专利名称：检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子及其组合。此外，本发明还涉及用于鉴别和/或鉴定和/或确定与酿造有关的微生物的属或种的核酸分子及其组合的使用方法。
背景技术：
啤酒从微生物学角度看是非常稳定的，只有相对少的细菌可使啤酒腐败。为了能尽早发现导致污染的菌体，需使用一种快速鉴别啤酒中的细菌的方法，以便尽快采取相应措施。
所有使啤酒腐败的菌体的共同特点在于它们在单个容器中(啤酒桶，啤酒瓶)的污染微量，并且生长缓慢。厌氧菌的微生物培养尤其困难。目前熟知的可使啤酒变坏的细菌被归类为以下菌属乳酸杆菌(Lactobacillus)，片球菌(Pediococcus)，梳状菌(Pectinatus)，大孢菌(Megasphaera)。硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)中的代表作为可使啤酒腐败的细菌虽然还未显现，但是不能排除其污染啤酒和在其中生长的可能。
乳酸杆菌属(Lactobacillus)为革兰氏阳性的、不产生孢子的、大多不运动的、链状的、细长的、有时弯曲的杆菌。有时也可发现其球状的形态。其代表物为微嗜氧的，部分是厌氧的。它们为细胞色素酶和分解酶阴性，需要复杂的营养条件。其代谢为发酵型。DNA的G+C含量为32-53％。除了啤酒，乳酸杆菌还可存在于奶制品、谷物制品、肉和鱼类制品、水、废水、葡萄酒、水果和果汁、腌制蔬菜、酸菜、青贮饲料和发酵面团中。它们虽存在于哺乳动物的口、肠、阴道内，但却很少致病(Bergeys，Manual of Syst.Microbiology，1984，S.1209-1234)。这些细菌通过它们的代谢产物使啤酒浑浊或出现异味。可使啤酒变质的菌种包括Lactobacillus brevis，Lactobacillus lindnereri，Lactobacilluscasei，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus coryniformis和Lactobacilluscurvatus(Back，Brauwert，1980，120，S.1562-1569)。
片球菌属(Pediococcus)包括革兰氏阳性的、不运动并不产生孢子的球菌。它们形成四联体或二联体。它们选择性厌氧，种与种之间对氧气的敏感度不同。片球菌(Pediococcus)为细胞色素氧化酶和分解酶阴性，需要复杂的营养条件(Bergeys Manual of Syst.Microbiology，1984，S.1075-1079)。它们被用于生香肠的生产，发酵多种腌菜并可导致食品变质(Firnhaber，BaumgartMikrobiologsche Untersuchung vonLebensmitteln，1993，S.413-419，115-117)。片球菌属(Pediococcus)包括八个种，其中Pediococcus damnosus和Pediococcus inopinatus这两种可使啤酒变质。
梳状菌属(Pectinatus)包括Pectinatus cerevisiiphilus，Pectinatusfrisingiensis和在分类学上亲缘关系不远的种Pectinatus sp.DSM20764。所有的种都已从变质的啤酒中发现(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。它们是略微弯曲的、不产生孢子的杆菌。它们呈梳状排列并且是运动的。它们既不产生分解酶，也不产生细胞色素氧化酶，并专性厌氧。分子G+C占38-41％。梳状菌属(Pectinatus)及大孢菌属(Megasphaera)，硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)的细胞壁均为革兰氏阳性。尽管其革兰氏染色为阴性，但它们在分类学上被归入革兰氏阳性菌(Haikara，the Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.1993-2004)。
大孢菌属(Megasphaera)包括Megasphaera elsdenii和Megasphaeracerevisiae。只有Megasphaera cerevisiae与酿造有关，是革兰氏阴性的、严格厌氧的、细胞色素氧化酶和分解酶阴性的、不运动的、部分轻微伸展的球菌。它们以单个、成对或短链的形式存在。平均的细胞直径为1.4μm，分子G+C占41.4-44.8％。主要代谢产物为与硫有关的物质，如H2S和挥发性脂肪酸。Megasphaera cerevisiae的污染可改变啤酒的气味和口味(Haikara，the Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.1993-2004)。
硒单胞菌属(Selenomonas)的菌种是专性厌氧、革兰氏阴性的、不产生孢子的、略微弯曲并运动的杆菌。分子G+C占48-58％(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。硒单胞菌属(Selenomonas)存在于哺乳动物的胃、肠和粪便中。它包括10个菌种(Hespell et al.，The Prokaryotes，第2版，卷II，1991，S.2005-2013)。只有Selenomonaslacticifex存在于起始酵母中，因而它与酿造有关。虽然，Selenomonaslacticifex不被视为引起啤酒腐败的细菌，但其可能在啤酒中繁殖，从而仍被认为是引起啤酒变质的细菌。
嗜酶菌属(Zymophilus)包括Zymophilus paucivorans和Zymophilusraffinosivorans。它们为革兰氏阴性、运动的、轻微弯曲的杆菌。它们以单个、成对或短链的形式存在。分子G+C占38-41％。它们专性厌氧，并导致发酵代谢。上述的两种嗜酶菌种存在于起始酵母和酿酒厂的废物中。只有Zymophilus raffinosivorans在啤酒中繁殖(Schleifer et al.Int.J.of Syst.Bacteriology，1990，S.19-27)。
