专利名称：结合trail-r1和trail-r2的多肽的制作方法
技术领域：
广义地，本发明涉及癌症和其它疾病的治疗。具体地，本发明涉及结合TRAIL死亡受体并诱导表达TRAIL死亡受体的病原细胞凋亡的多肽。
背景技术：
TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，除此之外，文献中也称为Apo2L和 TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族，并且已经鉴定为肿瘤细胞中程序化细胞死亡或凋亡的激活剂。TRAIL在免疫系统细胞中表达，包括NK细胞、T细胞、巨噬细胞和树突细胞， 并且位于细胞膜中。TRAIL可以由半胱氨酸蛋白酶加工，产生蛋白质的可溶形式。TRAIL 的膜结合和可溶形式均可作为三聚体并且能通过与靶细胞上的TRAIL受体相互作用而触发凋亡。在人类中，已经鉴定了五个受体具有结合TRAIL的活性。这五个受体中的两个， TRAIL-Rl (DR4, TNFSFlOa)和 TRAIL-R2 (DR5，TNFRSFlOb)，包含称为死亡结构域(DD)的细胞质区域。这两个受体分子上的死亡结构域是TRAIL结合受体后外在凋亡途径TRAIL-活化所需要的。其余三个 TRAIL 受体(称作 TRAIL-R3(DcRl，TNFRSFlOc)、TRAIL-R4 (DcR2, TNFRSFlOd)和循环骨保护素(OPG，TNFRSFllb))被认为是作为诱饵受体。这三个受体缺乏功能性DD，被认为主要通过隔绝TRAIL或刺激促存活信号而参与负调节凋亡。一旦TRAIL与TRAIL-Rl (DR4)或-R2 (DR5)结合，三聚受体就会募集几种胞质蛋白，形成死亡诱导信号复合物(DISC)，之后由其活化半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-10。这将触发两种不同的引起不可逆细胞死亡途径之一，一条途径中，半胱天冬酶-8直接激活效应物半胱天冬酶(半胱天冬酶_3、-6、-7)，导致细胞分解，而另一条途径包括依赖促死亡 Bcl-2家族蛋白Bid的半胱天冬酶-8的裂解，并参加线粒体或内在死亡途径。根据这种细胞死亡活性，正在研究几种基于TRAIL的治疗方法。在一些临床前研究中，重组可溶TRAIL诱导了广谱的人肿瘤细胞系中的凋亡，所述细胞系来自白血病、多骨髓瘤和成神经细胞瘤，以及肺、直肠、胸、前列腺、胰腺、肾和甲状腺癌。已经在多种肿瘤异种移植物中观察到了肿瘤生长的剂量依赖型抑制，同时没有或有很小的全身毒性(Ashkenazi 1999, Jin 2004)。在这些研究中，虽然TRAIL的高度聚集形式与肝毒性有关，但是重组 TRAIL制剂表现出对于选择性和抗肿瘤性质的重要性。重组TRAIL已经成功地用于患者。正在开发几种TRAIL-Rl或-R2人拮抗单克隆抗体。在细胞系和小鼠模型中，这些抗体有效地诱导凋亡。目前至少五个单克隆抗体作为单一药物治疗或与小分子化疗药物组合而在进行临床开发。在至少一项研究中，单克隆抗-DR4或-DR5抗体整体安全并且能够良好耐受，使多名患者病情稳定(即本身没有足够的效力)，组合化学疗法正在评价中。使用结合DR5的单克隆抗体的临床前研究表明通过与二级抗体体外二次交联而介导的TRAIL 受体超聚集(在体内很可能是通过抗体Fc结构域在肿瘤位点结合免疫细胞表面受体)表现出更强的活性。然而，上述治疗方法有几点缺陷。例如，尽管本体/重组TRAIL能结合TRAIL-Rl和 TRAIL-R2 (均为包含DD的受体)，但是它还结合诱饵受体，极大限制了其活性。此外，TRAIL 的半衰期非常短，为分钟级，进一步限制了它的作用。尽管提供了半衰期更长的分子，但是每种抗体方法都是对某一类受体有特异性的。此外，大的抗体会限制其肿瘤穿透性。因此，本领域需要其他可结合TRAIL-Rl和TRAIL-R2的分子，包含这些分子的组合物，用于筛选这种分子的方法，和在多种癌症的药物治疗中使用这种分子的方法。

