专利名称：一种检测贝肉中镉-金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法
技术领域：
本发明属于一种检测贝肉中金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法。
背景技术：
由于人类对重金属的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，造成不少重金属 如铅、汞、镉、钴等进入大气、水、土壤中，引起严重的环境污染。在工业“三废”污染中，尤其 以重金属如镉，汞，铅等环境污染最为突出。水生生物对镉的富集能力极强，水中的镉通过 食物链富集后可在其体内达到相当高的浓度，如鱼类可富集IO3 IO5倍，贝类富集IO5 IO6倍。镉被人体吸收后，在体内形成镉蛋白，选择性地蓄积于肾、肝，其中肾脏可吸收进入 体内近1/3的镉，是镉中毒“靶器官”。镉损伤肾小管，患者出现糖尿、蛋白尿和氨基酸尿，特 别是使骨骼的代谢受阻，造成骨质疏松、萎缩、变形等一系列症状。目前贝类镉含量的测定方法主要有原子吸收法、比色法和原子荧光法，这些检测 方法的共同特点是要使用大型仪器，要对样品进行消化，消化过程中要使用大量的硝酸、高 氯酸等带来环境污染，耗时长。另外由于贝类样品中镉的测定基体干扰较严重，测定结果的 准确度和精密度存在较大的不确定性。金属硫蛋白是一类广泛存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸、可被重金属、 激素及各种细胞因子诱导的金属结合蛋白，它的一个显著特点是分子中的大量巯基与金属 离子尤其是重金属离子具有很强的结合力，且可在转录水平上被环境中的金属所诱导合 成，这种诱导可以反映出环境受金属污染的水平，故金属硫蛋白可以作为重金属污染的生 物标志物，其研究成为环境与生物医学领域研究的热点。酶联免疫吸附测定法是把抗原抗体免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏 感性有机地结合起来的一种检测技术。由于酶的催化效率很高，使测定方法具有高敏感度。 故本发明通过建立酶联免疫吸附测定法检测贝肉中金属硫蛋白的含量从而间接得出贝肉 中镉含量。郑军恒等(1999)从人胎肝中分离提纯了金属硫蛋白的两个亚型，并用亚型1为 抗原免疫青紫兰兔制备了抗血清，以纯化的抗体建立了人金属硫蛋白的酶联免疫吸附检测 方法。Margarita Apostolova等利用从小鼠肝脏中提取的镉-金属硫蛋白诱导新西兰兔合 成镉-金属硫蛋白抗体，并用此抗体建立了一种灵敏的酶联免疫吸附法检测血清和组织中 的金属硫蛋白。吴力专建立的竞争型酶联免疫吸附法灵敏度约为4. lng/ml。国内外对金属硫蛋白提取制备及酶联免疫吸附法都有研究，而诱导家兔合成 镉-金属硫蛋白抗体，再提纯抗体建立酶联免疫吸附法检测贝肉中的镉金属硫蛋白，从而 间接检测贝肉中镉含量的研究还处于空白。

发明内容
本发明的目的是提供一种检测贝肉中镉_金属硫蛋白的技术，它能有效的反应贝 肉中镉的污染情况，为贝肉中重金属镉的检测提供了一种有效手段。本发明包括如下步骤
1.镉金属硫蛋白的诱导将100 μ 1 0. 2mg/L 0. 6mg/L的氯化镉注射到0. 5 2年的企鹅珍珠贝中，每天 注射1次，共注射6 8次，诱导贝体内大量合成镉_金属硫蛋白；2.镉-金属硫蛋白的分离提纯取出贝肉全脏器，用超纯水清洗，冰上剪碎，称量，加入2倍体积预冷的 pH8. 60. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液勻浆，勻浆后加入一倍体积的V(0. Olmol/lTris-HCl, pH8. 6) V(CH3CH2OH) V(CH3Cl) = 1 1. 05 0. 08 混合液，混勻，4°C静置过夜。10000 12000r/min离心20 30min，上清液置80°C水浴加热3 5min，同上离心。上清中加入 3倍体积_20°C预冷的无水乙醇，搅拌，-20°C放置过夜，4°C下，10000 12000r/min，离心 20 30min，沉淀用Tris-HCl溶解，同上离心，上清即为镉-金属硫蛋白粗提液。粗提液先 后经S印hadex G-50、DEAE-52柱层析后得到镉-金属硫蛋白亚型，再经S印hadex G-25脱 盐，冷冻干燥；3.镉_金属硫蛋白抗体的制备将100 150mg金属硫蛋白、200 300mg牛血清蛋白溶解于20 30mlpH7. 00. lmol/L的磷酸缓冲液中，振荡下滴加1 %戊二醛10 15ml，25 30°C反应2 3h形成偶联物，4°C保存。把偶联物注射到家兔中诱导镉-金属硫蛋白抗体的合成，每隔7 10天加强免疫一次，约2 3次后试血。