要有3种胰蛋白酶酶解透明处理方法、透明液处理方法和5%甲醛固定剥离卵膜显微镜下拍照的方法。以上3中方法虽然一定程度上实现了鲑科鱼卵发育过程的观测，但也均存在各自的不足，主要如下胰蛋白酶必须处理活体卵子，处理后因卵膜较薄，虽然可以透过卵膜观测到鱼卵具体的发育分期，但成本较高，需立即处理，时间相对紧张(处理不及时蛋白变性将无法观测)，操作难度也较大，卵膜极易破碎，卵膜反光性强，显微成像不清晰；透明液虽然可使卵膜变性且增加了透明度，但卵膜的厚度没有改变，细胞分裂期细节很难观测到，因此透明液只能作为大致确定发育时相的工具，但用于鱼卵发育的深入研究缺少准确性；5%甲醛固定剥离卵膜显微镜下拍照的方法，虽然具备了操作容易、固定后可随时观测的特性，但有甲醛固定鱼卵的胚体和卵黄蛋白均为白色，无颜色反差，因此在观测细胞分裂期时显微拍照的清晰度不够。

发明内容
本发明是要解决现有鲑科鱼卵发育过程的观测方法中存在细胞分裂期细节很难观测以及显微成像不清晰的问题而提出一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法。本发明中的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法按以下步骤进行一、前期准备首先准备观测所需工具，包括捞鱼网、规格为5ml的采样管、小镊子、解剖针、载玻片、带有拍照功能的解剖镜；然后配制鱼卵固定液，称取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动20mirT40min后，将烧杯口用封口膜封紧，放置于:TC飞。C的冰箱中，放置20tT28h后，用滤纸过滤并取上清液，量取350m广450ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入80mf 120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均匀后，装入不透明且带盖的容器中，放置于3°C飞。C的冰箱中备用；二、样品采集鲑科鱼类受精卵孵化水温为7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具体采样间隔如下受精后0tT3h内，每间隔15min采样一次；受精后3tT8h内，每30min采样一次；受精后8h 33h内，每间隔Ih米样一次；受精后33h 81h内，每间隔2h米样一次；受精后81h 129h内，每间隔6h米样一次；受精后129h 215h每间隔12h米样一次；受精后215h至破膜时，每间隔24h采样一次；样品采集过程首先在每个采样管上注明不同的标号和不同的发育期，然后向每个采样管中注入2mf4ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵15个 20个放入到装有鱼卵固定液的采样管中，摇晃lmirT3min后，将采样管放置于3°C飞。C的冰箱中，20tT28h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液，即完成鲑科鱼类受精卵的样品采集；三、发育观测从固定液中取出鱼卵放在载破片上，鱼卵的胚体朝上，用镊子夹住鱼卵，用解剖针轻轻剥掉卵膜，放在解剖镜下观测，并拍照，根据每个采样管上注明的不同标号和不同发育期，全程记录鲑科鱼类由受精后Oh至破膜时的整个发育过程。本发明包括以下优点1、本发明方法采用新配方制成鱼卵固定液，其有效期一般在I年左右，具备使用方便的特点；2、使用本发明方法中的鱼卵固定液后，鱼卵上的膜易于剥离，有利于进行观测；3、本发明方法采用了新配方制成的鱼卵固定液，其具有将鱼卵的胚体染成橙黄色的作用，极大的克服了采用甲醛方法的弊端，使观测鲑科鱼类受精卵的发育过程变得更便捷、更直观和更准确。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式中的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法按以下步骤进行一、前期准备首先准备观测所需工具，包括捞鱼网、规格为5ml的采样管、小镊子、解剖针、载玻片、带有拍照功能的解剖镜；然后配制鱼卵固定液，称取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动20mirT40min后，将烧杯口用封口膜封紧，放置于:TC飞。C的冰箱中，放置20tT28h后，用滤纸过滤并取上清液，量取350m广450ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入80m广120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均匀后，装入不透明且带盖的容器中，放置于3°C飞。C的冰箱中备用；二、样品采集鲑科鱼类受精卵孵化水温为7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具体采样间隔如下受精后0tT3h内，每间隔15min采样一次；受精后3tT8h内，每30min采样一次；受精后8h 33h内，每间隔Ih米样一次；受精后33h 81h内，每间隔2h米样一次；受精后81h 129h内，每间隔6h米样一次；受精后129h 215h每间隔12h米样一次；受精后215h至破膜时，每间隔24h采样一次；样品采集过程首先在每个采样管上注明不同的标号和不同的发育期，然后向每个采样管中注入2mf4ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵15个 20个放入到装有鱼卵固定液的采样管中，摇晃lmirT3min后，将采样管放置于3°C飞。C的冰箱中，20tT28h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液，即完成鲑科鱼类受精卵的样品采集；三、发育观测:从固定液中取出鱼卵放在载破片上，鱼卵的胚体朝上，用镊子夹住鱼卵，用解剖针轻轻剥掉卵膜，放在解剖镜下观测，并拍照，根据每个采样管上注明的不同标号和不同发育期，全程记录鲑科鱼类由受精后Oh至破膜时的整个发育过程。本发明包括以下优点:1、本发明方法采用新配方制成鱼卵固定液，其有效期一般在I年左右，具备使用方便的特点；2、使用本发明方法中的鱼卵固定液后，鱼卵上的卵膜易于剥离，有利于进行观测；3、本发明方法采用了新配方制·成的鱼卵固定液，其具有将鱼卵的胚体染成橙黄色的作用，极大的克服了采用甲醛方法的弊端，使观测鲑科鱼类受精卵的发育过程变得更便捷、更直观和更准确。
