专利名称：一种以TiO₂为载体的固定酶电极的制备方法
技术领域：
本发明涉及用于生物燃料电池和电化学生物传感器的以无机材料为载体固定酶电极的制备方法，属于材料科学技术领域。
背景技术：
酶是一种具有生物活性的蛋白质，基于酶氧化还原活性中心与电极之间的电子传递，在电化学生物传感器中起着关键性的作用，研究酶在载体修饰电极上直接电子转移，不 仅对于探索生命体内的生理作用机理等理论研究具有重要意义，而且能为制备基于酶直接 电化学行为的第三代生物传感器、开发生物燃料电池和生物芯片奠定技术基础，具有重要 的理论价值和良好的应用前景。生物技术与纳米技术有机结合所形成的纳米生物技术，为第三代电化学生物传感 器的构建提供了一条崭新的途径。纳米材料具有巨大的表面积，在生物燃料电池中用于固 定酶或微生物都具有很大的开发潜力。在这些材料中TiO2具有生物相容性、稳定性、环境友 好等优点，广泛应用于催化剂载体、半导体、太阳能转化材料、光催化剂、气体传感器、电容 器和锂离子电池材料等。TiO2的性能优劣在很大程度上取决于其晶体结构、形貌和颗粒的 大小。近来，研究表明纳米结构的TiO2能显著提高材料的比表面积，从而表现出比一般粉体 优良的性能。研究证明以TiO2作为电极修饰材料应用于生物传感器可以提高酶的催化性 能。Yibing Xie 等人(Biosensors and Bioelectronics 2007，22，2812-2818)利用阳极氧 化方法制备TiO2纳米管，通过修饰吡咯固定葡萄糖氧化酶(GOD)，具有很好的电化学性能。 Huimin Cao 等人(Electroana lysis 2008，20，2223—2228)利用三维大孔TiO2 固定GOD 并 用用于葡萄糖传感器中。Shu-Juan Bao 等人(Adv. Funct. Mater. 2008，18，591-599)以 CNT 作为模板，通过简单的水热合成方法，制备了一种新型的、疏松的、单一孔径的TiO2材料，并 应用于蛋白质固定及传感器。改进提高电极上载体的合成方法，稳定、有效固定酶是研究的GOD的直接电化学 反应的关键之一，我们发现过氧化氢酶(CAT)可以引发合成二氧化钛，在室温、常压、接近 中性条件下通过将CAT加入氨水调节的pH为4的硫酸钛水溶液中，利用CAT与溶液间相互 作用引发合成Ti02。在合成TiO2的实验过程中，将GOD加入反应体系，达到载体制备与酶 的固定一步完成的目的。该方法为载体制备和酶的固定提供了新的思路。

发明内容
发明的目的是达到载体制备与酶的固定一步完成的目的，而提出一种可用于生物 燃料电池和电化学生物传感器的以无机材料为载体固定酶电极的新制备方法，本发明的固 定酶电极具有良好的电化学性能。本发明提供的一种以介孔TiO2为载体的固定酶电极的制备方法，其特征在于，载 体材料的合成与酶的固定一步完成，包括以下各步骤第一、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4，葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化氢酶(CAT)按照质量比为1-3 1加入到上述溶液，使GOD质量浓度为 0. 1-0. 3%，搅拌溶解，在室温下静置1周，将上述样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得 到G0D/Ti02 (CAT)粉末样品；第二、将GC (玻碳电极)用0. 3和0. 05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏 水和无水乙醇超声清洗，干燥；第三、配制G0D/Ti02 (CAT)的浓度为10g/L的PBS悬浊液(PBS为0. IM的pH为7 的磷酸盐缓冲溶液)，再加入3%的壳聚糖溶液，其中壳聚糖溶液与上述PBS悬浊液的体积 比为1 500，用微量进样器将上述悬浊液滴加到处理好的GC电极表面，使得63. 7 μ L悬浊 液/cm2电极，再滴加质量浓度0. 的全氟磺酸溶液，所用全氟磺酸溶液与滴到电极上的悬 浊液体积比为1 4，室温自然干燥，得到以TiO2为载体的固定酶电极。本发明制得的以碳电极为基底无机TiO2为载体的酶电极的性能评价采用三电极 体系，进行循环伏安扫描测试，数据由美国普林斯顿公司的恒电流电位仪PotentiOStat/ Galvanostat model 2273A记录。工作电极直接采用无机TiO2为载体的酶电极，参比电极 为标准氢电极(NHE)，对电极为钼电极。通过对比在有无底物葡萄糖的PBS溶液中电极的循 环伏安曲线的变化来评价固定酶的性能，测试结果(见图3、图6)表明无机TiO2为载体的 酶电极保持了 GOD活性，对葡萄糖有较好催化性能。