发明内容
在最广泛的方面，本发明涉及非天然多肽，其包含三聚结构域和与至少一个TRAIL 死亡受体结合的至少一个多肽。在本发明的各个方面，三聚结构域包括在位置10、17、20、21、对、25、沈、28、四、30、 31、32、33、34或35有多达五个氨基酸取代的SEQ ID NO 10的多肽，并且其中三个三聚结构域形成三聚复合物。在另一个实施方案中，所述三聚结构域包括选自下述之一的三聚多肽hTRAF3[SEQ ID NO ]、hMBP [SEQ ID NO ]、hSPC300 [SEQ ID NO ]、hNEM0[SEQ ID NO:]、 hcubilin[SEQ IDNO ]、hThrombospondins [SEQ ID NO :]，和人 SP-D 的颈区[SEQID NO:]、 牛SP-D的颈区[SEQ ID NO ]、大鼠SP-D的颈区[SEQID NO ]、牛胶固素的颈区[SEQ ID NO ]；牛胶原凝集素的颈区[SEQ ID NO ]；和人SP-D的颈区[SEQ ID NO ]。在具体的实施方案中，本发明的非天然多肽结合TRAIL死亡受体DR4和DR5中的一个或两个。结合TRAIL死亡受体的多肽可以是C型类凝集素结构域(CLTD)，其中环区段 A或环区段B的环1、2、3或4之一包含结合DR4和DR5中的一个或两个的多肽序列。在另一个方面，本发明涉及非天然多肽，其包含三聚结构域和结合TRAIL死亡受体DR4的多肽，其中所述结合DR4的多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD)，其包含CTLD的环1和4中序列的几种可能组合。在类似的实施方案中，本发明涉及非天然多肽，其包含三聚结构域和结合TRAIL死亡受体DR5的多肽，其中所述结合DR4的多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD)，其包含CTLD的环1和4中序列的几种可能组合。在一个方面，本发明的非天然多肽不结合TRAIL诱饵受体，比如DcRl、DcR2和循环骨保护素(OPG)。此外，本发明的多肽可以是融合蛋白的形式。在本发明的各个方面，多肽结合DR4和DR5，或者多肽包含均结合DR4或均结合 DR5的两个序列。例如，本发明的多肽可以包含结合DR4和DR5中至少一个的第一多肽，其位于三聚结构域的N-端或C-端之一，和结合DR4和DR5中至少一个的第二多肽，其位于三聚结构域的N-端或C-端中的另一端。第一和第二多肽均可结合DR4，或者第一和第二多肽均可结合DR5。或者，第一和第二多肽中的一个结合DR4，并且第一和第二多肽中的另一个结合DR5。
在另一个方面，本发明的多肽包括结合DR4或DR5的、位于三聚结构域的N-端和 C-端之一的序列，并且在N-端和C-端的另一端包括结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的多肽序列。在另一个方面，结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端和C-端之一，并且结合选自下组的受体的多肽位于N-端和C-端的另一端fnl4、FAS受体、 TNF受体和LIGHT受体。本发明的多肽还可以具有共价附着于多肽上的治疗剂。此外，本发明涉及本发明的三个多肽的三聚复合物。例如，三聚结构域是四联蛋白三聚结构元件。本发明还涉及诱导患者体内表达DR4和DR5中至少一个的肿瘤细胞凋亡的方法。 方法包括用本发明的三聚复合物接触细胞。本发明还涉及三聚复合物和至少一种医药上可接受的赋形剂的药物组合物。药物组合物可以用于治疗癌症患者，并且可以与治疗剂同时或顺序施用。在另一个方面，本发明涉及制备可诱导细胞凋亡的多肽的方法。方法包括筛选结合DR4或DR5之一但不结合TRAIL诱饵受体的第一多肽，并将第一多肽与多聚结构域的 N-端或C-端之一融合。