具体实施方式
二:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中称取25g 45g的苦味酸放入盛有450ml 550ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动25mirT35min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中称取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动30min。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四:本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤一中将烧杯口用封口膜封紧，放置于4°C的冰箱中，放置24h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
五:本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一中量取380ml 420ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入90m广IlOml甲醛和18mf22ml冰醋酸，混合均匀。其它步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六:本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤一中量取400ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入IOOml甲醛和20ml冰醋酸，混合均匀。其它步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
七:本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二中向每个采样管中注入2.5πιΓ3.5ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵16 18个放入到装有鱼卵固定液的采样管中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八:本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二中向每个采样管中注入3ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵17个放入到装有鱼卵固定液的采样管中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
九:本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤二中将采样管放置于3.5°C 4.5°C的冰箱中，22tT26h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液。其它步骤及参数与具体实施方式
一至八之一相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至八之一不同的是步骤二中将采样管放置于4°C的冰箱中，24h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液。其它步骤及参数与具体实施方式
一至八之一相同。为了验证本发明的有益效果，进行了以下实验实验一一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法按以下步骤进行一、前期准备首先准备观测所需工具，包括捞鱼网、规格为5ml的采样管、小镊子、解剖针、载玻片、带有拍照功能的解剖镜；然后配制鱼卵固定液，称取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸懼水的烧杯中,用玻璃棒反复搅动30min后,将烧杯口用封口膜封紧,放置于40C的冰箱中，放置24h后，用滤纸过滤并取上清液，量取400ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入IOOmf 120ml甲醛和20ml冰醋酸，混合均匀后，装入不透明且带盖的容器中，放置于4°C的冰箱中备用；二、样品采集本实验中鲑科鱼类采用鲑鱼，其受精卵孵化水温为7V、°C，需要18cT22d才能孵化破膜，具体采样间隔如下受精后Ohlh内，每间隔15min采样一次；受精后3tT8h内，每30min采样一次；受精后8tT33h内，每间隔Ih采样一次；受精后33tT81h内，每间隔2h米样一次；受精后81h 129h内，每间隔6h米样一次；受精后129h 215h每间隔12h采样一次；受精后215h至破膜时，每间隔24h采样一次；样品采集过程首先在每个采样管上注明不同的标号和不同的发育期，然后向每个采样管中注入3ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵17个 18个放入到装有鱼卵固定液的采样管中，摇晃2min后，将采样管放置于4°C的冰箱中，24h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液，即完成鲑鱼受精卵的样品采集；三、发育观测从固定液中取出鱼卵放在载破片上，鱼卵的胚体朝上，用镊子夹住鱼卵，用解剖针轻轻剥掉卵膜，放在解剖镜下观测，并拍照，根据每个采样管上注明的不同标号和不同发育期，全程记录鲑鱼由受精后Oh至破膜时的整个发育过程。本实验中采用了新配方制成的鱼卵固定液，其具有将鱼卵的胚体染成橙黄色的作用，极大的克服了采用甲醛方法的弊端，使观测鲑鱼受精卵的发育过程变得更便捷、更直观和更准确。
