专利名称：大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及基因工程，尤其是关于大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，适用于作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。
转移因子是存在于白细胞中一种可透析的免疫小分子肽和多核苷酸，能将供体的某种抗原特异性迟发超敏反应转移给受体。转移因子是细胞免疫激活剂，能特异性和非特异性地提高受体的免疫功能。转移因子介导淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用，可抑制或破坏肿瘤细胞的生长。
转移因子依据其来源和免疫活性的不同，可以分成非特异性转移因子(NTF)和特异性转移因子(STF)。STF来源于用抗原物质免疫过的人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织。肿瘤特异性转移因子作为一种细胞免疫因子，成功地成为一些肿瘤免疫治疗的有效制剂。临床前动物实验及临床资料表明，STF具有抑制杀伤癌细胞作用，可用于肿瘤辅助治疗。对于早期肿瘤术后病人，可以阻止肿瘤复发及转移；对已有转移的病人，可抑制肿瘤生长速度，延长患者生存期，是高新生物技术治疗肿瘤的比较成熟的项目。
甲胎蛋白(AFP)是原发性肝癌的特异性肿瘤标志物。在制备甲胎蛋白特异性转移因子的过程中，需要大量的甲胎蛋白免疫动物。但是商品化的甲胎蛋白价格比较昂贵，使最终产物成本高。
实现本发明的目的是提供一种用大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，是通过PCR法扩增或人基因组中或从其他质粒中得到甲胎蛋白基因，经两端内切酶酶切后克隆至大肠杆菌中稳定表达，其表达甲胎蛋白效率极高，纯化后可作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。
本发明方法包含以下几个步骤(1)甲胎蛋白基因的获得，通过以下3种途径①设计引物，用PCR法扩增得到甲胎蛋白基因，并在基因两端附加相同或不同的内切酶酶切位点；②从人基因组DNA中经内切酶酶切后获得；③从其他质粒中经内切酶酶切后获得；(2)甲胎蛋白基因经内切酶酶切后，将甲胎蛋白基因克隆至表达载体中，并使其在大肠杆菌内稳定表达。
本发明方法设计的上游引物为甲胎蛋白基因序列中的任意位置的核苷酸序列，下游引物为上游引物下游的任意位置的核苷酸序列，上游引物含BamH I、EcoR I或Hind III等所有的商品化内切酶中的一种酶的酶切位点，下游引物含与上游相同的或不同的BamH I、EcoR I或Hind III等各种商品化的内切酶的所有的商品化内切酶中的一种酶的酶切位点。
本发明方法的表达载体是pGEMEX-1或pET44等的所有商品化的原核表达质粒，经BamH I、EcoR I或Hind III等各种商品化的内切酶的所有的商品化内切酶中的一种或两种酶酶切后回收。
本发明方法是将双酶切后的甲胎蛋白基因和pGEMEX-1或pET44等原核表达的所有商品化的质粒在T4连接酶作用下作连接反应，获得表达产物。
本发明方法获得的产物纯化后可作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。
用本发明方法生产大肠杆菌表达的甲胎蛋白可使生产成本大幅度降低。本发明的两个显著特点(1)大肠杆菌表达的甲胎蛋白具有极好的免疫原性；(2)利用大肠杆菌表达量高的特性，该产品生产成本极低。
图2为重组质粒(pGEMEX-1/Afp1)大肠杆菌表达产物的SDS-PAGE电泳图。
实施例一 大肠杆菌表达全长甲胎蛋白的方法1.人甲胎蛋白基因cDNA的获取取人胎肝组织，运用Trizol试剂(购自Gibco BRL公司)提取组织总RNA.以Oligo dT(15)为引物逆转录成cDNA(逆转录酶购自罗氏公司)2.人甲胎蛋白DNA片断的准备合成全长人甲胎蛋白基因的引物，扩增全长AFP基因。引物两端设计与载体匹配的酶切位点，上游含BamH I酶切位点，下游含Hind III酶切位点。
AFP upstream5’GCGGATTCAGA ACA CTG CAT AGA AAT G 3’AFP downstream 5’ATAAGCTTTA AAC TCC CAA AGC AGC ACG 3’高保真PCR合成AFPcDNA。取2ug作PCR产物纯化后用BamH I和HindIII 37度水浴双酶切2小时。再用纯化试剂盒纯化。获得了含有BamH I内切酶和HindIII内切酶粘末端的AFP片断。参见