方法还可以包括筛选特异性结合DR4和DR5中另一个的第二多肽， 并将第二多肽与多聚结构域中N-端或C-端中另一端融合。在这个方面，方法可以包括筛选不结合TRAIL诱饵受体的多肽。本发明的再一个方面包括制备可诱导细胞凋亡的多肽复合物，所述细胞表达 TRAIL的至少一个死亡受体，其包含三个三聚多肽。本发明的其它方面包括制备诱导肿瘤细胞凋亡的多肽的方法。这个方面的方法包括，产生包含CTLD的多肽文库，所述CTLD包含至少一个随机环区域，并从可结合DR4或DR5 之一的文库筛选第一多肽。这个方面还可以包括将所筛选的多肽与多聚结构域的N-端或 C-端融合，并筛选不结合TRAIL诱饵受体的多肽。


图1描述人(SEQ ID NO :100)和鼠四联蛋白(SEQ ID NO )成熟形式的编码区域的核苷酸和氨基酸序列比对，并指示了已知的二级结构元件。图2显示四联蛋白家族三聚结构元件的氨基酸序列比对。氨基酸序列(单字母编码)对应于包含外显子2的残基V17至K52和人四联蛋白的外显子3的前三个残基(SEQ ID NO 1)；鼠四联蛋白(SEQ IDNO:) (Sorensen 等，Gene，152 :243_245，1995)；分离自礁鲨软骨的四联蛋白相似蛋白(SEQ ID NO:) (Neame和Boynton，1992，1996)；和分离自牛软骨的四联蛋白相似蛋白(SEQ ID NO ) (Neame和Boynton，数据库登记号PATCHX :u22298)。七肽重复区域的a和d位置处的残基用粗体字表示。列出的四联蛋白家族三聚结构元件的保守序列(SEQ ID NO 10)包含图中所示七肽重复区域a和d位置处的残基，以及区域的其它保守残基。“hy”表示脂肪族疏水残基。图3A、B、C和D显示用作本发明示例的四联蛋白三聚模块截短型的实例。图4显示已知3D结构的十个CTLD的氨基酸序列比对。在每个序列上表示主要二级结构元件的序列位置，并按照数字顺序标为“ α N”，表示α -螺旋数N，和“ β Μ”，表示 β-链数目Μ。参与CTLD的两个保守二硫桥形成的四个半胱氨酸残基在图中分别标注为 “CI”、“Cn”、“Cin”和“CIV”。两个保守的二硫桥分别为CI-CIV和CII-CIIL·人四联蛋白序列中的各个环1-4和LSB(环5)用下划线标出。十个C-型凝集素为hTN:人四联蛋白(SEQ ID NO :XX), MBP 甘露糖结合蛋白(SEQ ID NO =XX) ；SP-D 表面活性剂蛋白D(SEQ ID NO =XX) ；LY49A :NK受体LY49A(SEQ ID NO :XX) ；Hl-ASR 无唾液酸糖蛋白受体的Hl 亚基 (SEQ ID NO :ΧΧ) ;MMR-4:巨噬细胞甘露糖受体结构域4(SEQ ID NO :XX) ；IX-A(SEQ ID NO: XX) ^P IX-B (SEQ ID NO :XX)凝结因子IX/X-结合蛋白结构域A和B ;Lit :胰腺石蛋白(SEQ IDNO :ΧΧ) ；TU14 被囊动物C-型凝集素(SEQ ID NO :XX) 0除TU14之外的所有这些CTLD都来自人蛋白。图 5 描述分离自人(Swissprot P05452) (SEQ ID NO :XX)、小鼠(Swissprot P43025)(SEQ ID NO :XX)、鸡(Swissprot Q9DDD4)(SEQ IDNO :XX)、牛(Swissprot Q2KIS7) (SEQ ID NO :XX)、大西洋鲑鱼(Swissprot B5XCV4) (SEQ ID NO :XX)、青蛙(Swissprot Q5I0R9) (SEQID NO :XX)、斑马鱼(GenBank XP_701303) (SEQ ID NO :XX)的四联蛋白的几个C 型凝集素结构域，和分离自畜养牛(Swissprot U22298) (SEQ IDNO :XX)和礁鲨(Swissprot P26258) (SEQ ID NO :XX)软骨的相关CTLD类似物的比对。