图1实施例1与各对比例中步骤1)所得样品的X射线衍射图；a 实施例1 ；b 对比例1 ；c 对比例2 ；d 对比例3图2是实施例1中步骤1)所得样品的透射电镜图；图3是实施例1与各对比例的循环伏安测试图；a 实施1 ；b 对比例1 ；c 对比例2 ；d 对比例3图4是实施例2的循环伏安曲线测试图；a :50mv/s ；b :100mv/s ；c :150mv/s ；d :200mv/s ；e :250mv/s ；f ；300mv/s图5是实施例3的循环伏安曲线测试图；a :pH = 6 ；b :pH = 6· 5 ;c :pH = 7 ;d :pH = 7. 5图6是实施例4中有无葡萄糖的磷酸盐缓冲溶液中的循环伏安测试图；a 0. IM pH = 7 的 PBS 溶液；b 0. IM pH = 7 的 PBS 溶液中加入 20mM 葡萄糖。
具体实施例方式实施例11)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4，GOD和CAT按照质 量比为1 1加入到上述溶液，使GOD浓度为0.1%，搅拌溶解，在室温下静置1周；将上述 样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到G0D/Ti02(CAT)粉末样品；从图Ia可见样品的 XRD结果对应于锐钛矿相TiO2,图2中可以看出样品G0D/Ti02 (CAT)具有高度有序的孔道结 构，它们是由许多球状的介孔笼通过窗口相互连接排列而成的。从样品的边缘可以直接观 察到TiO2 (CAT)的介孔笼。2)、将电极面积为0. 1256cm2GC电极用0. 3和0. 05 μ m的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥；3)、配制 10g/L 的 G0D/Ti02 (CAT) PBS 悬浊液 ImL (PBS 为 0. IM 的 pH 为 7 的磷磷酸 盐缓冲溶液)，再加入2 μ L3%的壳聚糖溶液；用微量进样器将上述悬浮液8 -滴加到处理 好的GC电极表面，再滴加质量浓度0. 1 %全氟磺酸溶液2 μ L，室温自然干燥，得到以TiO2为 载体的固定酶电极，其透射电镜图见图2。4)、将上述所制备的电极在PH为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的扫速 进行循环伏安测试。从图3a可以看出，G0D/Ti02(CAT)电极的循环伏安曲线中出现一对氧 化还原峰。实施例2
1)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4. 0，GOD和CAT按照 质量比为2 1加入到上述溶液，使GOD浓度为0.2%，搅拌溶解，在室温下静置1周。将上 述样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到G0D/Ti02(CAT)粉末样品；2)、3)、同实施例 14)、将上述所制备的电极在PH为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以扫描速度分别为 50、100、150、200、250、300mv/S进行循环伏安测试。从图4可以看出氧化还原峰电位不随 扫描速度的改变而改变，峰电流随扫描速度的增大而增大。根据扫描速率与峰位差的关系， 计算出G0D/Ti02(CAT)/GC电极的电子转移速率常数Ks约为3. 9s—1。较高的电子转移速率 显示了 G0D/Ti02(CAT)/GC电极上固定的GOD具有较快的电子传递过程，说明TiO2 (CAT)/GC 电极表面的微环境更有利于GOD的直接电子转移。实施例31)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4. O。GOD和CAT按照 质量比为3 1加入到上述溶液，使GOD浓度为0.3%，搅拌溶解，在室温下静置1周。将上 述样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到G0D/Ti02(CAT)粉末样品；2)、3)、同实施例 14)、将上述所制备的电极在pH分别为6、6. 5、7、7. 5的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以 lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试见图5。