基于16S-rDNA基因序列的比较，所有待检的菌属都被归于G+C含量低的革兰氏阳性菌。片球菌属(Pediococcus)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)被归于乳酸杆菌科(Lactobacillacace)。梳状菌属(Pectinatus)，大孢菌属(Megasphaera)，硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)被归于粘孢菌组(Sporomusa)。粘孢菌组(Sporomusa)被视为带革兰氏阴性细胞壁的革兰氏阳性菌(Stackebrndt et al.，TheProkaryotes，第2版，卷II，1991，S.25-26，33)。
用传统的微生物学方法鉴别上述细菌需要可能多达10天的时间，因此，人们需要一种更快捷的检测方法，否则会产生不必要的仓储费用或出现被检测啤酒在检测结果得出之前即已出厂的情形。为此，人们发明了很多快速检测方法，例如检测致啤酒变质的细菌的代谢产物的方法(Haikara et al.，Microbiology，1995，141，S.1131-1137)。其它的间接检测方法包括浊度测试法(Haikara et al.，ASBC，1990，S.92-95)和ATP生物发光测量法(Miller et al.，J.Inst.Brew.，1989，Band 95，S.317-319)。此外，通过抗体进行检测也具有既迅速又特异的优点(Gares etal.，ASBC，1993，S.158-163；Winnewisser et al.，Int.J.of Bacteriology，1995，45，S.403-405)。但是，以上所述方法的缺点在于，一是检测参数不具有特异性，二是一次只能鉴别一种菌种或菌属。此外，人力物力投入太多。关于鉴别与酿造有关的细菌污染的快速方法可参考Dowhanick的综述(Cerevisia，1995，20/4，S.40-49)。
聚合酶链反应(PCR)是一种对细菌进行特异性鉴别的快速有效的方法(“Polymerase chain reaction”，Mullis et al.，见US 4 683 195，US 4683 202，US 4 965 188)。有一些核酸分子可作为引物和探针用于鉴别与酿造有关的微生物。然而，此方法的缺点在于，在一个扩增和检测反应中使用核酸分子仅可探测出一小部分与酿造有关的微生物。使用PCR方法通过一个扩增反应仅可鉴别出乳酸杆菌属(Lactobacillus)，片球菌属(Pediococcus)，梳状菌属(Pectinatus)，大孢菌属(Megasphaera)中的单个菌种。此外，上述使用致癌的或剧毒溴化乙锭染色扩增产物从而实现扩增产物可视化的方法，如琼脂胶电泳，本身便是一个问题。而且，PCR方法很难实现自动化，并且对琼脂胶的分析和借助扩增产品大小对细菌的鉴别有一部分不是很清楚。

发明内容
为此，本发明目的在于提供测试啤酒和酿造原料的微生物污染的最快速的方法和手段。此测试应包括鉴别所有可致啤酒污染的微生物。
本发明通过以下方法以及使用一个核酸分子完成上述任务。该方法包括下列步骤(a)将样品与至少包括两个一级核酸分子(引物)的组合接触。
此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交；
(b)扩增微生物核酸分子或其一部分，以产生一个扩增片段。
(c)将在步骤(b)中获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子(探针)接触。上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行杂交，这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的，或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异的片段。
(d)鉴别至少一个由扩增片段和从c)中得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。核酸分子的选取范围如下(i)包含SEQ ID No.1-107的一个序列，或此序列中一长度为10，最好是15到30个碱基的片段的核酸分子；(ii)与一个(i)中核酸分子发生特异性杂交的核酸分子；(iii)与一个(i)或(ii)中的核酸分子具有70％，最好至少90％的相同性的核酸分子；(iv)与一个(i)到(iii)中的核酸分子互补的核酸分子。
在SEQ ID NI 1-107的序列中，碱基缩写如下G＝Guanosine，A＝Adenosine，T＝Thymidine，C＝Cytidine，U＝Uracil，I＝Inosine.根据IUPAC，混合物缩写如下R＝G或A，Y＝C或T，K＝G或T，W＝A或T，S＝C或G，M＝A或C，B＝C，G或T，D＝A，G或T，H＝A，C或T，V＝A，C或G，N＝A，C，G或T。
为确定(iii)中核酸分子序列的相同性(完全相同＝100％的相同性)，将观察一个更大的多聚核苷酸的部分序列。这些部分序列包括10个碱基。当两者的10个碱基全部相同时，即为完全相同。在此，胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基视为相同。所有较大的多聚核苷酸中的片段均可用作上述的部分序列。
当两个被比较的序列在10个核苷酸中有9个相同，或在20个中有18个相同，即具有90％的相同性。
例如两个包括20个核苷酸并在第5个碱基不同的多聚核苷酸。在序列比较中可发现6个相同的10-er的核苷酸和5个只是在一个碱基上不同的10-er的核苷酸。
此外，相同性可通过将单位以百分比表示等级来逐级确定。为确定相同性的程度也可对部分序列进行观察，这些部分序列包括至少事实上被使用的序列(比如作为引物)的长度或20个核苷酸。