图6显示用于在CTLD中产生随机环的PCR策略。图7显示经过修正包含克隆用限制性位点的人四联蛋白CTLD的DNA和氨基酸序列，表明Ca2+结合位点。限制性位点用加粗下划线标出。环用虚线下划线标出。钙配位残基用加粗斜体表示，并包括位点1 D 116,^ 120，G1 147，五150，TV 151 ；位点2 .Q 143,D 145，五150,2) 165。CTLD结构域在氨基酸A45处开始，加粗表示(即ALQTVCL. · ·)。用小写字母表示对本体四联蛋白(TNCTLD)碱基序列的改变。使用不改变本体氨基酸序列的沉默突变产生限制性位点。
具体实施例方式在各个方面，本发明涉及TRAIL受体激动剂(agonist)，其包括具有多聚结构域的多肽和一个或多个结合TRAIL死亡受体的多肽。多肽中的两个、三个或多个能多聚形成激动剂，其为多聚复合物，包括结合TRAIL死亡受体的多肽。一旦与呈现这种受体的细胞上的TRAIL死亡受体结合，激动剂可诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中，多肽结合死亡受体但不是受体的激动剂，使与多肽相关(例如，共价结合)的治疗剂，比如auristatin、 maytansinoid等靶向传递。此外，本发明提供通过对受试对象施用激动剂而治疗受试对象的癌症和其它疾病的方法。多肽包括一个或多个多肽，其特异性地结合TRAIL-Rl (DR4)或 TRAIL-R2 (DR5)中的一个或两个，并且，优选地，不结合TRAIL诱饵受体。定义在详细限定本发明之前，定义多个术语。除非本文提供术语的具体定义，否则本公开文件中使用的术语和短语应理解为具有本领域通常所理解的含义。此外，如同本文和附加权利要求中所使用的，除非上下文明确指出，否则单数形式包括复数指示对象。“TRAIL”或“TRAIL 多肽”指 SEQ ID NO :62，以及 SEQ ID NO 62 的生物活性片段。 片段包括，但不限于，具有SEQ ID NO 62的5至50个氨基酸残基，或5至25，或10至20个残基，或12至20个氨基酸残基的序列(例如，25、23、21、19、17、15或更少的氨基酸残基)。如本文所使用的，术语“TRAIL死亡受体”指可结合TRAIL，并且一旦结合TRAIL即活化肿瘤细胞中的程序化细胞死亡(凋亡)的蛋白质。TRAIL死亡受体的某些非限定性实例包括常称作 TRAIL-Rl (DR4) (SEQ ID NO 42)或TRAIL-R2 (DR5) (SEQ ID NO 43)的受体蛋
白之一。术语“DR4”、“DR4受体“和“TRAIL-R1”在本文互换使用，指SEQ ID NO :42的全长TRAIL受体序列和Pan等，Science, 276 :111-113(1997) ； 1998年7月30日公开的 W098/32856 ；2002年1月四日提交的美国专利No. 6，342, 363 ；和1999年7月四日公开的 W099/37684中所述的受体的可溶、胞外结构域形式。术语“DR5”、“DR5受体“和“TRAIL-R2”在本文互换使用，指SEQ ID NO :43的全长 TRAIL 受体序列和 Pan 等，Science, 276 :111-113(1997) ；Pan 等，Science, 277 815-818 (1997)，2000 年 6 月 6 日提交的美国专利 No. 6，072，047 ；美国专利 No. 6，342，369， 1009 年 11 月 19 日公开的 W098/51793 ； 1998 年 9 月 24 日公开的 W098/41629 ；Screaton 等，Curr. Biol.，7 :693-696(1997) ；Walczak 等，EMBO J.