专利名称：用于测定试验样品中抗原/抗体的检测方法以及用于该检测方法的设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于测定一种试验样品中抗原或抗体的检测方法，以及涉及完成该检测方法而使用的设备。
更具体地讲，本发明涉及一种夹层式(sandwich type)方法，其中包括将疑有特定抗原或抗体的检验样品与一种固体基质相接触，在基质表面上结合有抗体或抗原，其能与检验样品中的抗原或抗体形成一种免疫复合物，然后用一种已标记的抗体/抗原作为检测剂用于检测其中可能已经形成的免疫复合物。
特别是本发明提供了一种甚至于非专门的操作人员能够实施的快速检测方法，并且该方法能够在检测的同时直接显示一种有高度灵敏性的应答。
归根结蒂，本发明的主题是一种上文中描述的特定类型的检测方法，该方法的特征在于将上述固体基质同时与检验样品和已标记的抗体或抗原相接触。
在上一段落中使用的术语“同时”是指下列步骤-将检验样品与已标记的抗体或抗原进行预混合并将预混合产物与基质接触;
-将检验样品加到基质上并且不进行中间洗涤步骤而立即加入已标记的抗体或抗原。
在优选的实施例中，检测剂抗体或抗原是由一种抗体或抗原与一种胶态染料结合而构成的。
虽然从其试图达到的目的考虑，本发明的方法具有普遍性的应用，但该方法特别适合于并有利于测定环境中的变应原以及测定由传染病和寄生虫病产生的抗体。
在一个实施例中，本发明的检验方法具体地涉及生活环境中存在的变应原的测定。
大约在本世纪二十年代首先提出了可能是由于螨虫的作用引起变应性的理论，更近的是大约在本世纪六十年代，一系列的实验进一步肯定地证明表皮螨属的螨类(欧洲家刺皮螨和美洲家刺皮螨)、并且尤其是它们的排泄物，含有大量的称作为Der p Ⅰ的变应原，并且构成了房屋灰尘变应性的最重要的原因。
自从那时以来，已获得了更大量的证据，从而确信了对房屋灰尘中螨类的变应性是世界范围内存在的问题，引起了一系列的临床现象包括从成年人到儿童同样发病的气喘、鼻结膜炎和特应性皮炎等。据认为5%-10%的欧洲人口患有由螨虫存在而引起的变应性症状，并且当更长时间暴露于螨虫和其排泄物时将会有更高百分数的人口患上此症，尽管这些人对此并不敏感。最近进行的流行病学研究已经证明持续地存在0.5-2μg/g灰尘水平含量的Der p Ⅰ变应原，相当于25-100个螨虫/g灰尘，就会有增加出现变应性的危险。基于这个原因，将环境中螨虫密度控制在低至预防医学领域的范围内。
螨虫的“分布”是随聚居地环境而变化的并且是调制呼吸症状的一种重要因素。因此鉴别房屋中螨虫的寄生“地点”是十分重要的，因为由此可以确定用以去除环境中污染的方法(例如使用杀螨剂)，确保消灭螨虫群落以及除去排泄物，这些都是变应原重要来源。已知这些预防性措施连同用患者的脱敏提取物进行的合适的免疫治疗措施能够获得临床上的改善。本发明提供的有效地防治房屋内螨虫的具体贡献，是开发了一种非显微镜法估测的估测方法，该方法快速、简便并且足够灵敏。
尽管应用显微镜技术首次证明了房屋内存在螨虫并且因而证明螨虫具有引起变应性的潜在能力，但该技术当然并不是用于常规分析的最好方法。对于希望发现在不同的地理区域内的占优势的螨种类或希望研究不同螨虫的生物学特征的研究者来说，显镜镜仍是一种必不可少的仪器，但是在将灰尘样品进行常规分析时，应用显微镜技术存在以下一系列缺点-待检样品的制备以及显微镜检测分析方法本身是非常费力、耗时的操作并且需要适当受过培训的人员;
-显微镜不能鉴别含有大量变应原的排泄物。
近年来，已经建立了以可鉴别生活环境中存在的变应原的有效新技术。其中之一是基于使用特异于房屋灰尘中螨虫排泄物的变应原(Der p Ⅰ)的单克隆抗体。
该方法包括将合适量的抗-Der p Ⅰ单克隆抗体固定于微滴板的孔中，接着将它与灰尘样品，并与结合有生物素的特异于Der p Ⅰ的第二个抗体(单克隆或多克隆)一起保温。用结合有抗生蛋白链菌素的过氧化物酶并然后用合适的底物进行比色法显示反应。
该方法是十分灵敏和特异的，但是与用显微镜进行观察一样，该方法需要受过培训的专门人员和特定的实验设备(比色反应的读数器)。
