专利名称：用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法
技术领域：
本发明涉及检测血清中Hib多糖抗体含量的方法技术领域，特别是一种用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法。
背景技术：
b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)是导致5岁以下婴幼儿发生严重疾病的主要原因之一，脑膜炎和肺炎是Hib感染的两种主要疾病，最常见的是脑膜炎，其患儿的死亡率是5%。避免婴幼儿患病的有效方法是及早免疫预防，目前使用的疫苗是多糖蛋白结合疫苗。目前，在测定血清中Hib多糖抗体含量时，通常采用人血清白蛋白作为封闭剂，但 因人血清白蛋白紧缺且价格昂贵，实验中作为封闭剂的用量很大，给b型流感嗜血杆菌的临床血清测定带来很大困难。另外，由于ELISA方法非常敏感，即使是同一份血清，在不同的酶标板或在不同的时间内完成，其测定值也会有很大差异，由于临床血清样本量很大，现有的血清反应时间为37V I. 5h，这就对加样时间有很严格的要求，且很难在较短时间内处理较多的血清样本。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种节约成本且能处理更多样品的用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法。本发明的目的通过以下技术方案来实现用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. O 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤6 8次后，用牛血清白蛋白37°C封闭2 3h;(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2 8°C，16h后洗漆6 8次；(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育I 2h后洗漆6 8次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色20 30min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。本发明具有以下优点本发明公开了一种用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，在测定血清中Hib多糖抗体含量时，用牛血清白蛋白来代替人血清白蛋白作为封闭剂，解决了实验中作为封闭剂的用量很大但人血清白蛋白紧缺且价格昂贵的难题，大幅度地降低了成本，且牛血清白蛋白容易获得，有利于该方法的推广。本发明将反应时间改为2 8V反应16h，可一次检测更多的血清，反应时间更为充分，减少板间差异，有利于提高测定的准确性。因此本发明达到了节约成本和处理更多样品的目的。
具体实施例方式下面结合对比试验及实施例对本发明做进一步的描述对比试验I:反应参数改为37°C，I. 5h，采用牛血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 5的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生 物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤7次后，用牛血清白蛋白37°C封闭2h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37°C，I. 5h后洗涤7次；(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育Ih后洗涤7次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色20min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表I所示。对比试验2:反应参数改为37°C，1. 5h，采用人血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 5的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤7次后，用人血清白蛋白37°C封闭2h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37°C，I. 5h后洗涤7次；(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育Ih后洗涤7次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色20min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表I所示。对比试验3:反应参数改为37°C，1. 5h，采用牛血清白蛋白，用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤8次后，用牛血清白蛋白37°C封闭3h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至37°C，I. 5h后洗涤8次；
(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育2h后洗涤8次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色30min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。用七份不同血清，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表I所示。对比试验4:用七份不同血清分别采用本发明所述的用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法检测，其具体检测实施例如下所述实施例I :用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤8次后，用牛血清白蛋白37°C封闭3h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2 8°C，16h后洗涤8次；(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育2h后洗涤8次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色30min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。实施例2 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以IOOy I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤7次后，用牛血清白蛋白37°C封闭2. 5h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2 8°C，16h后洗涤7次；(III)加酶标抗 体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育I. 5h后洗涤7次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色25min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。实施例3 用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤( I )包被用pH 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100μ I/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C过夜，次日洗涤6次后，用牛血清白蛋白37°C封闭2h ；(II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2 8°C，16h后洗涤6次；(III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育Ih后洗涤6次；(IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色20min ；(V)终止反应加入2M硫酸终止反应；(VI)比色测定492nm的A值(吸光度)，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。用七份不同血清，第I 2份血清采用实施例I所述的方法,第3 4份血清采用实施例2所述的方法，第5 7份血清采用实施例3所述的方法，每份血清均测定三次，求其平均值，用t检验统计其是否具有显著性差异，实验结果如表I所示。表17份血清不同封闭液及反应时间和温度结果比较
权利要求
1.用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，其特征在于它主要包括以下步骤 (I )包被用pH 9. O 9. 6的碳酸盐缓冲液将b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的酪胺化衍生物(PRP-Ty)稀释后，以100 iil/孔的包被量加入微孔板中，2 8°C 过夜，次日洗涤6 8次后，用牛血清白蛋白37°C封闭2 3h; (II)加样加入稀释好的待测血清及标准血清用保鲜膜封板至2 8°C,16 h后洗涤6 8次； (III)加酶标抗体加入辣根过氧化物酶标抗体IgG，在37°C培养箱中孵育I 2h后洗漆6 8次； (IV)加底物显色于各反应孔中加入邻苯二胺(OPD)底物显色，37°C避光显色20 30min ； (V)终止反应加入2M硫酸终止反应； (VI)比色测定492nm的A值，用线性回归的方法绘制标准曲线后求得待测血清的抗体值。
全文摘要
本发明公开了用ELISA法检测血清中Hib多糖抗体含量的方法，它主要包括以下步骤(Ⅰ)包被，(Ⅱ)加样，(Ⅲ)加酶标抗体，(Ⅳ)加底物显色，(Ⅴ)终止反应，(Ⅵ)比色。本发明的有益效果是在测定血清中Hib多糖抗体含量时，用牛血清白蛋白来代替人血清白蛋白作为封闭剂，解决了实验中作为封闭剂的用量很大但人血清白蛋白紧缺且价格昂贵的难题，大幅度地降低了成本，且牛血清白蛋白容易获得，有利于该方法的推广；本发明将反应时间改为2～8℃反应16h，可一次检测更多的血清，反应时间更为充分，减少板间差异，有利于提高测定的准确性。
文档编号G01N33/543GK102759618SQ201210249229
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者关晓峰, 李洪光, 陈庚 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司