专利名称：一种检测恩诺沙星的光激化学发光免疫分析法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
一种检测恩诺沙星(ENR)的试剂盒及其检测方法，属于光激化学发光免疫分析 (LICLIA)技术领域，用于对鱼、肉及其制品中ENR含量的检测。
背景技术：
恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)，又名恩氟喹林羧酸，为一类人工合成的新型的抗菌 药物，和其代谢物环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)是20世纪80年代以来出现的抗菌谱更广、 抗菌作用更强的第三代氟喹诺酮类药物(FQNs)之一。该类药物在细菌体内通过抑制拓扑异 构酶II和拓扑异构酶IV来抑制DNA的复制而起到杀灭细菌作用，在医学和兽医学中很快取得 广泛应用。但长期用药所产生的不良反应、在畜禽产品中的残留、耐药性的增加以及在环境中 的生态效应等方面已引起广泛关注。2003年初，日本在我国出口烤鳗中检出恩诺沙星，并利 用其食品卫生法中“动物源性食品中不得含有合成抗生素”的规定，使我国出口烤鳗受阻。因 此，我国及日本从2003年起加强了出口日本鳗鱼及其制品恩诺沙星残留检测。目前对于恩诺沙星的检测多采用高效液相色谱法(HPLC)或液相色谱_质谱联用 法(LC-MS)等理化检测方法，但这些方法所需设备昂贵、操作繁琐且灵敏度有限。近年来关 于免疫分析的方法也有报道，应用最广的为酶联免疫法，但由于酶联免疫法检测范围有限， 且标记物酶易失活，底物见光易分解，受环境影响较大，一定程度上限制了它的应用。光激化学发光免疫分析(LICLIA)是以纳米级高分子微粒为基础的新一代化学发 光技术，该项技术将被广泛地应用于研究生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产 生的均相化学发光技术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。LICLIA 试剂由含有感光化合物的感光微粒和含有发光化合物的发光微粒组成，微粒直径约188nm， 表面覆盖多糖水凝胶。水凝胶能减少非特异性结合，同时，增加微粒的悬浮性。微粒通过水 凝胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微粒大大增加了反应的表面积，每个微粒 的表面包被着成百上千个生物分子，可捕获目标分子。LICLIA技术的核心原理是单线态氧的产生和传递。在受到红色激光(680nm)照 射后，感光微粒能使周围环境中的氧转化为单线态氧，单线态氧的生存时间仅为4微秒。短 暂的生存时间决定了单线态氧的传播直径很小(约为200nm)。如果发光微粒在200nm直 径范围之内，就能接受单线态氧，发出高能级的光(520nm-620nm)从而产生信号。相反，如 果在200nm直径范围内没有发光微粒，单线态氧就会回落到基态氧而没有信号产生。这种 依赖于两种微粒相互接近的化学能量传递是LICLIA均相反应的基础。通常在该反应体系 中，微粒的浓度是很低的。两种微粒相互随机碰撞的几率很低，因此，反应体系的本底非常 微弱。但通过包被在微粒表面的生物分子相互作用拉近两个微粒的距离，例如形成免疫夹 心复合物，就能产生能量的有效传递并发出光信号。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测ENR的试剂盒及其检测方法，用于对鱼、肉及其制品中ENR含量的检测。本发明的技术方案一种检测恩诺沙星ENR的光激化学发光免疫分析试剂盒，由 白色不透明微孔板(1)，恩诺沙星标准(2)，连接恩诺沙星人工抗原的发光微粒(3)，兔抗恩 诺沙星抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)，和包被有链霉亲和素的感光微粒 (6)组成。包被有ENR-OVA的发光微粒(3)的制备在离心管中加入Img发光微粒，加入 12. 5 μ L 1% Tween-20,0. 05mg ENR-OVA 人工抗原，10 μ L 的 25mg/mL 硼氢化氰钠溶液，用 0. 1M、ρΗ6· 0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补充到200 μ L，37°C避光振荡反应48小 时，加入 ομ L 0. 3Μ、ρΗ 5. 0的羧甲氧基胺半盐酸盐溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1 小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包被有ENR-OVA的发光微粒，稀释后备用。ENR 标准品(2)的配制ENR 标准品浓度分别为0ng/mL，0. Ing/mL，Ing/mL，IOng/ mL, 50ng/mL, lOOng/mL,从ENR纯品中稀释得到，稀释液为蒸馏水。