，16 :5386-5387(1997) ；Wu 等， Nature Genetics, 17 :141-143(1997) ；1998 年 8 月 20 日公开的 W098/35986 ；1998 年 10 月 14日公开的EP870，827 ；1998年10月22日公开的W098/46643 ；1999年1月21日公开的 W099/(^653 ;1999 年 2 月 25 日公开的 W099/09165 ;1999 年 3 月 11 日公开的 W099/11791 中所述的受体的可溶、胞外结构域形式，所述文献均通过引用全部并入本文。如本文所使用的，术语“TRAIL诱饵受体“指可结合TRAIL并且，一旦结合TRAIL， 不会活化肿瘤细胞中程序化细胞死亡(凋亡)的蛋白质。因此，认为TRAIL诱饵受体起程序化细胞死亡信号抑制剂而不是传感器的作用。TRAIL诱饵受体的某些非限定性实例包括常称作 TRAIL-R3 (也称作 DcRl，TRID, LIT 或 TNFRSFlOc) [(Pan 等，Science, 276 :111-113 (1997) Sheridan 等，Science，277 :818-821 (1997) ；McFarlane 等，J.Biol· Chem.，272 :25417-25420 (1997) ；Schneider 等，FEBS Letters,416 :329-334(1997)； Degli-Esposti 等，J.Exp· Med.，186 :1165-1170(1997)；和 Mongkolsapaya 等，J. Immunol.， 160 :3-6(1998)] (SEQ ID NO 44)，TRAIL-R4(也称作 DcR2, TRUNDD 禾口 TNFRSFlOd) (SEQ IDNO 45), [Marsters 等，Curr. Biol.，7 :1003-1006(1997) ；Pan 等，FEBSLetters，424 41-45(1998) ；Degli-Esposti 等，Immunity, 7 :813-820(1997)]和循环骨保护素(也称作 0PG, TNFRSFllb) (SEQ ID NO 46)中的任何受体蛋白，所述文献均通过引用全部并入本文。使用术语“TRAIL受体激动剂”或“激动剂”最广泛的含义，并且其中包括在体外、 原位或体内，部分或全部增强、刺激或活化DR4和DR5及其生物活性变体的一种或多种生物活性的任何分子。这种生物活性的实例包括凋亡以及文献中进一步报道的活性。激动剂可以以直接或间接的形式起作用。例如，，，TRAIL死亡受体激动剂“可以通过直接结合DR4或 DR5，其可引起受体活化或信号转换，在体外、原位或体内，部分或全部增强、刺激或活化DR4 和DR5的一种或多种生物活性。TRAIL受体激动剂包括本文定义的TRAIL多肽以及可结合 TRAIL受体的、不被当作TRAIL多肽的多肽；例如，使用本文所述方法特异性结合TRAIL死亡受体但不结合TRAIL诱饵受体的多肽。如本文所使用的，术语“结合成员，，指彼此之间有结合特异性的分子对中的成员。 结合对的成员可以天然产生或者全部或部分合成产生。分子对中的一个成员有表面区域或凹陷处，可结合并因此与分子对中另一个成员的特定空间和极性组织互补。因此分子对成员可以彼此特异性结合。在本发明的各个方面，TRAIL死亡受体的结合成员是TRAIL受体激动剂。这些成员包括本文所述TRAIL多肽，以及包括TRAIL多肽和多聚(例如，三聚)结构域的多肽，和包括多聚结构域和非TRAIL多肽的多肽，但是其可结合并刺激TRAIL死亡受体，如本文所进一步描述的。在其它方面，本发明的多肽结合TRAIL死亡受体，但不是受体的激动剂。如本文所使用的，术语“多聚结构域”表示氨基酸序列，其包含能和两个或多个其它氨基酸序列形成三聚物或其它多聚复合物的功能。在一个实例中，多肽包含氨基酸序列-“三聚结构域”-其与两个其它三聚结构域形成三聚复合物。三聚结构域能联合相同氨基酸序列的其它三聚结构域(同三聚体)，或不同氨基酸序列的三聚结构域(异三聚体)。 这种相互作用可能是由于三聚结构域组分之间的共价键合以及氢键力、疏水力、范德华力和盐桥而引起的。