专利名称：C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种用于C反应蛋白(CRP)定量检测的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析试纸条。
背景技术：
目前的免疫层析(lateral flow immunoassay，LFIA)快速检测试纸条多以胶体金、彩色乳胶微粒或者荧光素作为标记物。基于胶体金标记技术开发的快速检测产品，存在灵敏度低，只能定性或者半定量，批间差异较大等问题；彩色乳胶微粒虽然批间差有所改进，但灵敏度依然较低，也只能定性或半定量；基于荧光素标记技术的免疫层析灵敏度有了较大提高，也能进行定量检测，但是由于样本中含有较高的荧光本底信号，且Stock位移较小，会对检测产生较大的影响。时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence,TRF)是一种非同位素荧光标记物， 与普通荧光相比，具有Stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。本实用新型将时间分辨荧光乳胶微球标记和免疫层析两大技术结合，得到时间分辨焚光免疫层析法(Time-resolved Fluorescence lateral flow immunoassay, TRF-LFIA)，开发出能够精确定量的快速免疫层析检测试纸条。同时，本实用新型对于传统的免疫层析膜组合方式进行了改进，将原有的四层甚至五层膜系统改变成三层膜系统。传统的免疫层析膜组合方式包括样品垫、滤血膜、结合垫、分离膜(硝酸纤维素膜)、吸水垫等四到五层(四层则没有滤血功能或者将滤血功能与样品垫功能组合)。GE公司旗下Whatman开发了具有五合一功能的膜FuSion5，集合了上述五种膜的功能，但Fusi0n5由于孔径较大，抗体难以固定，需要制备特殊的Stone用于固定抗体，生产工艺较为复杂，仪器设备要求较高，开发的免疫层析试剂只能用于定性检测。本实用新型利用FUsi0n5替代传统的样品垫、滤血膜、结合垫，将原有的四层甚至五层膜系统简化，开发出只需要三层膜结构的快速定量免疫层析检测试纸，不仅使生产工艺得到了简化，并有效的降低了产品的批内差和批间差，极具实用价值。

实用新型内容本实用新型的目的是提供一种新型的、能快速定量检测C反应蛋白(CRP)的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析检测试纸条。本实用新型的技术方案为一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，FUsi0n5膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线(T线)和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线(C线)。[0011]该试纸条Fusi0n5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区。所述微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有C反应蛋白抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。进一步的，所述C反应蛋白抗体为C反应蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体。优选的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 lOOOnm。所述荧光微球中填充了镧系元素化合物；较优的，该镧系元素螯合物为铕螯合物； 最优的，该铕螯合物可为Eu (TTA) 3/Τ0Ρ0或Eu (TTA) 3/Phen。 所述生物素标记蛋白可以是任何一种不影响生物素/链霉生物素与亲和素的结合，并可被生物素标记的蛋白。较优的，所述蛋白可以是牛血清Y-球蛋白(BGG)或小牛血清白蛋白(BSA)。硝酸纤维素膜上，T线和C线相互平行，T线靠近加样孔端，C线远离加样孔端。优选的，所述时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。本实用新型的C反应蛋白试纸条通过双抗体夹心法原理测定C反应蛋白(CRP)。实验证实，本实用新型的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，250mg/dL血红蛋白、500mg/ dL甘油三酯、10mg/dL胆红素对本实用新型的试纸条的检测无影响，远超过市场上大多数免疫层析快速诊断产品。

图1 本实用新型C反应蛋白试纸条结构示意图(1.塑料底板2. Fusion5膜3.硝酸纤维素膜4.吸水纸5.加样区6.微球区7. T线区8. C线区)图2 :C反应蛋白试纸条检测标准曲线
具体实施方式