用所述的试剂盒检测ENR的方法取包被有ENR-OVA的发光微粒加入到白色不透 明微孔板；加入ENR标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后各孔顺序加入兔抗ENR抗 体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着暗处加入包被有链霉亲和素的感光微粒 进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的ENR含量。 所述的检测ENR的方法，操作为取20 μ L包被有ENR-OVA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20 μ L的ENR 标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20μ L兔抗ENR抗体；继续加入20 μ L生物素化羊 抗兔抗体，37°C孵育15分钟；暗处加175 μ L包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育 15分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的ENR含量。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。


图1 检测恩诺沙星的试剂盒示意图。1、白色不透明微孔板，2、ENR标准，3、连接 ENR-OVA的发光微粒，4、兔抗恩诺沙星抗体冻干品，5、生物素化羊抗兔抗体冻干品，6、包被 有链霉亲和素的感光微粒。图 2 :ENR-LICLIA 反应示意图。图 3 :ENR_LICLIA 标准曲线图。
具体实施例方式实施例1制备试剂盒和检测鳗鱼样品包被有ENR-OVA人工抗原的发光微粒制备在离心管中加入Img 发光微粒，加入 12. 5μ L 1% Tween-20,0. 05mg ENR-OVA Λ 工抗原，10 μ L的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用0. 1M、ρΗ6· O的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES) 缓冲液将体积补充到200 μ L，37°C避光振荡反应48小时。加入10 μ L 0. 3ΜρΗ 5. 0的羧甲 氧基胺半盐酸盐(CMO)溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时后离心，分离得到已连接 ENR-OVA的发光微粒，稀释后备用。
试剂的配制标准 ENR 试剂的配制标准 ENR :0ng/mL，0. Ing/mL，Ing/mL，10ng/mL, 50ng/mL, lOOng/mL,从ENR纯品中稀释得到，稀释液为蒸馏水。试剂盒的组成(1)、白色不透明微孔板(12条X8孔，可以拆分为单孔)。(2)、1 X包被有ENR-OVA人工抗原的发光微粒2mL。(3)、6 XENR 标准液，1. OmL/ 瓶，ENR 标准液浓度为:0，0· 1，1，10，50，100ng/mL。(4)、1 X ENR抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。(5)、1X生物素化羊抗兔抗体冻干品，用时2mL蒸馏水溶解。(6)、1 X包被有链霉亲和素的感光微粒20mL。测定时注意事项1、使用之前将所有试剂回升至室温(18-30°C )。2、使用之后立即将所有试剂放回2_8°C。3、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔。具体检测步骤如下称取4g±0. 04g鳗鱼试样置于50mL离心管中，加乙 腈-0. lmol/L 氢氧化钠溶液(84+16，v/v) 12mL,振荡混合 5min, 4000r/min 离心 5min ；移 取上清液6mL于50mL离心管中，加0. 02mol/L磷酸盐缓冲液6mL，再加二氯甲烷7mL，震荡 5min,4000r/min离心5min，取下层有机相6mL于IOmL试管中，于50°C水浴下氮气吹干；加 0. 02mol/L磷酸盐缓冲液0. 5mL,涡动混勻2min，加正己烷lmL，涡动混勻30s，4000r/min离 心5min ；取下层清液50 μ L分析。取20 μ L包被有ENR-OVA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20 μ L的ENR 标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20 μ L ENR抗体；继续加入20 μ L生物素化羊抗 兔抗体，37°C孵育15分钟；暗处加175 μ L包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育15 分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的ENR含量。结果见 表1，由标准曲线求得该例样品所含ENR浓度为0. 13ng/mL。表 1 实施例2鸡肉样品测定试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测鸡肉样品。