作为示例将长度为100个核苷酸的A和长度为200个核苷酸的B进行比较。从多聚核苷酸B中可衍推出一长度为14个核苷酸的引物。为确定相同性的程度，将多聚核苷酸A和引物在它的整个长度上进行比较。若引物的序列在多聚核苷酸A中出现，但有一个碱基不同，即表示相同程度为13∶14(即92.3％)。
在第二个示例中，将上述的多聚核苷酸A和B进行总体比较，此时，将所有比较窗口的长度设置为20个核苷酸并确定它们的相同程度。若多聚核苷酸A和B的50-69号核苷酸除了55号外完全相同，则此片段的相同程度为19∶20(即95％)。
本发明方法与现有的微生物学上的鉴别方法相比迅速快捷，并可检测一个样品中可能存在的多个、最好是所有与酿造有关的微生物，如很少作为污染物出现的乳酸杆菌(Lactobacillus)或硒单胞菌属(Selenomonas)和嗜酶菌属(Zymophilus)的代表菌种，这些菌种迄今尚无法鉴别。本方法的鉴别范围广泛，可发现酿酒业中所有的污染危险。通过本方法可鉴别出啤酒样品、原料样品(麦芽糖、酵母、酒花和水)和半成品样品(麦芽浆、麦芽汁)中与酿造有关的微生物，即使其中的致啤酒污染的微生物含量很低。
与酿造有关的微生物在此首先是指细菌，尤其是上述的Lactobacillus brevis，Lactobacillus lindnereri，Lactobacillus casei，Lactobacillus paracasei，Lactobacillus coryniformis，Lactobacilluscurvatus，Pediococcus damnosus，Pediococcus inopinatus，Pectinatuscerevisiiphilus，Pectinatus frisingiensis，Pectinatus sp.DSM 20764，Megasphaera cerevisiae，Selenomonas lacticifex，Zymophilus paucivorans和Zymophilus raffinosivorans，和其它所有可在啤酒中发现的上文未提及的，但仍会在啤酒中繁殖的微生物，例如鉴别与酿造有关的Lactobacillaceae菌科的序列科中的Lactobacillus malefermentans，Lactobacillus buchneri，Lactobacillus parabuchneri，Lactobacillussanfrancisco，Lactobacillus delbrueckit，Leuconostoc mesenteroides，Pediococcus pentosacaeus和Lactococcus lactis。
本发明方法可鉴别的微生物不只限于已描述的可致啤酒污染的微生物。通过使用本发明中的核酸分子和方法还可以鉴别迄今不被视为啤酒污染菌的其它与酿造有关的微生物。分类学上较高单位(如目、科、属)层次上的阳性结果与分类学上较低单位(如种、亚种、个体)层次上的阴性结果的结合就共同表明这些非典型的与酿造有关的微生物的存在。
在本发明第一步中，将待检样品与至少包括两个一级核酸分子(引物)的组合接触。此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交。杂交通过引物与微生物核酸区域的偶合进行，此区域是一个至少部分互补的碱基序列。“保守”这一概念指不同分类学单位的种的核苷酸序列在进化上的可变性。如果比较两个任意的与酿造有关的微生物的相应序列片段，就可以判断出序列是可变的还是保守的。被比较的两个序列至少95％相同时即为保守，小于95％则为可变。与酿造有关的微生物的核酸的保守区域是指对所有与酿造有关的微生物(如上文定义)而言至少95％相同的区域。
在本发明所优选的操作方法中，保守区域存在于包括23S和5S基因的基因片段。此区域包括23S-rDNA和5S-rDNA之间的基因内间隔区，以及相邻的23S和5S-rDNA基因，并且涵盖了保守和高变的(即种特异性非常高)序列区域。原核细胞的核糖体一般包括三种不同的核酸成分，即5S、16S和23S-rDNA(核糖核酸)。这些核糖核酸的基因信息重复排列。上述单位的典型组合16S-23S-5S，此组合中基因由长度短的、高变的基因间区域，即间隔区相互联结。基因组中存在着很多这些单位，但其中的操纵子数目因种而变化。所有细菌的核糖体DNA特定片段中的DNA序列的高保守性，可用于设计非特异性的单聚核苷酸，即使在不知道待检微生物的单个DNA序列的情况下。本发明中的SEQ ID No.1-20序列(见表一)是与酿造有关的微生物中23S-5S间的间隔区，从其中可得出用于本方法的核酸分子。
本发明方法第一步中使用的，至少由两个一级核酸分子构成的组合的选择应使其可作为扩增反应中的引物，也就是说，一个核酸分子与目标DNA第一条链的第一个保守区域杂交，而另一个核酸分子与其互补链的另一保守区域杂交，在此，我们所期望的DNA目标区域被包括在内。两个核酸分子具有至少10bp，最好是15-30bp的长度。在本发明所优选的操作方法中，应使用至少由两个核酸分子构成的组合。在本发明最佳的操作方法中，应使用包括至少一个带有SEQ ID No.40-47序列(见表2)之一的核酸分子和至少一个带有SEQ ID No.48-54或SEQ ID No.55-59或SEQ ID No.60-72(见表2)序列之一的核酸分子的组合。
本发明方法第二步是扩增微生物核酸或其一部分，以产生至少一个扩增片段。扩增是指增加反应混合物中存在的核苷酸或其一部分的浓度。用于扩增核苷酸的方法包括PCR(US 4 683 195，US 4 683 202，US 4965 188)，“自动维持序列复制”(EP 329 822)，基于转录的扩增系统(EP310 229)和“β-RNA复制酶系统”(US 4 957 858)。在本发明所优选的操作方法中，应包括PCR反应。在本发明另一种优选的操作方法中，包括连接酶链反应或等温核酸扩增反应。
