专利名称：二氧化碳含量测定方法及二氧化碳诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶法测定二氧化碳含量的方法，以及应用该方法配制而成的二氧化碳诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
血液PH值恒定是维持生命活动必不可少的条件。血浆中有多种缓冲系统，以碳酸氢盐缓冲系统最为重要，直接影响血液的PH值。正如大家所熟知，碳酸氢根HCO3′-与二氧化碳CO2之间有比较强烈的对应平衡关系，因此，血液中CO2含量对人体内部酸碱平衡调节起着重要作用。血液中CO2含量变化主要反映代谢性酸碱平衡紊乱单纯性代谢性酸或碱中毒是血液中HCO3-的浓度下降或升高，总CO2含量也随之下降或升高；单纯性呼吸性酸或碱中毒与上述情形正好相反。
现有技术中，总二氧化碳或碳酸氢根的测定方法较多，可分为直接测定和间接推算两大类。直接测定主要有量气法、量压法、滴定法、比色法、Conway微量扩散法、流动注射气体扩散法、酶法等；间接推算是利用血气分析仪测得的PH与PCO2，根据以下H-H方程变换形式计算获得。
HCO3-(mmol/l)＝0.03×PCO2(mmHg)×antilog(PH-p ka)或HCO3-(mmol/l)＝0.225×PCO2(kPa)×antilog(PH-p Ka)式中PH为37℃时测得值，p ka在37℃为6.10。
目前，以间接推算法应用较普遍，由血液分析仪的微处理计算机并与血气分析结果一起报告，准确性可以符合临床要求。直接法以滴定法应用最广泛，但由于受多种因素影响，测定误差较大。
近年来，酶法检测技术得到长足发展。该方法以其特异性高、稳定性好、检测速度快、结果准确可靠等优点而受到普遍欢迎。与检测其它物质类似，酶法检测血清、血浆等各种样品中二氧化碳含量的技术，已经成为人们研究的一个方向。

发明内容
本发明的目的是提供一种酶法测定二氧化碳含量的方法，以及应用该方法配制而成的二氧化碳诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪进行二氧化碳含量测定，而且测定速度快、准确度高，为丰富和发展二氧化碳检测手段提供技术支撑，以期在临床和分析测试领域推广酶法测定二氧化碳含量技术。
为实现本发明的第一个目的，一种测定二氧化碳含量的方法，采用以下步骤进行首先，将需要测定的样品与含有丙酮酸、苹果酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，进而测算出样品中二氧化碳的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
为实现本发明第二个目的——二氧化碳含量诊断试剂盒，可以按以下成分和用量配制成单剂缓冲液 40～200mmol/l，丙酮酸 1～50mmol/l，还原型辅酶 0.15～0.3mmol/l，苹果酸脱氢酶500～50000U/l，
稳定剂/试剂总体积 10～80％。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源污染，比如 双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I中的丙酮酸和还原型辅酶可以放在试剂II；试剂II中的苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源污染，还有利于试剂更稳定

与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的丙酮酸可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的苹果酸脱氢酶也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
本发明测定二氧化碳含量的诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但缓冲液的选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
上述诊断试剂盒的成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液 80～120mmol/l，丙酮酸 5～20mmol/l，还原型辅酶 0.2～0.3mmol/l，苹果酸脱氢酶 6000～12000U/l，稳定剂/试剂总体积 20～50％。
本发明直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和丙酮酸经苹果酸脱氢酶(EC1.1.1.38或EC 1.1.1.39或EC 1.1.1.40或EC 1.1.1.83之一)脱羧作用后产生苹果酸，并将还原型辅酶氧化为氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中二氧化碳的含量成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的下降速度，便能很好地反映出样品中二氧化碳的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，定量反映出被测样品中二氧化碳的含量，测试结果准确；(2)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；
(3)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(4)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用；(5)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，用于测定各种样品中二氧化碳的含量；(6)本发明提供的液态二氧化碳含量诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各成分的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。配成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，丙酮酸 5mmol/l，thio-NADH0.2mmol/l，苹果酸脱氢酶 6000U/l，乙二醇 50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)。
加入样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，丙酮酸 13mmol/l，NADPH0.25mmol/l，甘油 20mmol/l；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，苹果酸脱氢酶 9000U/l，乙二醇 50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒试剂I——三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，thio-NADPH 0.3mmol/l，
丙二醇 20mmol/l；试剂II——三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，丙酮酸 20mmol/l，丙二醇 20mmol/l；试剂III——三乙醇胺缓冲液 120mmol/l，苹果酸脱氢酶 12000U/l，乙二醇 50％(占试剂III总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例四(双剂优选例)按以下成分和用量配制二氧化碳诊断试剂盒试剂I——Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，NADH 0.3mmol/l，甘油 20mmol/l；试剂II——Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，
丙酮酸 20mmol/l，苹果酸脱氢酶 6000U/l，甘油 50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测二氧化碳样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出样品中二氧化碳的含量，进而推知样品中碳酸氢根浓度。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出样品中二氧化碳含量，进而推知碳酸氢根浓度，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的二氧化碳诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍能准确检测各种类型样品中的二氧化碳含量。
权利要求
1.一种测定二氧化碳含量的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有丙酮酸、苹果酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出样品中二氧化碳的含量。
2.根据权利要求1所述的测定二氧化碳含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的测定二氧化碳含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
4.一种二氧化碳诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，丙酮酸 1～50mmol/l，还原型辅酶 0.15～0.3mmol/l，苹果酸脱氢酶500～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
5.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
9.根据权利要求4～8所述的任意一种二氧化碳诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
全文摘要
本发明涉及二氧化碳含量的测定方法及其诊断试剂盒。发明直接应用二氧化碳(碳酸氢根)和丙酮酸经苹果酸脱氢酶脱羧作用后产生苹果酸，并将还原型辅酶氧化为氧化型辅酶，测定主波长340nm吸光度下降速度便能定量反映样品中二氧化碳含量，进而推知碳酸氢根浓度。该方法特异性高，不受内、外源污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1786694SQ20041006618
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司