尽管该方法操作步骤复杂，但仍适用于甚至常规类型的检测。
虽然该方法很重要，但仍有一系列限制检测时间长(不小于3小时)，该方法步骤繁多，识别单个变应原。
由于技术上和概念上的飞跃，基于鉴别出的一种标记物，鸟嘌呤(通常为蛛形纲动物氮代谢的最终代谢产物)，能够开发出一种药盒。由于螨虫属于同一属，在螨虫排泄物中也存在鸟嘌呤。基于在房屋灰尘中发现鸟嘌呤可证明环境中存在螨虫。
该方法是一种半定量型方法，使用方便，检测快速并适用于常规检测。这些结果基于在一种固体基质条状物上进行的检测，并进行比色反应而表示，显色程度表示反应强度。
基于该方法具有操作简便的特性，因而具有可由非专业人员完成检测的优点。
该方法的缺点是-没有特异性，特别是对于低阳性结果的情形。该方法是基于下列设想即在房屋灰尘中检测到的鸟嘌呤仅仅由螨虫排泄物产生，但这并不总是真实的。例如蜘蛛存在可以干扰检测。
-螨虫排泄物中的变应原仅是在螨虫中存在的许多变应原之一。相反，螨虫排泄物中并不存在一种重要的变应原(称为Der pⅡ)，因为它是由螨虫虫体产生的;该检测方法不能鉴别该变应原。
没有特异性以及不能识别其他重要的螨虫变应原是该检测方法的两个消极方面，在完成该工作过程中这些消极面引起某些混乱。
当将本申请人开发的并在上文中描述的方法具体地用于测定房屋灰尘中的螨虫变应原时，该方法能克服已知检测方法中的缺点而保留使用简便、直接显示应答(不依赖于特定的阅读仪器)、足够快的检测速度等方面的相同特性。
该方法完成过程中以“夹层”形式使用抗体，优选多克隆抗体(例如从兔中获得)，并且该方法能识别在螨虫中存在的所有的各种类型的变应原而不仅仅是Der p Ⅰ。通过在聚丙烯酰胺凝胶上进行的十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)、并将分离出的变应原转移至硝化纤维素(吸印)纸上并随后与螨虫抗血清进行接触而完成的实验已清楚地证明了该事实。
将特异于螨虫的多克隆抗体置于固体基质上，优选的是硝化纤维素，这就构成了所谓的“反应性条状物”。随后将该反应性条置于检测试管中，然后同时向该试管中加入待检灰尘样品和检测剂抗体(结合有胶态染料的抗螨虫抗体)。
显示有带色的斑点，表明房屋灰尘中存在螨虫。
已经发现将通常分步并间隔了一个洗涤步骤的样品加入步骤和检测试剂加入步骤合并为一个单一步骤，不仅能带来更大的简便性以及实施更快速性，并且还令人惊奇地提高了该方法的灵敏度，得到更显著的信号。当实施同样的方法，但将加入样品的步骤与加入检测剂的步骤分隔开，这样会显著地降低该方法在房屋灰尘样品检测中的适用性，因为这时该方法没能识别出几个阳性结果，而相反，由本发明实施的“一步”法以及显微镜检测法，可以检测到这些阳性结果。解释这种现象的可能的理论是“一步”法能诱导一种免疫复合物，(螨虫)抗原/抗体的形成，在沉淀过程中该复合物促进固定在硝化纤维素纸上的螨虫抗体捕获这些螨虫变应原。
在加入样品(螨虫)和加入检测试剂的两个步骤之间设置一系列用合适缓冲液进行的洗涤步骤，则在洗涤过程中会失去某些从样品中提取的变应原，从而使得加入的检测试剂无效。在其中分散了抗体的水相溶液将同时起着由任何存在的螨虫提取变应原蛋白质的作用，从而使该检测法适于在灰尘样品上完成分析，而不必在前面所述的由灰尘制备的水相提取物上进行分析。
本发明所述的快速检测方法的另一个实施方案涉及将该方法应用于诊断传染病和寄生虫病。在这种情况下必须要检测存在于血液和其他生物体液中的、通过感染而在有机体内诱导出的抗体。这种类型的疾病的一个典型例子是棘球蚴病，对于这种类型的疾病需要提供一种不需要复杂实验设备的简单诊断盒，棘球蚴病是由于受到细粒棘球绦虫的幼虫感染而引起的。通常人是从作为该病的定局宿主的狗传染上该病的，并且狗将传染性棘球绦虫卵传到其排泄物中。
在人体内，由于这种寄生虫的感染产生了囊肿，有时甚至是大囊肿，囊仲集中于肝、肺和其他器官中。
棘球蚴病特别在第三世界如非洲国家广泛传播，但也甚至侵袭发达国家包括意大利。诊断法是基于对血清样品中针对由寄生虫产生的囊肿抗原成份的抗体的研究。目前通过免疫酶促(ELISA)或放射免疫学(RIA)实验检测完成对这些抗体的研究。