在本发明的各个实施方案中，多聚结构域是二聚化结构域、三聚结构域、 四聚化结构域、五聚化结构域等。这些结构域能形成本发明的两个、三个、四个、五个或多个多肽的多肽复合物。本发明的多肽的三聚结构域可以来自美国专利申请公开No.2007/01M901( ‘901 申请)中所述的四联蛋白，其通过引用全部并入本文。本文中以SEQ ID NO :100提供成熟人四联蛋白单链多肽序列(参见，例如，表1)。四联蛋白三聚结构域的实例包括SEQ ID NO 1的氨基酸17至49、17至50、17至51和17-52，其代表由人四联蛋白基因的外显子2编码的氨基酸，和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。其它实例包括氨基酸1至49、1至50、1至51和1至52，其代表所有外显子1和2，和可选地由所述基因的外显子3编码的前一个、两个或三个氨基酸。可替换地，在三聚结构域中仅包括外显子 1编码的部分氨基酸序列。具体地，三聚结构域的N-端可以在SEQ ID N0:1的残基1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17的任何位置开始。在具体的实施方案中，N端是 I10或V17，并且C-端是Q47、;Γ48、V49、C(S)50、L51或K52(根据SEQ ID N0:1编号)。此外，图3A-3D提供多种人四联蛋白三聚结构域的可能的截短型变体。在本发明的一个方面，三聚结构域是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的四联蛋白三聚结构元件(“TTSE”)，其为四联蛋白家族三聚结构元件的保守序列，US 2007/00154901 中有更完整的描述，其通过引用全部并入本文。如图2所示，TTSE环抱着四联蛋白的蛋白家族天然产生成员的变体，和具体地，氨基酸序列经过修正不会对TTSE形成α螺旋卷曲螺旋三聚体的能力产生任何实质的负面影响的变体。在本发明的各个方面，根据本发明的三聚多肽包括作为三聚结构域的TTSE，其与SEQ ID NO 10的保守序列具有至少66%的氨基酸序列同一性；例如与SEQ ID NO 1的保守序列具有至少73%，至少80%，至少86%或至少92%的序列同一性(仅计算确定(不包括X)残基)。即，SEQID NO 1中确定的氨基酸中至少一个，至少两个，至少三个，至少四个，或至少五个可以被取代。在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO 63在位置50 (C50)处的半胱氨酸可以有利地突变为丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或任何其它氨基酸残基，以避免形成不理想的链间二硫桥，其会产生不理想的多聚。其它已知的变体包括选自第6、21、22、24、25、27、观、31、32、35、 39,41和42个(根据SEQ ID NO 63编号)的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基，其可以由任何非螺旋阻断的氨基酸残基取代。这些残基已经表现出不会直接参与分子间的相互作用，所述相互作用可以稳定本体四联蛋白单体的三个TTSE之间的三聚复合物。在图2所示的一个方面，TTSE具有分子式为a-b-C-d-e-f-g(N至C)的重复的七肽重复序列，其中残基 a和d(即，位置沈、33、37、40、44、47和51)可以是任何疏水氨基酸(根据SEQ ID N0:1编号)。在进一步的实施方案中，TTSE三聚结构域可以通过掺入聚组氨酸序列和/或蛋白酶裂解位点，例如，血凝因子)(a或颗粒酶B (参见US2005/0199251，其通过引用并入本文)， 并通过包括C-端KG或KGS序列而修正。此外，为了帮助纯化，位置2的脯氨酸可以用甘氨酸取代。TTSE截短型和变体的具体的非限定性实例如图3A-3D所示。此外，已知多个与人四联蛋白的三聚结构域具有实质相似性(大于66%)的三聚结构域。表 权利要求
