专利名称：一种测定水稻花药中花粉数的方法
技术领域：
:本发明涉及一种测定水稻花药中花粉数的方法，属水稻作物种植研究应用技术领域。
背景技术：
:水稻平均每一花药中的花粉数大约有800-2500粒，花粉数是水稻品种重要的生殖性能指标之一；水稻品种每药花粉数及可育花粉数在逆境条件下形成时，常会发生一定变化，因此，花粉数也成为衡量品种对逆境反应的重要特征指标。此外，在杂交水稻的制种生产中，父本有效产粉量也是确定制种田父母本行比的技术依据。因此，水稻研究和生产中常涉及对水稻每药花粉数的测定。目前用于测定水稻每药花粉总数的方法主要有三种:(I)人工计数法:将待测花药直接放在滴有染色液的载玻片上用镊子捣碎，使花粉充分散出，然后在普通光学显微镜下，采用分视野抽样法，人工数出每一视野中的花粉数和活力花粉数。悬浮液法:首先配制能让花粉粒悬浮且不引起花粉变质的悬浮液，如甘油、酒精、碘一碘化钾溶液的混合液、洗衣粉水等；取一定数目的花药，放入该液体中捣碎，搅拌悬浮液使花粉均匀分布，取一定量的混合液在显微镜下多视野抽样计数获得样本花粉数，然后通过所取混合液体积占总混合液体积的比例来推算花粉数和可育花粉数。(3)电脑一扫描仪扫描法:将花药置于滴有1% I2-KI溶液的载玻片上中，弄破花药，令花粉逸出，待花粉沉降后轻轻盖上盖片，用电脑一扫描仪扫描，根据像素点计数产粉量。上述方法存在的不足之处在于:方法(I)由于水稻的花粉量大，在足够大的分辨率下，一个显微视野不能够完全显示出待测样本，常常采用多视野观测，所以，传统的方法只能选择分视野抽样方法，这样使得人工计数的工作量很大，计数的准确性低，一次测定的花药量十分有限。方法(2)存在的问题是准确配制能够使花粉均匀分布的悬浮液体比较困难，因为该液体的比重必须与花粉质量相匹配，而单粒花粉的质量测定比较困难，且不同品种的花粉的质量可能存在较大的差异；同时此方法的测定主要是通过测定一定视野的花粉数后再根据其体积换算得到每药的花粉总数，存在一定误差。方法(3)由于扫描仪不具备显微功能，而花粉很小，对扫描的花粉照片计数时存在很大误差；此外，扫描过程中也存在杂质干扰，同时失活花粉在碘一碘化钾溶液中颜色较浅，也会给准确计数造成困难。因此，上述方法在测定准确性和测定效率等方面均存在明显的不足，不能满足水稻研究和生产实际工作的要求
发明内容
:为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种测定水稻花药中花粉数的方法，能准确地测定花药中的活力花粉与失活花粉数，具有测定方法便捷、数据可靠、测定效率高的特点。本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。本发明提供的一种测定水稻花药中花粉数的方法，包括如下步骤:
(I)、分划板的制作:分划板用长为73mm、宽为38mm、厚为Imm的玻片制成；在分划板的居中位置用金属烙线制作出168个2280 μ mX 3048 μ m的网格；网格的线宽精度为6± 1.5 μ m，线高不超过2 μ m0(2)、取粉与制片:在分划板上滴1-2滴浓度为0.1 % —0.3%的I2-KI溶液，然后从一个颖花中取I个花药用镊子在I2-KI溶液中的不同位置反复地挤，直至花药中的花粉完全散出，取出残留的花药外壁；再在原溶液中加入1-2滴浓度为1%的I2-KI溶液使花粉的染色加深。(3)、分划与拍照:将花粉样本均匀地分布在分划板的网格中；采用数码显微镜对分划板中的网格按序逐一进行完全拍照记录。⑷、计数:采用图像分析软件对所拍图片中的花粉按活力花粉、失活花粉及总花粉数进行分类计数。本发明与现有的技术相比具有如下有益效果:1、由于对花药中散出的所有花粉都进行了拍照及数码统计，实现了对每药花粉数的完全计数。2、采用分步染色和数码区分统计计数技术，能得到每一花药中准确的活力花粉与失活花粉数。3、由于数据的最后统计是通过分析照片所得的，数据保存完好。4、测定方法便捷、数据可靠、测定效率高。