图1，其中条带1，2，4为AFP基因的PCR产物；条带3为100bp DNALadder(Promega)。3.载体的准备取1ug质粒pGEMEX-1(美国Promega公司产品)用BamH I和Hind III 37度水浴双酶切2小时。再用纯化试剂盒纯化获得含有BamH I内切酶和Hind III内切酶粘末端的质粒片断。4.连接反应将含有Hindm内切酶和BamH I内切酶粘末端AFP片断和质粒片断用T4DNA连接酶在室温下连接5分钟。5.转化感受态细胞氯化钙法制备DH5《感受态细胞，转化10ul连接产物后涂于氨苄阳性的固体LB平板过夜。6.阳性克隆鉴定用上述引物对所挑选的各克隆的细菌裂解液分别进行PCR扩增，凝胶电泳观察PCR结果；小量碱裂解法抽提上述PCR阳性克隆的质粒，溶于双蒸水后，用HindIII内切酶和BamHI内切酶进行酶切，凝胶电泳观察酶切结果。7.测序鉴定将酶切阳性的克隆的质粒纯化后，用SP6，T7T通用引物进行测序鉴定。
其AFP基因序列如下agaacactgc atagaaatga atatggaata gcttccatat tggattctta ccaatgtact 60gcagagataa gtttagctga cctggctacc atattttttg cccagtttgt tcaagaagcc 120acttacaagg aagtaagcaa aatggtgaaa gatgcattga ctgcaattga gaaacccact 180ggagatgaac agtcttcagg gtgtttagaa aaccagctac ctgcctttct ggaagaactt 240tgccatgaga aagaaatttt ggagaagtac ggacattcag actgctgcag ccaaagtgaa 300gagggaagac ataactgttt tcttgcacac aaaaagccca ctccagcatc gatcccactt 360ttccaagttc cagaacctgt cacaagctgt gaagcatatg aagaagacag ggagacattc 420atgaacaaat tcatttatga gatagcaaga aggcatccct tcctgtatgc acctacaatt 480cttctttggg ctgctcgcta tgacaaaata attccatctt gctgcaaagc tgaaaatgca 540gttgaatgct tccaaacaaa ggcagcaaca gttacaaaag aattaagaga aagcagcttg 600ttaaatcaac atgcatgtgc agtaatgaaa aattttggga cccgaacttt ccaagccata 660actgttacta aactgagtca gaagtttacc aaagttaatt ttactgaaat ccagaaacta 720gtcctggatg tggcccatgt acatgagcac tgttgcagag gagatgtgct ggattgtctg 780caggatgggg aaaaaatcat gtcctacata tgttctcaac aagacactct gtcaaacaaa 840ataacagaat gctgcaaact gaccacgctg gaacgtggtc aatgtataat tcatgcagaa 900aatgatgaaa aacctgaagg tctatctcca aatctaaaca ggtttttagg agatagagat 960tttaaccaat tttcttcagg ggaaaaaaat atcttcttgg caagttttgt tcatgaatat 1020tcaagaagac atcctcagct tgctgtctca gtaattctaa gagttgctaa aggataccag 1080gagttattgg agaagtgttt ccagactgaa aaccctcttg aatgccaaga taaaggagaa 1140gaagaattac agaaatacat ccaggagagc caagcattgg caaagcgaag ctgcggcctc 1200ttccagaaac taggagaata ttacttacaa aatgcgtttc tcgttgctta cacaaagaaa 1260gccccccagc