而且在这种情况下，本发明的检测方法，即规定几乎同时加入样品和检测抗原，将产生高灵敏度。
由本申请人开发的该方法可以潜在地用于定量检测具有特定特异性的各种抗原或者是抗体，因而该方法在所有情况，在人和兽医领域都是非常有用的，为了诊断特定的生理学状况，此时要求该检测法简单但足够快速和灵敏。下文中的实施例详细描述了前面所述本发明检测方法的实施方案。
实施例1检测螨虫的方法1a、制备特定的抗体每隔三周用分散于完全弗氏佐剂(起始两次免疫接种)或不完全弗氏佐剂(随后的免疫接种-至少四次)的螨虫提取物(蛋白质含量为3mg)皮下给药而免疫接种免子，并通过亲和色谱法纯化从免中获得的抗螨虫血清。
用1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)(PBS组份)中和以0.1M盐酸甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱的级份，合并到一个管中，然后将该管在10mM磷酸钠缓冲液和2.7mM NaCl(pH7.4)中透析。
1bA、染料的制备几种纺织品染料与蛋白质(抗体，抗原……)结合后能形成带色的胶态颗粒，其具有潜在地应用于诊断的意义。特别地，在本发明领域内，优选使用亮粉红5B、FBLN蓝、红Samaron染料(赫彻斯特)型纺织品染料。另外，在本发明领域内设想使用胶态金作为染料。例如，在使用亮粉红5B的情况下，制备溶于水中的5%染料溶液，得到一种胶态悬液，然后将后者以20，000g离心20分钟，离心4次，然后将沉淀重悬于相等于起始体积量的溶液中。其后以125g进行最后离心30分钟以便除去非常大的聚集体。然后用分光光度计分析胶态悬浮液形式的上清液以测定使用的浓度。
为了上述目的，将1份样品溶解于并稀释于乙醇中，使得到的溶液用分光光度法在合适波长(对于亮粉红为540nm)下测定时达到光密度值为1，000。
用字母A表示该光密度值。
如果在硫柳汞(0.01%)存在下保持于4℃时该胶态悬浮液可稳定地存在几个月。
1bB、制备抗体-染料结合物使用pH范围为6-8.5的10mM磷酸盐缓冲液以及使用2.7mM至150mM浓度的NaCl，将各种浓度的染料(从A＝5至A＝50)结合至抗体(蛋白质浓度为5-100μg/ml浓度范围内)。
在斑点处诱导出最大颜色强度并由此得到最好信号的实验条件如下所示磷酸盐缓冲液10mM，pH7.4，NaCl 5mM A＝30以及抗体浓度为20μg/ml。
在制备结合物时，将能达到最终染料浓度A＝30以及最终抗体浓度为20μg/ml的适量体积的染料和抗体接触14小时以使抗体能吸附到带色的胶态颗粒上。
通过加入1/5体积的5mM NaCl，pH7.4-30%牛血清白蛋白(BSA)，并且保温1小时，然后以12，000g于4℃离心20分钟而使该结合物稳定。
将该沉淀溶解于相等于起始体积的缓冲液中并且该缓冲液由10mM PBS、5mM NaCl、5%BSA，0.04%硫柳汞(pH7.4)组成。
可将由此制备的结合物保持于4℃(在短期内是稳定的)或冷冻干燥以改善其稳定性，可保存至少六个月。
1c、制备反应性条状物将由固定了一小方块(1×1cm)硝化纤维素滤纸(具有0.45μm多孔性，优先选用0.2-5μm范围内的多孔性)(bio-MAP，Agate Brianza，Milan)的透明基质构成的条状物(1×8cm)浸于水中保持5分钟，然后干燥。然后将由亲和色谱法纯化的5μg(依据蛋白质含量)抗螨虫抗体置于在10μl体积的磷酸盐缓冲液(10mM，2.7M NaCl)pH7.4中的每一个条状物上。
基于这种方法，当抗体(蛋白质)与硝化纤维素反应时，该抗体与后者形成化学键并且固定于其上。
借助于使用微滴管的手动法或用一个分配器的自动化方法可以分散含有抗螨抗体的溶液。
在将条状物干燥10分钟以避免非特异性反应之后，用溶于PBS(pH7.4)中的1.5%酪蛋白作为阻断蛋白阻断硝化纤维素上的反应性位点。