:图1为分划板的结构规格示意图。图2为分划板中一个网格拍照得到的照片效果图(X 100倍)。图3为图像分析软件自动分别统计活力花粉数和失活花粉数的效果图。在图中:A为失活花粉，B为活力花粉。
具体实施方式
:实施本发明，可按以下步骤进行:(I)、分划板的制作:分划板用长为73mm、宽为38mm、厚为Imm的玻片制成；在分划板的居中位置用金属烙线制作出168个2280 μ mX3048 μ m的网格；网格的线宽精度为6± 1.5 μ m，线高不超过2 μ m0(2)、取粉与制片:试样的取样:取次日即将开放的水稻颖花，将其置于培养皿中，然后放于冰盒中保湿带回实验室；或者将整个穗从倒一节拔出，去掉剑叶放入装有水的瓶中带回实验室。在分划板上滴1-2滴浓度为0.1% —0.3%的I2-KI溶液，然后从一个颖花中取I个花药用镊子在I2-KI溶液中的不同位置反复地挤，直至花药中的花粉完全散出，取出残留的花药外壁；再在原溶液中加入1-2滴浓度为1%的I2-KI溶液使花粉的染色加深。(3)、分划与拍照:将花粉样本均匀地分布在分划板的网格中；将分划板置于载物台上，采用超景深数码显微镜对分划板中的网格按序逐一进行完全拍照记录，拍照时注意调整光强的变化，使背景与花粉能够很好的区分开。⑷、计数:将所拍照片输入到计算机中，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件的count/size功能对所拍照片进行分析，对图片中的花粉按活力花粉、失活花粉及总花粉数分类记数；对软件分析计数中极少数的重复计数或漏数，采用人工判断方法增加或减少计数。
权利要求
1.一种测定水稻花药中花粉数的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)、分划板的制作: 分划板用长为73_、宽为38_、厚为Imm的玻片制成；在分划板的居中位置用金属烙线制作出168个2280 μ mX 3048 μ m的网格； (2)、取粉与制片: 在分划板上滴1-2滴浓度为0.1% —0.3%的I2-KI溶液，然后从一个颖花中取I个花药用镊子在I2-KI溶液中的不同位置反复地挤，直至花药中的花粉完全散出，取出残留的花药外壁；再在原溶液中加入1-2滴浓度为1%的I2-KI溶液使花粉的染色加深； (3)、分划与拍照: 将花粉样本均匀地分布在分划板的网格中；采用数码显微镜对分划板中的网格按序逐一进行完全拍照记录； (4)、计数: 采用图像分析软件对所拍图片中的花粉按活力花粉、失活花粉及总花粉数进行分类计数。
2.根据权利要求1所述的一种测定水稻花药中花粉数的方法，其特征在于网格的线宽精度为6± 1.5 μ m，线高不超过2 μ m。
全文摘要
本发明涉及一种测定水稻花药中花粉数的方法，其特征在于在分划板的居中位置用金属烙线制作出168个2280μm×3048μm的网格；在分划板上滴1-2滴浓度为0.1％--0.3％的I2-KI溶液，将1个花药用镊子在I2-KI溶液中的不同位置反复地挤，直至花药中的花粉完全散出，再在原溶液中加入1-2滴浓度为1％的I2-KI溶液使花粉的染色加深；将花粉样本均匀地分布在分划板的网格中；采用数码显微镜对分划板中的网格按序逐一进行完全拍照记录；采用图像分析软件对所拍图片中的花粉按活力花粉、失活花粉及总花粉数进行分类计数。本发明能准确地测定花药中的活力花粉与失活花粉数，具有测定方法便捷、数据可靠、测定效率高的特点。
文档编号G01N21/84GK103091322SQ201110342900
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者田小海, 罗海伟, 吴晨阳, 温婵, 马国辉, 邹华文, 徐延浩 申请人:长江大学