从图5可以看出，G0D/Ti02(CAT)电极的氧 化还原峰电位随着pH增大而发生负移。在pH = 6-7. 5范围内，电位随着pH值的变化而线 性变化，线性相关系数R = O. 9986，求得斜率为59. 8mV/pH,该数值与伴随有两电子两质子 电极反应的理论值59mV/pH基本一致。实施例41)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4。GOD和CAT按照质 量比为1 1加入到上述溶液，使GOD浓度为0.1%，搅拌溶解，在室温下静置1周。将上述 样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到G0D/Ti02(CAT)粉末样品；2)、3)、同实施例 14)、将上述所制备的电极分别在pH为7的0. IM PBS和加入了 20mM葡萄糖的PBS 中以lOOmv/s的扫描速度进行循环伏安测试见图6。从图6是G0D/Ti02 (CAT) /GC电极分别 在含有20mM葡萄糖pH = 7的PBS的溶液中和不含葡萄糖的pH = 7的PBS的溶液中进行 的电化学性能测试结果，可以看出，当不含葡萄糖时，GODAiO2 (CAT)/GC电极在-0. 12V时 可观察到一对葡萄糖氧化酶的氧化还原峰曲线，但电流很小，而在含有20mM葡萄糖pH = 7的PBS的溶液中出现了对葡萄糖的氧化峰，GOD的氧化峰发生明显的变化，即氧化峰电流增 力口。表明该方法固定的GOD保持了较好的对葡萄糖的催化性能。对比例11)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4. 0。在室温下静置1 周。将上述样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到粉末样品，从图Ib可见样品的XRD 结果对应于锐钛矿相TiO2。2)、将电极面积为0. 1256cm2GC (玻碳电极)用0. 3和0. 05 μ m的氧化铝打磨至光
亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥；3)、配制浓度为10g/L的TiO2PBS悬浊液ImL (PBS为0. IM的pH为7的磷磷酸盐 缓冲溶液)，再加入2 μ L3%的壳聚糖溶液。用微量进样器将上述悬浮液8μ L滴加到处理好的GC电极表面，再滴加质量浓度0. 全氟磺酸溶液2 μ L，室温 自然干燥，得到以TiO2为载体的固定酶电极。4)、将上述所制备的电极在pH为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以扫描速度分别为 100mv/s进行循环伏安测试。图3可以看出，电极的循环伏安曲线中没有出现氧化还原峰。对比例21)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4. 0。只加入GOD —种 酶到上述溶液，使GOD浓度为0. 1%，搅拌溶解，在室温下静置1周。将上述样品抽滤所得 固体在室温下自然干燥，得到G0D/Ti02样品，从图Ic可见样品的XRD结果对应于锐钛矿相 Ti02。2)、同实施例13)、配制10g/L的G0D/Ti02PBS悬浊液ImL (PBS为0. IM的pH为7的磷磷酸盐缓 冲溶液)，再加入2 μ L3%的壳聚糖溶液。用微量进样器将上述悬浮液8 μ L滴加到处理好 的GC电极表面，再滴加质量浓度0. 1 %全氟磺酸溶液2 μ L，室温自然干燥，得到G0D/Ti02电 极。4)、将上述所制备的电极在pH分别为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的 扫描速度进行循环伏安测试。图3可以看出，电极的循环伏安曲线中没有出现氧化还原峰。对比例31)、配制质量分数为4%硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4. 0。只加入CAT —种 酶到上述溶液，使CAT浓度为0. 1%，搅拌溶解，在室温下静置1周。将上述样品抽滤所得 固体在室温下自然干燥，得到CAT/Ti02样品，从图Id可见样品的XRD结果对应于锐钛矿相 Ti02。2)、同实施例13)、配制10g/L的CAT/Ti02PBS悬浊液ImL (PBS为0. IM的pH为7的磷磷酸盐缓冲 溶液)，再加入2 μ L3 %的壳聚糖溶液，用微量进样器将上述悬浮液8 μ L滴加到处理好的GC 电极表面，再滴加质量浓度0. 