1.非天然多肽，其包含三聚结构域和与至少一个TRAIL死亡受体结合的至少一个多肽。
2.权利要求1的多肽，其中所述三聚结构域包含SEQID NO :10的多肽，其在位置10、 17、20、21、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34或35有多达五个氨基酸取代，并且其中三个三聚结构域形成三聚复合物。
3.权利要求1的多肽，其中所述三聚结构域包含选自下组的三聚多肽hTRAF3[SEQID NO ]、hMBP [SEQ ID NO ]、hSPC300 [SEQID NO ]、hNEM0[SEQ ID NO ]、hcubilin[SEQ ID NO ]、hThrombospondins[SEQ ID NO ]，和人 SP-D 的颈区[SEQ IDNO ]、牛 SP-D 的颈区 [SEQ ID NO ]、大鼠SP-D的颈区[SEQ IDNO ]、牛胶固素的颈区[SEQ ID NO ]；牛胶原凝集素的颈区[SEQID NO ]；和人SP-D的颈区[SEQ ID NO ]。
4.权利要求1的多肽，其中至少一种TRAIL死亡受体是DR4或DR5。
5.权利要求1的多肽，其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一种多肽包含C型类凝集素结构域(CLTD)，其中环区段A或环区段B的环1、2、3或4中的一个包含结合DR4和DR5 中至少一个的多肽序列。
6.权利要求1的多肽，其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽结合DR4，并且包含C型类凝集素结构域(CLTD)，其包含环1和4中序列的下述组合之一
7.权利要求1的多肽，其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽与DR5结合，并包含C型类凝集素结构域(CLTD)，其包含环1和4中序列的下述组合之一
8.权利要求1的多肽，其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽不结合TRAIL诱饵受体。
9.权利要求8的多肽，其中所述TRAIL诱饵受体是DcRl、DcR2和循环骨保护素(OPG) 中的至少一个。
10.权利要求1的多肽，其中所述多肽是融合蛋白。
11.权利要求10的多肽，其中所述结合至少一个TRAIL死亡受体的多肽与DR5结合，并包含下述序列ACFPIMTLHCGGG[SEQ IDNO ]。
12.权利要求1的多肽，其中所述结合TRAIL死亡受体的至少一个多肽包含结合DR4的多肽和结合DR5的多肽。
13.权利要求12的多肽，其中所述结合DR4和DR5中至少一个的第一多肽位于三聚结构域的N-端或C-端之一，并且所述结合DR4和DR5中至少一个的第二多肽位于三聚结构域的N-端或C-端中的另一端。
14.权利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽均结合DR4。
15.权利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽均结合DR5。
16.权利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽中的一个结合DR4，所述第一和第二多肽中的另一个结合DR5。
17.权利要求13的多肽，其中所述第一和第二多肽中至少一个包含CTLD，其中环区段 A或环区段B的环1、2、3或4之一包含结合DR4和DR5中至少一个的多肽。