权利要求
1.一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于它是通过以下步骤实现的: 一、前期准备:首先准备观测所需工具，包括:捞鱼网、规格为5ml的采样管、小镊子、解剖针、载玻片、带有拍照功能的解剖镜；然后配制鱼卵固定液，称取20g 50g的苦味酸放入盛有400ml 600ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动20mirT40min后，将烧杯口用封口膜封紧，放置于:3℃~5℃的冰箱中，放置20tT28h后，用滤纸过滤并取上清液，量取350m广450ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入80m广120ml甲醛和16mf24ml冰醋酸，混合均匀后，装入不透明且带盖的容器中，放置于3°C~5℃的冰箱中备用； 二、样品采集:鲑科鱼类受精卵孵化水温为7℃~9℃，需要18cT22d才能孵化破膜，具体米样间隔如下:受精后Oh 3h内，每间隔15min米样一次；受精后3h 8h内，每30min米样一次；受精后8tT33h内，每间隔Ih采样一次；受精后33tT81h内，每间隔此采样一次；受精后81h 129h内，每间隔6h米样一次；受精后129h 215h每间隔12h米样一次；受精后215h至破膜时，每间隔24h采样一次；样品采集过程:首先在每个采样管上注明不同的标号和不同的发育期，然后向每个采样管中注入2mf4ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵15个 20个放入到装有鱼卵固定液的采样管中，摇晃lmirT3min后，将采样管放置于3℃~5℃的冰箱中，20tT28h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液，即完成鲑科鱼类受精卵的样品采集； 三、发育观测:从固定液中取出鱼卵放在载破片上，鱼卵的胚体朝上，用镊子夹住鱼卵，用解剖针轻轻剥掉卵膜，放在解剖镜下观测，并拍照，根据每个采样管上注明的不同标号和不同发育期，全程记录鲑科鱼类由受精后OtT破膜时的整个发育过程。
2.如权利要求1所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤一中称取25g 45g的苦味酸放入盛有450ml 550ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动25min 35min。
3.如权利要求1所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤一中称取35g的苦味酸放入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，用玻璃棒反复搅动30min。
4.如权利要求1至3中任一项所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤一中将烧杯口用封口膜封紧，放置于4°C的冰箱中，放置24h。
5.如权利要求1所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤一中量取380ml 420ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入90m广IlOml甲醛和18mf 22ml冰醋酸，混合均匀。
6.如权利要求1所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤一中量取400ml此上清液放入另一个烧杯中，并向此烧杯中加入IOOml甲醛和20ml冰醋酸，混合均匀。
7.如权利要求1、2、3、5和6中任一项所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤二中向每个采样管中注入2.5πιΓ3.5ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵16 18个放入到装有鱼卵固定液的采样管中。
8.如权利要求1、2、3、5和6中任一项所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，其特征在于步骤二中向每个采样管中注入3ml步骤一中配制的鱼卵固定液，每次采样时取受精卵17个放入到装有鱼卵固定液的采样管中。
9.如权利要求7所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，特征在于步骤二中将采样管放置于3.5°C 4.5°C的冰箱中，22tT26h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液。
10.如权利要求7所述的一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，特征在于步骤二中将采样管放置于4°C的冰 箱中，24h后将采集的受精卵更换一次等量的步骤一中配制的鱼卵固定液。
全文摘要
一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法，它涉及鱼卵发育过程的观测方法，本发明要解决现有鲑科鱼卵发育过程的观测方法中存在细胞分裂期细节很难观测以及显微成像不清晰的问题。本发明中一种鲑科鱼卵发育过程的观测方法按以下步骤进行一、前期准备然后配制鱼卵固定液并放置于冰箱中保存；二、样品采集采集鲑科鱼类受精卵放入到装有鱼卵固定液的采样管中并放置于冰箱中保存；三、发育观测从固定液中取出鱼卵放在载破片上，用解剖针轻轻剥掉卵膜，放在解剖镜下观测，并拍照，根据每个采样管上注明的不同标号和不同发育期，全程记录鲑科鱼类由受精后0h至破膜时的整个发育过程。本发明适用于鲑科鱼类受精卵发育过程的观测和研究应用领域。
文档编号G01N21/00GK103076283SQ20131001752
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者张永泉, 尹家胜, 张玉勇 申请人:中国水产科学研究院黑龙江水产研究所