本发明方法第三步是将获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子(探针)接触。上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行特异性杂交，这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的，或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异的片段。上述的特异片段是指存在于这些科、属、种中的细菌的序列。
杂交指两个相同或相似的核苷酸片段(DNA、RNA、PNA)形成双链。若在一个单聚核苷酸和其相应的目标DNA，而非其它DNA的相应目标DNA之间存在一个稳定的杂交核酸，此时发生的杂交为特异性杂交。在本发明中，“与一个(i)中序列发生特异性杂交的序列”是指在严格条件下与(i)中序列杂交的序列。例如，杂交可在50℃条件下通过使用由2,5×SSC、2×Denhardts、10mM Tris和1mM EDTA构成的，pH值为7,5的杂交溶液发生。洗涤条件可为在20-50℃条件下用0,1×SSC到1,0×SSC、2×Denhardts、10mM Tris和1mM EDTA构成的，pH值为7,5的溶液中重复洗涤四次，每次一分钟。
在本发明所优选的操作方法中，应使用本发明中的一个或多个核酸分子作为二级核酸分子(探针)。共有区探针是指能和微生物核酸的高保守区域杂交，并且与所有与酿造有关的微生物的扩增产物发生反应的核酸分子。本发明中可作为共有区探针使用的核酸分子为SEQ ID No.40-70(见表2)的序列之一。
为鉴别与酿造有关的微生物的特定属，带有SEQ ID No.35-39或SEQ ID No.104-107(见表2)的序列之一的核酸分子可被优先作为二级核酸分子使用。探针的属特异性，指探针与待鉴别的属的代表物中尽可能大的组的所有分离物的DNA杂交的能力。
种特异性核酸探针，是指与待鉴别的种的所有分离物在相同的严格条件下杂交的核酸分子。本发明中可使用种特异性核酸分子SEQ IDNo.21-22，SEQ ID No.25-34，SEQ ID No.73-78，SEQ IDNo.80-85，SEQ ID No.87-97(见表2)。
SEQ ID No.23-24，SEQ ID No.79，SEQ ID No.86和SEQ IDNo.98-103是特例。探针SEQ ID No.23和SED ID No.79可用于鉴别Lactobacillus casei，Lactobacillus paracasei ssp.Paracasei菌种。探针SEQID No.24可用于鉴别Lactobacillus的两个亚种(即L.coryniformis ssp.Coryniformis和L.coryniformis ssp.torquens)。探针SEQ ID No.86可用于鉴别片球菌种Pediococcus damnosus，Pediococcus inopinatus和Pediococcus parvulus。这些探针的应用不包括其它与酿造有关的微生物。同样，探针SEQ ID No.98-103可用于鉴别所有与酿造有关的鉴别与酿造有关的Lactobacillaceae菌科的序列科的菌种。其它与酿造有关的微生物的种和属可被忽略。
本发明的最后一步是鉴别至少一个由扩增片段和按上文所述方法得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。
一级核酸分子(引物)和/或二级核酸分子(探针)应长为10个，最好至少为15-30个碱基。在本专利的操作过程中，一级核酸分子(引物)和/或二级核酸分子(探针)被修饰。此修饰是将10个相连的核苷酸中的至多20％，特别是10er片段中的1或2个核苷酸，通过细菌中非天然存在的核苷酸替代。
本发明操作方法应优先包括Consensus-PCR方法。在此法中，先复制微生物核酸或其一部分，然后通过使其与有标记的特异性探针进行杂交来鉴别上述分子。在Consensus-PCR方法中使用可从所有相关的个体、亚种、种和属中获得扩增产物的核酸分子。此扩增反应不能区分出微生物。对微生物的区分由其后的使用特异性探针的杂交反应完成。由此，可通过扩增反应和鉴别反应的一个简单组合同时区分出与酿造有关的微生物。
这样的扩增和鉴别反应可实现细菌鉴别过程的自动化，以提高对样品的处理能力。例如在此可使用PCR-ELISA鉴别方法。在此法中，相应的探针被固定在一个微量滴定板的孔内，然后仍在其中对标记的扩增产物进行杂交和鉴别。鉴别也可通过微排(Microarray)完成。此时，将很多探针固定其上从而快速简便地进行鉴别。
在本发明所优选的操作方法中，二级核酸分子(探针)被修饰和标记。此修饰和标记在常见的分析鉴别过程中产生一个可探测到的信号。此时，修饰可选用以下物质完成(i)放射性物质、(ii)染料、(iii)荧光物质、(iv)可固定在固定项上的物质和(v)可以与核苷酸分子直接或间接地，特别是借助抗体、抗原、酶和/或与酶亲和的物质或酶合物进行反应的物质。
本发明中的标记指将可直接或间接地鉴别的基团或可固定在一固定项的基团附着在核苷酸上。金属原子的、放射性的、有色的和荧光的基团可直接鉴别。免疫学的或酶学的基团，如抗体、抗原、半抗原或酶或酶的功能区，这些可间接鉴别的基团通过后续反应鉴别。可优先考虑使用的基团为半抗原。它被偶连在一个核苷酸上并可经此后的抗体反应鉴别出来。
本发明中的核酸分子可用于证明和/或鉴别和/或确定与酿造有关的细菌。本发明中的引物和/或探针也可用于鉴别啤酒外的其它饮料，酿造业以外的其它样品，如原料、起始酵母、环境样品、其它食物样品或临床样品中的细菌。
具体实施例方式
实施例1引起啤酒变质的细菌及其亲缘关系近的种的DNA目标序列的确定通过23S-rDNA和5S-rDNA的序列(NCBI基因数据库)比较分析，可获得用作确定序列的引物的杂交区域的、保守的基因区域。用标准方法从表1所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。在PCR反应中，使用在高保守区域杂交的引物获得所有待检细菌的扩增产物。下列引物用于扩增和其后的排序步骤引物1＝SEQ ID NO 475‘-AAG TGC TGA AAG CAT CTA AG-3‘引物2＝SEQ ID NO 555‘-GGC RRY GTC TAY TYT CSC-3‘PCR配方