1 %全氟磺酸溶液2 μ L，室温自然干燥，得到CAT/Ti02电极。4)、将上述所制备的电极在pH分别为7的0. IM磷酸盐缓冲溶液中以lOOmv/s的 扫描速度进行循环伏安测试。图3可以看出，电极的循环伏安曲线中没有出现氧化还原峰。图1是实施例1和对比例1、2、3中所获得的载体Ti O2的X射线衍射图谱，从图 中可以看出，四个样品衍射峰的峰强和峰宽基本一致，其特征衍射峰在2 θ值为25. 2°、37. 8°、48°、54· 6° 和 62. 8°，分别对应于锐钛矿相TiO2 的(101)、(004)、(200)、(105 和 211)、(204)晶面的衍射峰。没有其它杂质衍射峰的出现，说明酶的存在对载体TiO2的衍射 峰没有明显的影响。根据Debye Scherrer公式对(101)面进行计算，四个样品的平均晶体 粒径分别为 3. 74,3. 78,3. 86 和 3. 75nm。图2中可以看出样品实施例4中样品G0D/Ti02(CAT)具有高度有序的孔道结构， 它们是由许多球状的介孔笼通过窗口相互连接排列而成的。从样品的边缘可以直接观察到 TiO2(CAT)的介孔笼。图3表明实施例1和对比例1、2、3中四个样品制备得到的电极在0. IMPBS溶液中 的循环伏安测试曲线，由图比较可见只有G0D/Ti02(CAT)电极在-0. 175V附近(相对于标 准氢电极)电位处出现一对GOD的活性中心的特征氧化还原峰，而其他的三种电极都没有 任何峰出现。可见只有GOD和CAT两种酶同时存在条件下，才可以使GOD的活性保持。图4分析可以看出制备电极的氧化还原峰电位不随扫描速度的改变而改变，峰电 流随扫描速度的增大而增大，且呈线性关系，说明GOD的电化学反应不是扩散控制而是受 表面控制，这进一步证明了 GOD很牢固地固定在TiO2 (CAT) /GC电极表面。另外，随着扫描速 率的增加，阳极、阴极峰峰电位分别向正、负方向产生较小的偏移，ΔΕρ(峰位差)增加，但 Ε°(式量电位)几乎不变。根据扫描速率与峰位差的关系，参考Laviron模型计算电子转移 速率常数。其计算公式为Ks = mnFv/RT (其中m为与峰峰之间分离相关的参数，η为转移 电子数，F为法拉第常数，ν为扫描速率，R为气体常数，T为热力学温度)。根据公式计算出 GODAiO2 (CAT)/GC电极的Ks约为3. 9s—1，该结果大于文献报道的GOD固定在多壁碳纳米管 (1. 53s-1)和单壁碳纳米管(0.3^)修饰电极的电子转移速率。较高的电子转移速率显示 了 G0D/Ti02 (CAT) /GC电极上固定的GOD具有较快的电子传递过程，说明TiO2 (CAT) /GC电极 表面的微环境更有利于GOD的直接电子转移。
权利要求
一种以介孔TiO2为载体的固定酶电极的制备方法，其特征在于，载体材料的合成与酶的固定一步完成，包括以下各步骤1)、配制质量分数为4％硫酸钛水溶液，加入氨水调节pH至4，葡萄糖氧化酶(GOD)和过氧化氢酶(CAT)按照质量比为1-3∶1加入到上述溶液，使GOD浓度为0.1-0.3％，搅拌溶解，在室温下静置1周，将上述样品抽滤所得固体在室温下自然干燥，得到GOD/TiO2(CAT)粉末样品；2)、将GC玻碳电极用0.3和0.05μm的氧化铝打磨至光亮，然后用二次蒸馏水和无水乙醇超声清洗，干燥；3)、配制GOD/TiO2(CAT)的浓度为10g/L的PBS悬浊液，PBS为0.1M的pH为7的磷酸盐缓冲溶液，再加入3％的壳聚糖溶液，其中壳聚糖溶液与上述PBS悬浊液的体积比为1∶500，用微量进样器将上述悬浊液滴加到处理好的GC电极表面，使得63.7μL悬浊液/cm2电极，再滴加质量浓度0.1％的全氟磺酸溶液，所用全氟磺酸溶液与滴到电极上的悬浊液体积比为1∶4，室温自然干燥，得到以TiO2为载体的固定酶电极。
全文摘要
本发明公开了一种以介孔TiO2为载体的固定酶电极的制备方法，载体材料的合成与酶的固定一步完成，包括以下各步骤首先利用硫酸钛、GOD和CAT制备GOD/TiO2(CAT)粉末样品，然后配制GOD/TiO2(CAT)的PBS悬浊液，加入3％的壳聚糖溶液并滴加到预处理好的GC电极上，再滴加质量浓度0.1％的全氟磺酸溶液，自然干燥即可，本发明方法的无机TiO2为载体的酶电极保持了GOD活性，对葡萄糖有较好催化性能。
文档编号G01N27/327GK101813660SQ20101014074
公开日2010年8月25日 申请日期2010年4月2日 优先权日2010年4月2日
发明者于志辉, 夏定国, 李敏 申请人:北京工业大学