如图1所示的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，包括Fusion 膜2、硝酸纤维素膜3以及吸水纸4三部分。硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板1上。Fusion5膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区5，接近硝酸纤维素膜的区域设有微球区6，微球区上载有时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，所述检测微球为表面包被有C反应蛋白单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白 (小牛血清白蛋白(BSA))的荧光微球；硝酸纤维素膜上设有T线7和C线8，两条线相互平行，T线靠近加样孔端，其上包被C反应蛋白单克隆抗体；C线远离加样孔端，其上包被亲和
ο进一步的，所述时间分辨荧光微球粒径范围为100 lOOOnm。上述C反应蛋白时间分辨荧光免疫试纸条的制备及使用如下1.试纸条各成分的准备1. 1质控微球的制备生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)包被的质控微球的制备[0029](1)生物素标记小牛血清白蛋白(BSA)的制备用0. IM NaCNBH3将小牛血清白蛋白(购自EQUITECH-BIO INC)配制成10mg/ml溶液，采用DMSO ( 二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS (N-羟基琥珀酰亚胺修饰生物素，生产商SIGMA，产品号B3295)溶液至 16. 172mg/ml，按照 Img 蛋白加入 13. 5ulBiotin-X-X_NHS 的量将Biotin-X-X-NHS液加入到小牛血清白蛋白溶液中，混合均勻并在4。C下放置过夜。 采用透析法除去游离未反应的生物素，透析液为生物素标记蛋白透析缓冲液(0. IM Tris, 0. 3M NaCl,0. 005M EDTA-Na_2H20，pH 8. 0)。透析完毕，BCA 法测定蛋白浓度。 (2)采用上述标记蛋白包 被醛基修饰的荧光微球向IOmg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入 6.4μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg上述(1)中透析得到的生物素标记蛋白以及16 μ 1的 NaCNBH3(25mg/ml,0. 05M pH6. O 的 MES 缓冲液配制，现配现用)，补加 0. IM pH6. OMES 至总体积为400 μ 1，37°避光孵育48h。加入40μ 1的Gly溶液(75mg/ml，0. 05M pH6. O的 MES缓冲液配制)，37°避光旋转反应2h。加250 μ 1 N, O-双三甲硅基乙酰胺(200mg/ml， 0. 05MpH6. O的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4°C 13000g离心30分钟。弃上清，用Iml pH6. O的MES缓冲液再洗两次。用Iml 0. 05M pH8. O的HEPES缓冲液 (50mMHEPES,300mM NaCl, 25mM EDTA-Na-2H20,1. 6% N, O-双三甲硅基乙酰胺(BSA), 0. 1% Dextran,0. 1% Tween-20,0. 3745% TritonX-405,0. 01%庆大霉素，O. 05% Proclin)悬浮 (其终浓度为10mg/ml)。(3)质控微球工作液配制根据工作需要，采用0. 05M pH8. O的HEPES缓冲液将(2)中悬液稀释到相应浓度， 分装保存。1. 2检测微球的制备向IOmg醛基修饰的荧光微球(博阳生物科技(上海)有限公司)中加入6. 4 μ 1 20%的Tween-20溶液、2mg C反应蛋白(CRP)单克隆抗体以及16 μ 1的NaCNBH3(25mg/ml， 0. 05M ρΗ6· O的MES缓冲液配制，现配现用)，补加0. IM pH6. OMES至总体积为400 μ 1，37° 避光孵育48h。加入40 μ 1的Gly溶液(75mg/ml,0. 05M ρΗ6· O的MES缓冲液配制)，37° 避光旋转反应2h。力卩250μ1 Ν，0-双三甲硅基乙酰胺(200mg/ml，0. 05Μ pH6. O的MES缓冲液配制)溶液。37°避光旋转反应16h。4°C 13000g离心30分钟。弃上清，用Iml pH6. O 的 MES 缓冲液再洗两次。用 Iml 0. 05M pH8. O 的 HEPES 缓冲液(50mM HEPES,300mM NaCl， 25mMEDTA-Na-2H20,1. 6% N, O-双三甲硅基乙酰胺(BSA), 0. 1% Dextran, 0. 1% Tween-20, 0. 3745% TritonX-405，0. 01%庆大霉素，0. 05% Proclin)悬浮(其终浓度为 10mg/ml)。1. 3微球溶液的配置用释放缓冲液(含有20%蔗糖、5%海藻糖、0.5% N，O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)、 0. 2%庆大霉素)将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0. 