具体检测步骤如下称取3g±0. 03g鸡肉试样于50mL离心管中，加乙腈-0. Imol/ L氢氧化钠溶液(84+16，v/v)9mL，振荡混合lOmin，4000r/min离心IOmin ；移取上清液4mL 于50mL离心管中，加0. 02ml/L磷酸盐缓冲液4mL，再加二氯甲烷8mL，振荡lOmin，4000r/ min离心lOmin，取下层有机相6mL于IOmL试管中，于50°C水浴下氮气吹干；加0. 02ml/L磷 酸盐缓冲液0. 5mL,涡动2min溶解残留物，加正己烷lmL，涡动2min，4000r/min离心5min ；取下层清液50 μ L分析。取20 μ L包被有ENR-OVA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20 μ L的ENR 标准或处理好的样品到各自的微孔中；加20 μ L ENR抗体；继续加入20 μ L生物素化羊抗 兔抗体，37°C孵育15分钟；暗处加175 μ L包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育15 分钟后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算样品中的ENR含量。结果见 表2，由标准曲线求得该例样品所含ENR浓度为0. 062ng/mL。表权利要求
一种检测恩诺沙星ENR的光激化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于由白色不透明微孔板(1)，恩诺沙星标准品(2)，包被有ENR OVA的发光微粒(3)，兔抗ENR抗体冻干品(4)，生物素化羊抗兔抗体冻干品(5)，和包被有链霉亲和素的感光微粒(6)组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包被有ENR-OVA的发光微粒(3)的制 备在离心管中加入Img发光微粒，加入12. 5μ L 1% Tween-20,0. 05mgENR_0VA人工抗原， 10 μ L的25mg/mL硼氢化氰钠溶液，用0. 1Μ、ρΗ6. 0的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液将体积补 充到200 μ L，37°C避光振荡反应48小时，加入10 μ L 0. 3Μ、ρΗ 5. 0的羧甲氧基胺半盐酸盐 溶液封闭未结合位点，37°C避光孵育1小时，离心纯化，洗去未反应的试剂后，分离得到包 被有ENR-OVA的发光微粒，稀释后备用。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于ENR标准品(2)的配制ENR标准品浓度 分别为0ng/mL，0. Ing/mL, Ing/mL, 10ng/mL, 50ng/mL, lOOng/mL,从 ENR 纯品中稀释得到， 稀释液为蒸馏水。
4.一种用权利要求1所述的试剂盒检测ENR的方法，其特征在于取包被有ENR-OVA的 发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入ENR标准或处理好的样品到各自的微孔中，然后 各孔顺序加入兔抗ENR抗体、生物素化羊抗兔抗体进行标记免疫反应；接着暗处加入包被 有链霉亲和素的感光微粒进行反应，反应后检测光信号，对照标准曲线计算被测样品中的 ENR含量。
5.根据权利要求4所述的检测ENR的方法，其特征在于操作为取20 μ L包被有ENR-OVA的发光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20 μ L的ENR标 准或处理好的样品到各自的微孔中；加20 μ L兔抗ENR抗体；继续加入20 μ L生物素化羊抗 兔抗体，37°C孵育15分钟；暗处加175 μ L包被有链霉亲和素的感光微粒，37°C暗处孵育15 分钟，反应后在光激化学发光检测仪上检测光信号，从标准曲线计算被测样品中的ENR含 量。
全文摘要
一种检测恩诺沙星的光激化学发光免疫分析法及其试剂盒，属于光激化学发光免疫分析(LICLIA)技术领域。本发明试剂盒，测定基础是均相标记免疫反应。首先由包被有ENR-OVA的发光微粒加入微孔板，然后顺序加入ENR标准或样品、兔抗ENR抗体、生物素化羊抗兔抗体避光反应，再加入包被有链霉亲和素的感光微粒孵育后检测。发光微粒上的ENR-OVA与ENR竞争连接到ENR抗体，再与生物素化羊抗兔抗体及包被有链霉亲和素的感光微粒形成复合体，光激发下，通过单线态离子氧的产生和传递，将能量传递给发光微粒产生荧光，用光激化学发光检测仪检测光信号，光信号强度与样品中ENR浓度成反比，对照标准曲线测得样品中ENR的含量。该检测ENR试剂盒结构简单，操作简便、检测时间短、灵敏度高。
文档编号G01N33/531GK101893621SQ201010230789
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月14日 优先权日2010年7月14日
发明者周彬, 张珏, 张艺, 赵莉莉, 金坚, 陈蕴, 黄飚 申请人:江苏省原子医学研究所