用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达1 16以上 时通过心脏采血法采血；4.镉-金属硫蛋白抗体的提纯将全血静置，等血清析出后，4000rpm离心取上清。用饱和硫酸铵沉淀法对血清中 镉-金属硫蛋白抗体进行粗提，粗提液用透析袋透析脱盐，DEAE-Sephadex A50柱层析分 离，测定280nm和260nm处的OD值，OD260nm OD280nm的光吸收比率应低于0. 6，比率高则应 重新提纯；5. ELISA 的建立包被，封闭，加兔抗体贝镉_金属硫蛋白抗体与样品，加酶标羊抗兔抗体，加底物， 加H2SO4终止反应，在酶标仪上450nm波长读数。本发明具有以下优点1.本发明的原理科学合理，技术步骤比较成熟，是一种有效可靠而且快速灵敏的 检测方法。2.本发明用于检测贝肉中的镉-金属硫蛋白含量从而间接反应贝肉重金属镉的 污染情况，这为贝肉中重金属镉的检测提供了一种快速灵敏的检测方法。3.本发明的灵敏度较高，检出限可达到2 lOng/ml。
具体实施例方式上述的S印hadex G-50 层析用 pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl 缓冲液以 lml/min 的洗 脱速度进行洗脱，DEAE-52柱层析用pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl作为缓冲液以0 0. 5mol/ L的NaCl进行梯度洗脱，流速lml/min。在抗体的诱导过程中每次多点注射100 200 μ g 的镉_金属硫蛋白，共注射六次，前三次用一倍体积的弗氏完全佐剂乳化，后三次用一倍体 积的弗氏不完全佐剂乳化。以PH7. 40. 01mol/L的PBS溶液洗脱DEAE-S印hadex A50柱纯化粗提后的镉_金属硫蛋白抗体。 ELISA的建立过程中，加待测样品的包被液80 120 μ 1，2 5°C包被过夜，用 250 μ 1洗涤液洗涤3 5次；加100 300 μ 1封闭液，35 39°C封闭2h，同上洗涤；加 30 60 μ g/ml的兔抗贝镉-金属硫蛋白抗体40 60 μ 135 39°C封闭2h，同上洗涤；加 稀释好的辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗90 110 μ 1，35 39°C封闭2h，同上洗涤；加 TMB底物100 300 μ 1，35 39°C反应20 30min ；加2mol/L的H2S0450 μ 1终止反应，酶 标仪上450nm处读数。
权利要求
一种检测贝肉中镉 金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法，其特征包括如下步骤(1)诱导选择0.5～2年的珍珠贝，对其注射100μl 0.2～0.6mg/L的氯化镉，注射6～8次；(2)粗提将贝肉加Tris HCl匀浆，4℃过夜，冷冻离心，取上清于70～90℃水浴3～5min，冷冻离心，上清液中加3倍体积乙醇， 20℃过夜，同上离心，沉淀用Tris HCl溶解，再同上离心，上清即为镉 金属硫蛋白粗提液；(3)纯化粗提液先后经Sephadex G 50、DEAE 52柱层析后得到镉 金属硫蛋白亚型。再用Sephadex G 25脱盐。冷冻干燥后即为成品；(4)抗原的制备用戊二醛将镉 金属硫蛋白与牛血清蛋白相偶联，再用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化得可注射抗原；(5)抗体的诱导将处理好的抗原注射到家兔体内诱导抗体的合成，当抗体效价达到1∶16以上时心脏取血；(6)抗体的提纯先用饱和硫酸铵法对抗体进行粗提，在用DEAE Sephadex A50进行纯化；(7)酶联免疫吸附测定法的建立包被；封闭；加一抗与样品；加酶标二抗；加底物；加终止液；在酶标仪上450nm波长读数。
全文摘要
一种检测贝肉中镉-金属硫蛋白的酶联免疫吸附测定方法，采用氯化镉诱导贝合成镉-金属硫蛋白，再用提纯的金属硫蛋白诱导兔合成抗体，再对抗体进行分离提纯，用达到电泳纯的兔抗贝金属硫蛋白抗体作一抗，用山羊抗兔酶标抗体作二抗，采用间接竞争型酶联免疫吸附法测定贝金属硫蛋白的含量。本发明的原理科学合理，技术步骤比较成熟，用于检测贝肉中的镉-金属硫蛋白含量，从而间接反应贝肉中镉的污染情况，这为贝肉中重金属镉的测定提供了一种快速灵敏的检测方法。
文档编号G01N33/543GK101900726SQ201010227649
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者吴晓萍, 吴育廉, 廖爱琳, 廖艳, 杨捷, 梁鹏, 邓楚津 申请人:广东海洋大学