PCR的循环温度

这些扩增产物在琼脂胶上分离，用QIAquick PCRGel Extraction试剂盒(Qiagen)纯化，然后用IRD-800标记引物在Long Read SequencerModell 4000L(LI-COR)上测序。由此得出的与酿造有关的微生物及其种系发育中亲缘关系近的种的23S/5S-rDNA-间隔区域的序列，经相互比较并确定出以下的序列区域
1.)在每一待检菌属的所有种中均可发现的，但同时与其它种属的相关区域相区别的序列区域。
2.)仅在待确定的菌种中可发现的，但同时与其它需鉴别或无需鉴别的细菌相区别的区域。上述1.)中所述的序列范围被定义为属特异性的单聚核苷酸的杂交位置。上述2.)中所述的序列范围被定义为种特异性的单聚核苷酸的结合位置。
实施例2用PCR鉴别引起啤酒变质的细菌I.扩增用标准方法从表1所列的细菌的纯培养物中分离基因组DNA。十进位稀释所制备的浓度为1fg/μl-1pg/μl的DNA可用于每个PCR反应。反应配方如下引物3＝SEQ ID NO 465‘-AAG GGC CAT CRC TCA ACG G-3‘引物4＝SEQ ID NO 485‘-TGT GTT CGiiAT GGG AAC AGG TG-3‘

PCR按下列条件和循环温度在Mastercycler(EPPENDORF)中进行

引物3(SEQ ID No.46)通过23S-rDNA的序列(NCBI基因数据库)比较分析确定。其在23S-rDNA的基因区域中的高保守序列片段杂交。结合位置位于与引物SEQ ID No.48、49测序的范围之外。
引物4(SEQ ID No.48)根据其自身的序列数据确定。引物2的杂交位置与5S-rDNA基因区域中的23S/5S间隔区相邻。
II.用PCR-EIISA方法检测检测可通过PCR-ELISA来完成。为此，对每一探针，将5μl的扩增产物与5μl的变性缓冲液(125mM NaOH，20mM EDTA，pH14)搅拌并在室温下培养15分钟。将2μmol生物素化的探针加入100μl杂交缓冲液(2,5×SSC，2×Denhardts溶液、10mM Tris、1mM EDTA，pH7,5)中，注入经Strepatavidin涂层的微量滴定板孔中并在50℃的杂交温度下预培养。在变性后，将变性液加入杂交液中。然后在杂交温度下进行30分钟培养。杂交完成后，将杂交液除去并用洗涤缓冲液1(0,1×SSC、2×Denhardts溶液、10mM Tris、1mM EDTA，pH7,6)在杂交温度下清洗四次，每次一分钟。然后，加入100μl根据生产说明稀释的连接了辣根过氧化物酶的抗地高辛抗体(Boehringer Mannheim)溶液。将连接物在洗涤缓冲液2(100mM Tris、150mM NaCl、0,05％Tween 20、0,5％阻隔剂、1μg/ml鱼精，pH7,6)中稀释。此后，在37℃条件下进行30分钟的抗体培养。然后用洗涤缓冲液2清洗四次(室温下)。在清洗后加入100μl POD基质(Boehringer Mannheim)并在室温下培养20分钟。最后，用100μl 0,5M H2SO4使染色反应停止并在450nm测量。
III.评估根据上述检测方法，通过使用相应的具有种、属特异性的探针对所有被检测的细菌和细菌组进行鉴别。属特异性的探针对片球菌(Pediococcus)而言是SEQ ID No.35，对梳状菌(Pectinatus)而言是SEQID No.36，对大孢菌(Megasphaera)而言是SEQ ID No.37，对硒单胞菌属(Selenomonas)而言是SEQ ID No.38，对嗜酶菌属(Zymophilus)而言是SEQ ID No.39.种特异性的探针对Lactobacillus brevis而言是SEQ IDNo.21，对Lactobacillus lindneri而言是SEQ ID No.22，对Lactobacilluscasei和paracasei而言是SEQ ID No.23，对Lactobacillus coryniformis而言是SEQ ID No.24，对Lactobacillus curvatus而言是SEQ ID No.25，对Pediococcus damnosus而言是SEQ ID No.26，对Pediococcusinopinatus而言是SEQ ID No.27，对Pectinafus cerevisiiphilus而言是SEQID No.28，对Pectinafus frisingiensis而言是SEQ ID No.29，对Pectinafussp.DSM 20764而言是SEQ ID No.30，对Megasphaera cerevisiae而言是SEQ ID No.31，对Selenomonas lacticifex而言是SEQ ID No.32，对Zymophilus paucivorans而言是SEQ ID No.33，对Zymophilusraffinosivorans而言是SEQ ID No.34。
作为对照，使用与所有待检测菌种的扩增物杂交的SEQ ID No.40和SEQ ID No.41的Consensus探针。其它Consensus探针的可能结合位置为SEQ ID No.42-45.SEQ ID No.40到45的探针由熟知的23S-rDNA和5S-rDNA的序列(NCBI基因数据库)比较获得。
当所使用的10fg基因组DNA测得的消光大于1时，则检测结果为阳性。PCR-ELISA方法的结果见表3。
附录1表1







表2

表2(续)

表2(续)

表2(续)

表3