tgacctcgtc ggagctgatg gccatcacca gaaaaatggc agccacagca 1320gccacttgtt gccaactcag tgaggacaaa ctattggcct gtggcgaggg agcggctgac 1380attattatcg gacacttatg tatcagacat gaaatgactc cagtaaaccc tggtgttggc 1440cagtgctgca cttcttcata tgccaacagg aggccatgct tcagcagctt ggtggtggat 1500gaaacatatg tccctcctgc attctctgat gacaagttca ttttccataa ggatctgtgc 1560caagctcagg gtgtagcgct gcaaacgatg aagcaagagt ttctcattaa ccttgtgaag 1620caaaagccac aaataacaga ggaacaactt gaggctgtca ttgcagattt ctcaggcctg 1680ttggagaaat gctgccaagg ccaggaacag gaagtctgct ttgctgaaga gggacaaaaa 1740ctgatttcaa aaactcgtgc tgctttggga gttta 17758.重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)的表达将测序序列正确的重组质粒转化氯化钙法制备的BL21(DE3)细菌，涂于氨苄阳性的LB平板过夜。挑克隆37度摇细菌至OD值0.6，加入ITPG至1mmol/L摇4小时收集细菌。9.SDS-PAGE样品加于12％聚丙稀酰胺凝胶，60V电泳30分钟，再120V 90分钟。10.考马斯亮兰染色凝胶室温摇床染色4小时，再脱色4小时，结果参见图2，其中条带1为重组质粒(pGEMEX-1/Afp1)大肠杆菌表达产物；条带2为蛋白Marker。11.Western blot将蛋白质从聚丙稀酰胺凝胶转膜至硝酸纤维素膜，封闭后加入兔抗AFP多克隆抗体(购自DAKO公司)4度过夜。洗膜后加入HRP标记的鼠抗兔二抗，室温一小时即显色反应。诱导前可见少量AFP表达，诱导后可见有明显的AFP表达。空pGEMEX-1质粒没有检出阳性条带。
实施例二 大肠杆菌表达片段甲胎蛋白的方法1.人甲胎蛋白基因cDNA的获取取人胎肝组织，运用Trizol试剂(购自Gibco BRL公司)提取组织总RNA。以Oligo dT(15)为引物逆转录成cDNA。2.人甲胎蛋白DNA片断的准备合成人甲胎蛋白基因的引物，共3对，分别扩增AFP基因上中下三个片断(下文简称AFP1，AFP2，AFP3)。引物两端设计与载体匹配的酶切位点.，上游含BamHI酶切位点，下游含Hind III酶切位点。
Afp1up5＞GCGGATCCAGAACACTGCATAGAAATG＜3Afp1Down 5＞CGCAAGCTTTGTTGCTGCCTTTGTTTGG＜3
AFP2UP5’＞TGTGGATCCCCTGTATGCACCTACAATTC＜3’AfP2down 5＞GCGAAGCTTTTCAAGAGGGTTTTCAGTC＜3AFP3up5＞GCAGGATCCAGAGTTGCTAAAGGATACC＜3Afp3down 5＞AIAAGCTTTAAACTCCCAAAGCAGCAC＜3高保真PCR合成各片断。取2ug作PCR产物纯化后用BamH I和Hind III 37度水浴双酶切2小时。再用纯化试剂盒纯化。获得了含有BamH I内切酶和HindIII内切酶粘末端的AFP片断。3.载体的准备取1ug质粒pGEMEX-1(美国Promega公司产品)用BamH I和Hind III 37度水浴双酶切2小时。再用纯化试剂盒纯化获得含有BamH I内切酶和HindIII内切酶粘末端的质粒片断。4.连接反应将含有HindIII内切酶和BamH I内切酶粘末端AFP片断和质粒片断用T4DNA连接酶在室温下连接5分钟。5.转化感受态细胞氯化钙法制备DH5《感受态细胞，转化10ul连接产物后涂于氨苄阳性的固体LB平板过夜。6.阳性克隆鉴定用上述引物对所挑选的各克隆的细菌裂解液分别进行PCR扩增，凝胶电泳观察PCR结果；小量碱裂解法抽提上述PCR阳性克隆的质粒，溶于双蒸水后，用HindIII内切酶和BamH I内切酶进行酶切，凝胶电泳观察酶切结果。7.测序鉴定将酶切阳性的克隆的质粒纯化后，用SP6，T7T通用引物进行测序鉴定。8.