在环境温度以及搅拌条件下培养2小时后，用PBS-吐温20完成一系列洗涤步骤，然后将如此制备的“反应性条状物”干燥或冷冻干燥。从而可将反应性条状物稳定地保留至少6个月。
将按上述方法制备的反应性条状物置于适当的聚乙烯或聚苯乙烯检测管中，然后借助于刻度汤匙向后者加入一定量的房屋灰尘，通常是从60至80mg。之前已从寝室地板上、从床上、从地毯或其他家用物品上收集了房屋灰尘。之后立即加入检测剂(1-1.5ml)，该检测剂由一种含有经亲和色谱法纯化并与亮粉红染料(如前描述)结合的抗螨虫抗体组成。
在合适的保温时期(不低于30分钟)后产生了一显色斑点即可以证明有螨虫的存在。通过在流水中简单地洗涤反应性条状物可使带色斑点明显。向检测管中加入必定是阴性的房屋灰尘(根据显微镜观察证实无螨虫)没有引起任何带色斑点，证明该方法的特异性。
实施例2检测患者血清中的抗棘球绦虫抗体的方法2a、制备棘球绦虫抗原通过将牛屠杀后获取肝或肺，并从中移出囊肿而获得由棘球绦虫(棘球蚴病)引起的感染性囊肿液，将从每一种囊肿获得的液体冷冻保存于-20℃。在完全收集后，将囊肿解冻，合并并在10mM磷酸钠缓冲液和2.7mM NaCl(pH7.4)中透析并用带有AW06微孔隔膜的预过滤器进行过滤。以13000rpm将溶液离心，并且再用带AP15微孔隔膜的过滤器过滤，检测蛋白质，发现其浓度为0.24mg/ml(micro Bio Rad蛋白质分析)。在与固体基质结合前，用上面描述的缓冲液适当地稀释该抗原。
2bA、制备染料按类似于实施例1描述的方法完成该制备过程。
2bB、制备棘球绦虫抗原/染料结合物使用pH为6至8.5范围的10mM磷酸盐缓冲液以及浓度在2.7至150mM之间的NaCl将各种浓度的染料(从A＝5到A＝50)结合至棘球绦虫抗原(蛋白质浓度为10至300μg/ml之间)。在斑点处诱导出最大强度的颜色并且因此产生最好信号的实验条件如下10mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，5mM NaCl，A＝30以及浓度为50μg/ml的抗原。为了制备结合物，将适量体积的染料和抗原(使其最终浓度分别为染料A＝50以及棘球绦虫抗原为50mg/ml)接触14小时以使抗原与胶态染料颗粒结合。通过加入相等于1/5量的5mM NaCl，pH7.4-30% BSA而使结合物稳定，然后培养1小时并于4℃以12，000g离心20分钟。将沉淀溶解于相等于起始体积的缓冲液中并且缓冲液由10mM PBS、5mM NaCl、5%BSA、0.04%硫柳汞(pH7.4)组成。将该结合物保存于4℃或冷冻干燥而提高其稳定性，确保保存时期不少于6个月。
2c、反应性条状物的制备将由透明基质组成的条状物(1×8cm)浸于水中保持5分钟，然后干燥，其中的基质上适当地固定了一方块(1×1cm)的硝化纤维素滤纸(具有0.45μm的多孔结构)(Bio-MAP，Agrate Brianza，Milan)。随后在每一个条状物上放置溶于10μl量的磷酸盐缓冲液(10mM，2.7mM，NaCl)中的2.5μg(依据蛋白质含量)棘球绦虫抗原(如上所述方法制备)。
基于该方法，通过与硝化纤维素反应，抗原(蛋白质)与之形成化学键，并且固定在其上。通过用一个合适的微滴管的手动法或用合适分配器的自动化方法可将含有抗原的溶液分配(于条状物上)。待条状物干燥后，以溶于PBS(pH7.4)中的1.5%浓度的酪蛋白作为阻断蛋白阻断硝化纤维素上的反应性位点。在环境温度以及搅拌的条件下保温2小时后，用PBS-吐温20完成一系列洗涤步骤，将以该方式制备的反应性条状物干燥或冷冻干燥。因而该反应性条状物可至少保持6个月稳定。将如上述制备的反应性条状物置于聚乙烯或聚苯乙烯检测管中，向后者加入一定量(500μl)的患者血清。立即加入检测剂(500μl)，它由前面描述的棘球绦虫抗原/亮粉红染料组合物组成。
在保温约1小时的时间之后，显示出带色斑点即证明存在有抗棘球绦虫抗体。通过在流水中简单地洗涤反应性条状物而使得带色斑点明显。向检测管中加入肯定是阴性的血清(通过免疫酶促法或RIA方法估测)或加入结合有亮粉红染料但与棘球绦虫抗原无关的抗原，没有产生任何带色斑点，证明该方法的特异性。