2mg/ml，检测微球终浓度为lmg/ml。1. 4检测线(T线)溶液的配制用IOmM PB溶液将CRP单克隆抗体稀释成lmg/ml。1. 5质控线(C线)溶液的配制用IOmM PB溶液将亲和素稀释成0. 5mg/ml。[0043]2.试纸条的制备2.1空白大卡粘贴按照附图1的膜组合方式，硝酸纤维素膜3位于中间，Fusi0n5膜2与吸水纸4分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。2. 2 喷膜分别在图1中T线7、C线8位置喷上T、C线溶 液，C、T线喷膜液量为Ιμ /cm;在图1中6位置喷上微球溶液，微球溶液喷膜量为4 μ 1/cm。2. 3 烘干将步骤(2)中喷好试剂的C反应蛋白大卡在恒温烘箱中37°C烘干24小时。2. 4 切条将烘干的C反应蛋白大卡切割成4mm宽度的纸条，即得到C反应蛋白试纸条。3.试纸条的定量检测3.1绘制标准曲线在制备好的C反应蛋白试纸条(批号20090323)加样区中加入不同浓度的C反应蛋白(CRP)抗原标准品(取六个不同的浓度，分别为0、l、10、20、100、200mg/L，每个浓度设5个重复)，滴加上样缓冲液(PBS，含有1.6% N，0-双三甲硅基乙酰胺(BSA)，0.1% Tween20,防腐剂)，膜层析10分钟以后，仪器读取C、T线信号，实验结果及分析见表1 :表ICRP标准品检测结果
CRP 标准品(mg/L)011020100200
10.003 0.018 0.153 0.325 1.776 3.211
样品信弓20.002 0.016 0.169 0.336 1.632 3.109
30.001 0.019 0.166 0.357 1.581 3.254
40.003 0.018 0.172 0.388 1.752 2.968
50.002 0.015 0.189 0.349 1.488 3.245 mean 0.002 0.017 0.170 0.351 1.646 3.157
SD0.001 0.002 0.013 0.024 0.120 0.121以抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，标准曲线数据见表2，标准曲线如图2所示。表2CRP定量检测标准曲线数据
权利要求1.一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括Fusi0n5膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusi0n5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion膜上设有加样区和微球区，硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线。
2.如权利要求1所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，Fusion膜上远离硝酸纤维素膜的一端设有加样区，接近硝酸纤维素膜的一端设有微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球。
3.如权利要求2所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有C反应蛋白抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有生物素标记蛋白的荧光微球。
4.如权利要求3所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100 lOOOnm。
5.如权利要求1所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，检测线和质控线相互平行，其中检测线靠近加样孔端，质控线远离加样孔端。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述的C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条，其特征在于，试纸条底部设有塑料底板。
专利摘要本实用新型涉及一种C反应蛋白时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条。该试纸条包括Fusion5膜、硝酸纤维素膜和吸水纸三部分，硝酸纤维素膜位于中间，Fusion5膜与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端，Fusion5膜上设有加样区和微球区；硝酸纤维素膜上设有包被有C反应蛋白抗体的检测线(T线)和包被有亲和素或链霉亲和素的质控线(C线)。本实用新型的C反应蛋白试纸条灵敏度高，批内差及批间差小，有较好的重复性，可同时检测全血、血清、血浆、尿液样本，对C反应蛋白(CRP)进行快速定量检测，极具实用价值。
文档编号G01N33/68GK202149903SQ20112016056
公开日2012年2月22日 申请日期2011年5月19日 优先权日2011年5月19日
发明者吴茜, 王海蛟, 石晓强, 赵卫国, 马顺华 申请人:博阳生物科技(上海)有限公司