18.权利要求4的多肽，其中所述结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端和 C-端之一，并且在N-端和C-端中的另一端还包含结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)的多肽序列。
19.权利要求18的多肽，其中所述多肽结合肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原 (TSA)的亲和力比所述多肽结合DR4或DR5的亲和力至少高两倍。
20.权利要求4的多肽，其中结合DR4或DR5的多肽位于三聚结构域的N-端或C-端之一，并且在N-端和C-端中的另一端还包含结合选自下组的受体的多肽序列而14、FAS受体、TNF受体和LIGHT受体。
21.权利要求1的多肽，其还包含共价附着于多肽上的治疗剂。
22.包含三个如权利要求1所述的多肽的三聚复合物。
23.权利要求22的三聚复合物，其中所述三聚结构域是四联蛋白三聚结构元件。
24.权利要求22的包含三个多肽的三聚复合物，其中所述复合物包含结合DR4的三个多肽序列，其中所述序列相同或不同，并且所述复合物包含特异性结合DR5的三个多肽序列，其中所述序列相同或不同。
25.编码多肽的分离的多核苷酸，所述多肽包含权利要求1的多肽。
26.包含权利要求25的多核苷酸的载体。
27.包含权利要求沈的载体的宿主细胞。
28.诱导患者体内表达DR4和DR5中至少一个的肿瘤细胞凋亡的方法，其包含用权利要求22的三聚复合物接触细胞。
29.权利要求观的方法，其中所述三聚复合物诱导半胱天冬酶依赖型凋亡。
30.权利要求四的方法，其中所述三聚复合物诱导半胱天冬酶非依赖型凋亡。
31.药物组合物，其包含权利要求22的三聚复合物和至少一种医药上可接受的赋形剂。
32.治疗癌症患者的方法，其包含对有需要的患者施用权利要求31的药物组合物。
33.权利要求32的方法，其还包含对患者同时或顺序施用治疗剂。
34.包含权利要求22的复合物的DR4受体激动剂。
35.包含权利要求22的复合物的DR5受体激动剂。
36.用于制备诱导细胞凋亡的多肽的方法，其包含a)选择结合DR4或DR5之一但不结合TRAIL诱饵受体的第一多肽；b)将第一多肽与多聚结构域的N-端或C-端之一融合。
37.权利要求36的方法，其还包含a)选择特异性结合DR4和DR5中另一个的第二多肽；b)将第二多肽与多聚结构域的N-端或C-端中的另一端融合。
38.权利要求37的方法，其中步骤(a)还包含选择不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
39.用于制备诱导细胞凋亡的多肽复合物的方法，其中所述细胞表达TRAIL的至少一个死亡受体，所述方法包含将根据权利要求37制备的三个多肽三聚。
40.用于制备诱导肿瘤细胞凋亡的多肽，其包含a)建立包含CTLD的多肽文库，所述CTLD包含至少一个随机环区；b)从文库中选择结合DR4和DR5之一的第一多肽。
41.权利要求40的方法，其还包含(c)将选择的多肽附着于多聚结构域的N-端或 C-端。
42.权利要求40的方法，其中步骤(b)还包含选择不结合TRAIL诱饵受体的多肽。
全文摘要
本发明涉及TRAIL死亡受体的激动剂，所述激动剂包括具有多聚例如三聚结构域的多肽和与TRAIL死亡受体TRAIL-R1和TRAIL-R2中至少一个相结合的多肽序列。所述激动剂不结合TRAIL诱饵受体。三聚结构域可以来自人四联蛋白。激动剂能够诱导表达TRAIL死亡受体的病原细胞中的凋亡。所述药物组合物用于治疗与表达DR4和DR5的细胞如肿瘤细胞相关的疾病。用于筛选多肽并制备多聚复合物的方法。
文档编号G01N33/68GK102317314SQ200980149692
公开日2012年1月11日 申请日期2009年10月9日 优先权日2008年10月10日
发明者凯瑟琳.鲍迪什, 安克.克雷茨-罗梅尔, 林冰, 马克.伦肖, 马萨.怀尔德 申请人:阿纳福公司