序列表<110>BioteCon Diagnostics GmbH<120>用于检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此法的核酸分子<130>PCT1218-066<140><141><160>107<170>PatentIn Vet.2.1<210>1<211>267<212>DNA<213>Lactobacillus brevis<400>1tatatggaag taagacccct gagagatgat caggtagata ggctggaagt agcagcgccg 60tgaggcgtgg agcggaccag tactaatcgg tcgaggactt aaccaagtca acaacgtagt 120tgtttcgaga ataattgaat aatatctagt tttgagggaa gaagttctct tatagtgtgg 180tggcgatagc ctgaaggata cacctgttcc catgccgaac acagaagtta agcttcagca 240cgccgatagt agttggggga tcgcccc 267<210>2<211>326<212>DNA<213>Lactobacillus lindneri<400>2ccattcctat atggaagtaa gactcctgaa agatgatcag gtcgataggt tagaagtgga 60agcatagtga tatgtgaagc ggactaatac taatcagtcg aggacttaac caaggaagac 120acagggttaa atcaaagttg aacagagaag atattatcta gttttgagag aacgaagttc 180gctcaggctt atgaaaaata agcatagtgt ggtggcgata gcctgaagga tacacctgtt 240cccatgccga acacagaagt taagcttcag cacgccaaaa gtagttgggg gatcgccccc 300tgcgaggata ggacgatggt catagc 326<210>3<211>351<212>DNA<213>Lactobacillus casei<400>3ccattcctat atggaagtaa gacccctgag agatgatcag gtagataggc tggaagtgga 60agtgcagcga tgcatggagc ggaccagtac taatcggtcg aggacttaac caagtagagc 120gtgagcagga gcgcttagaa accggagcat aagcgggcct gagttcgttg gccgggtttt 180ggccaatgga ttcagggttc ttatgtggag gtttctgcga ctgcgaacgc gtttcgatga 240aatacactgg ttcccgacaa cacaaaaaca acaatgatag ccagttttga gagcgcaaag 300ttctcataag tgtggtggcg atagcaagaa ggatacacct gttcccatgc c 351<210>4<211>414<212>DNA<213>Lactobacillus paracasei<400>4ccattcctat atggaagtaa gacccctgag agatgatcag gtagataggc tggaagtgga 60agtgcagcga tgcatggagc ggaccagtac taatcggtcg aggacttaac caagtaagag 120tgtgagcagg agcggttaga aaccggagca taagcgggcc tgagcgtgat ggccgggctt 180tggccattgc ggtcagggtc cttatgtgca ggtttctgcg actgcgaaca cgtttcgatg 240acaagtacgt taagttcaag gcagcaatta aacaatgata gctagttttg agagcgcaaa 300gttctcataa gtgtggtggc gatagcaaga aggatacacc tgttcccatg ccgaacacag 360aagttaagct tcttcacgcc gagagtagtt ggtgggaaac tgcctgcgag gata 414<210>5<211>338<212>DNA<213>Lactobacillus paracasei<400>5ccattcctat atggaagtaa gacccctgag agatgatcag gtagataggc tggaagtgga 60agtgcagcga tgcatggagc ggaccagtac taatcggtcg aggacttaac caagtaagcg 120tgcaagcagg agcaggtttc tgcgactgcg aacacatttc gatgacaagt acgttaagtt 180caaggcagca attaaacgat gatagccagt tttgagagcg caaagttctc ataagtgtgg 240tggcgatagc aagaaggata cacctgttcc catgccgaac acagaagtta agcttcttca 300cgccgagagt agttggtggg aaactgcctg cgaggata 338<210>6<211>317<212>DNA<213>Lactobacillus coryniformis ssp.coryniformis<400>6ctcgagttga gatttcccat tcctttatgg aagtaagacc cctgagagat gatcaggtag 60ataggttgga agtggacgtg ccgtgaggca tggagcggac caatactaat cggtcgagga 120cttaaccaag tagcatgtac gtagtgttag tttaagggca aagaaatgaa tatccagttt 180tgagagcgca acgttctcag aaagtggtgt ggtggcgata gcaagaagga tacacctgtt 240cccatgtcga acacagaagt taagcttctt