通过与“二步”检测法进行比较可以证明本发明的“一步”固定法的灵敏性，在“二步”检测法中，不论是使用螨虫提取物，还是使用已知患有棘球绦虫病的患者的血清进行检测，在加入待检样品步骤与加入检测剂的步骤之间由中间洗涤步骤分隔开。
比较的数据显示于表1中，从该表可看出，不论是在测定螨虫变应原还是在测定受感染患者的棘球绦虫抗体时，“一步”法都具有更大的灵敏度。
使用实施例1中描述的本发明的方法以及公知的如ELISA检测的定量实验方法分别检测5个房屋灰尘样品，可以进一步证明本发明的效果和灵敏性。
表2中给出了该比较的实验结果，从其中可看出，所显示的量非常接近于用定量方法所能检测的数据。
表1检测螨虫提取物或检测患有棘球蚴病的患者血清，比较使用“一步法”和“二步法”时得到的结果。
一步法 二步法1)菌株D.P的螨虫提取物(浓度·μg/ml)2 ++++ +++1 ++++ ++0.5 ++++ ++0.25 +++ +2)棘球绦虫*++ ++++ -++ +/-++ +＊患有棘球蚴病的患者的血清表2比较用“一步法”和用ELISA法检测房屋灰尘样品的结果"ELISA"★"一步法"样品1 + <0.4μg/g样品2 ++++ >10μg/g样品3 ++ <2>0.4μg/g样品4 +++ <10>2μg/g样品5 ++ <2>0.4μg/g＊Der p Ⅰ的量
权利要求
1.一种用于测定试验样品中的抗原或抗体的夹层式检测方法，其中包括将怀疑含有抗原或抗体的试验样品与一种分别在其表面上结合有抗体或抗原的固体基质接触，其可分别与抗原或抗体形成一种免疫复合物，并且其中复合物的形成可通过分别加入已标记的抗原或抗体而检测，该方法特征在于将固体基质同时与试验样品和分别地与已标记的抗体或者抗原接触。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中将试验样品与已标记的抗体或抗原进行预混合，并将得到的预混合产物与固体基质接触。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于已标记的抗体或抗原是一种分别结合有胶态染料或胶态金的抗体或抗原。
4.根据权利要求1-3所述的检测方法，其中分别与抗体或抗原键合的固体基质是一种反应性条状物，其反应性部分是由硝化纤维素构成的。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，该方法用于测定试验样品中的螨虫抗原，其中结合至固体基质和已标记的检测抗体上的抗体是一种多克隆抗螨虫抗体。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的检测方法，该方法用于测定抗棘球绦虫抗体，其中结合至固体基质和已标记的抗原上的抗原是一种棘球绦虫抗原。
7.采用权利要求5的检测方法检测一种试验样品中的螨虫抗原时所使用的诊断设备，包括一种反应性条状物以及计量量的一种多克隆抗螨虫抗体，其中所述的反应性条状物的反应性部分由硝化纤维素构成，而所述的多克隆抗螨虫抗体结合有一种胶态染料。
8.采用权利要求6的检测方法检测抗棘球绦虫抗体时所使用的诊断设备，包括一种反应性条状物以及计量量的棘球绦虫抗原，其中所述反应性条状物的反应性部分是由硝化纤维素构成的，而所述棘球绦虫抗原结合有一种胶态染料。
全文摘要
用于测定一种试验样品中的抗原或抗体的夹层式检测法，其中将怀疑含有抗原或抗体的试验样品与分别在其表面上结合有抗体或抗原的固体基质接触，其分别与所述抗原或抗体形成一种免疫复合物，其中可通过分别加入已标记的抗原或抗体而检测复合物的形成，其特征在于将固体基质同时与试验样品和分别与已标记的抗体或抗原接触。该方法特别有利于测定环境变应原以及由传染病和寄生虫病产生的抗体。
文档编号G01N33/543GK1098784SQ9410115
公开日1995年2月15日 申请日期1994年1月29日 优先权日1993年3月12日
发明者P·法拉吉安尼, G·米斯特雷罗 申请人:罗法马制药实验室有限公司