重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)的表达将测序序列正确的重组质粒转化氯化钙法制备的BL21(DE3)细菌，涂于氨苄阳性的LB平板过夜。挑克隆37度摇细菌至OD值0.6，加入ITPG至1mmol/L摇4小时收集细菌。9.SDS-PAGE样品加于12％聚丙稀酰胺凝胶，60V电泳30分钟，再120V 90分钟。10.考马斯亮兰染色凝胶室温摇床染色4小时，再脱色4小时。11.Western blot将蛋白质从聚丙稀酰胺凝胶转膜至硝酸纤维素膜，封闭后加入兔抗AFP多克隆抗体(购自DAKO公司)4度过夜。洗膜后加入HRP标记的鼠抗兔二抗，室温一小时即显色反应。诱导前可见少量AFP1，AFP2，AFP3表达，诱导后可见有明显的AFP1，AFP2，AFP3表达。空pGEMEX-1质粒没有检出阳性条带。参见图2。
实施例三 大肠杆菌表达甲胎蛋白的应用应用本发明方法获得的大肠杆菌表达的甲胎蛋白，按程序免疫猪，制备甲胎蛋白特异性的转移因子，能显著缩小荷肝癌小鼠的肿瘤大小，延长动物模型的生存时间。
实施例四 大肠杆菌表达甲胎蛋白的应用应用本发明方法获得的大肠杆菌表达的甲胎蛋白，按程序免疫山羊，制备多克隆抗体，可用于甲胎蛋白的检测。
实施例五 大肠杆菌表达甲胎蛋白的应用应用本发明方法获得的大肠杆菌表达的甲胎蛋白，按程序免疫小鼠，制备单克隆抗体，可用于甲胎蛋白的检测。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，其特征是用PCR法扩增或人基因组中或从其他质粒中得到甲胎蛋白基因，经两端内切酶酶切后克隆至大肠杆菌中稳定表达，其表达甲胎蛋白效率极高，纯化后可作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。
2.如权利要求1所述的大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，其特征是该方法包含以下几点(1)甲胎蛋白基因的获得；(2)甲胎蛋白基因经内切酶酶切后，将甲胎蛋白基因克隆至表达载体中，并使其在大肠杆菌内稳定表达。
3.如权利要求2所述的甲胎蛋白基因的获得，其特征是通过以下3种途径获得①设计引物，用PCR法扩增得到甲胎蛋白基因，并在基因两端附加相同或不同的内切酶酶切位点；②从人基因组DNA中经内切酶酶切后获得；③从其他质粒中经内切酶酶切后获得。
4.如权利要求3所述的PCR法扩增获得甲胎蛋白基因的方法，其特征是设计的上游引物为甲胎蛋白基因序列中的任意位置的核苷酸序列，下游引物为上游引物下游的任意位置的核苷酸序列，上游引物含BamH I、EcoR I或HindIII等所有的商品化内切酶中的一种酶的酶切位点，下游引物含与上游相同的或不同的BamH I、EcoR I或Hind III等各种商品化的内切酶的所有的商品化内切酶中的一种酶的酶切位点。
5.如权利要求2所述的大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，其特征是用于表达甲胎蛋白的载体经BamH I、EcoR I或Hind III等各种商品化的内切酶的所有的商品化内切酶中的一种或两种酶酶切后回收。
6.如权利要求2所述的大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，其特征是将双酶切后的甲胎蛋白基因和pGEMEX-1或pET44等所有商品化的原核表达质粒在T4连接酶作用下作连接反应，获得表达产物。
7.如权利要求1所述的大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，其特征是用该方法获得的产物纯化后可作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。
全文摘要
本发明提供一种大肠杆菌表达甲胎蛋白的方法，是用PCR法扩增或人基因组中或从其他质粒中得到甲胎蛋白基因，经两端内切酶酶切后克隆至大肠杆菌中稳定表达，其表达甲胎蛋白效率极高，纯化后可作为抗原，用于免疫动物和作为免疫原检测甲胎蛋白抗体。用本发明方法利用大肠杆菌表达量高的特性，可使生产成本大幅度降低，同时，表达的甲胎蛋白具有极好的免疫原性。
文档编号G01N33/574GK1478896SQ03129310
公开日2004年3月3日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者陈智, 朱海红, 周林福, 陈 智 申请人:浙江大学