agcgccgaga gtagttgggg gagcaccccc 300tgcgaggata ggacgat317<210>7<211>317<212>DNA<213>Lactobacillus coryniformis ssp.torquens<400>7ctcgagatga gatttcccat tcctttatgg aagtaagacc cctgagagat gatcaggtag 60ataggttgga agtggacgtg ccgtgaggca tggagcggac caatactaat cggtcgagga 120cttaaccaag tagcatgtac gtggtgttag tttaagggca aagaaatgaa tatccagttt 180tgagagcgca acgttctcag aaagtggtgt ggtggcgata gcaagaagga tacacctgtt 240cccatgtcga acacagaagt taagcttctt agcgccgaga gtagttgggg gagcaccccc 300tgcgaggata ggacgat317<210>8<211>336<212>DNA<213>Lactobacillus curvatus<400>8acgcctcgag atgagatttc ccattccttt atggaagtaa gacccctgaa agatgatcag 60gtagataggc taggagtgga agtacagcga tgtatggagc ggactagtac taatcggtcg 120aggacttaac caaaggtgca atgttaggct tttgaaatga aatattactt attatgcagt 180tttgagagaa cgaagttctt ctcagtgcgc aagcacaaaa tagtgtggtg gcgatagcaa 240gaaggataca cctgttccca tgtcgaacac agaagttaag cttcttagcg ccgatagtag 300ttggtgggaa actacctgcg aggataggac gatggt 336<210>9<211>335<212>DNA<213>Pediococcus damnosus<400>9gatgagattt cccattccat ttatggaagt aagacccctg agagatgatc aggtagatag 60gttgggagtg gaagtgtagt gatacatgga gcggaccaat actaatcggt cgaggactta 120accacaaagt ggtgttctca agagaaggat tcgatattat ttagttttga gagaataaat 180ttctttcaca cgagccgcgt aagtggatcg gagaagtgtg gtgacgatag tgagaaggat 240acacctgttc ccatgtcgaa cacagaagtt aagcttctta acgccgagag tagttggggg 300atcgctccct gcgaggatag gacgatggtc aatag335<210>10<211>326<212>DNA<213>Pediococcus inopinatus<400>10agatgagatt tcccattcca tttatggaag taagacccct gagagatgat caggtagata 60ggttgggagt ggaagtgtag tgatacatgg agcggaccaa tactaatcgg tcgaggactt 120aaccacaaag tggtgttctc aaagagaaga tttcgatatt atttagtttt gagagaataa 180atttctttca cacgagccgc ggaagtggat cggagaagtg tggtgacgat agtgagaagg 240atacacctgt tcccatgtcg aacacagaag ttaagcttct taacgccgag agtagttggg 300ggatcgctcc ctgcgaggat aggacg 326<210>11<211>403<212>DNA<213>Pectinatus cerevisiiphilus<400>11aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacct gccttaagat gaggtttccc agagccgtaa 60ggcttggaag gcaccttgaa taagacgagg tagataggcc gggagtagaa gtacagtaat 120gtacgaagcg gactggtact aataagccga gagcttaact taaaatcatc gaaaaaaatg 180tttggtctga gatttcttct gtgaagtttt gagtgtgcaa gacactctgg ttgaagggca 240gggaacgtga gagcgtaaaa ctgcggactt tggctcaaag agttaaagca tctggtgacg 300atacctggat ggatccacct gttcccattc cgaacacagt agttaagcat ccacaggctg 360aaggtacttg gggggcgacc ccctgggaaa ataggacact gcc 403<210>12<211>434<212>DNA<213>Pectinatus frisingensis<400>12aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacca gctttaagat gaggtttccc agaacgcaag 60tttggaaggc accttgaaga agacgaggta gataggccgg gagtggaagt atggtgacat 120atgaagcgga ctggtactaa taagccgaga gcttaacttg atttcatcaa aaaagagaaa 180tgtttggtca gagattttct tctgtgaagt tttgagtgtg caagaacact cgagagtata 240taggtaaagg aaaagcagca gataagtttc ctggttactg tatataccgg ctgaggtgct 300gaggcactga aggccagaac atctggtggc gatacctgga tggatccacc tgttcccatt 360ccgaacacag tagttaagca tccacaggcc gaaggtactt ggggggcagc cccctgcgaa 420aataggacac cgcc 434<210>13<211>641<212>DNA<213>Pectinatus spec.DSM20764<400>13aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacct gccttaagat gaggtttccc agagccgtaa 60ggcttggaag gcaccttgaa gatgacgagg tagataggcc gggagtagaa gtatggtgac 120atacgaagcg gactggtact aataagccga gagcttaact taatttcatc tataaatgtt 180tggtcctgat ttcttctgtg aagttttgag tgtgcaagat cactcatgaa agtatatagg 240taaagggaaa gcagcagatt agttcctggt ttactttata tatgagcact aaggtgcaga 300aaagaacgtt tgaggaaacg cggcgttcgt aaactcactt tgcgtgctga ttatctcaat 360gctaaagcat taagataatt ttagaggaaa cgcgcgttca ctagcgttca ctctgcgtac 420tttatttcta agtgctgaag cactaagaag ggcaaggaaa cgcgtcgttc gcgatgctca 480ctttgcgtac ttcatctcta gactgctaaa gcagtaagat ctgaagcatc tggtggcgat 540acctggatgg atccacctgt tcccattccg aacacagtag ttaagcatcc acaggccgaa 600ggtacttggg gggcagcccc ctgcgagagt aggacatcgc c 641<210>14<211>495<212>DNA<213>Pectinatus spec.DSM20764<400>14aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacct gccttaagat gaggtttccc agagccgtaa 60ggcttggaag gcaccttgaa gatgacgagg tagataggcc gggagtagaa gtatggtgac 120atacgaagcg gactggtact aataagccga gagcttaact taatttcatc tataaatgtt 180tggtcctgat ttcttctgtg aagttttgag tgtgcaagat cactcatgaa agtatatagg 240taaaggggaa gcagattagt tcctggttta ctttatatat gagcactaag gtgcagaaaa 300gaacgtctaa ggaaacgcgg cgttcgtagg ctcactctgc gtacttcatc tctagactgc 360taaagcagta agatctgaag catctggtgg cgatacctgg atggatccac ctgttcccat 420tccgaacaca gtagttaagc atccacaggc cgaaggtact tggggggcag ccccctgcga 480aagtaggaca ccgcc 495<210>15<211>546<212>DNA<213>Megasphaera cerevisiae<400>15gcatctaagc gtgaaaccag cctagagatg aggtttctca ttacgaaagt aagtaaggtc 60ccatgaagac gacatggtag ataggccggg agtggacgta cagtaatgta tggagcggac 120cggtactaat agaccgagga cttgacttaa gcagggaacc cattttaaag aagcgaagcg 180acgcataaaa tggagtgagt cgcttatacc gaatcgcaga ttcggtaaag cagcggagaa 240taccaatgca gcggcaacac cagttagcat aaactaagcg gattcggagt gggtgaggga 300gtttcgtagc agcgtaggct aacccaacca ccgctttcga agaaggcgaa tggtttgaaa 360aagagtacat gcgaagaaac gacgaaagac tcacaaccaa aacatacaaa ctaagtagat 420gacattagag tcacaccgat tgttaagatc cgaaatactt ttcgatgtag ttgtcaggat 480acgaatcctg aaacgaattc agtggtgatg gctgcaggga tccacctgtt cccataccga 540acacag546<210>16<211>306<212>DNA<213>Megasphaera cerevisiae<400>16gcatctaacc gtgaaaccag cctagagatg aggtttctca ttacgaaagt aagtaaggtc 60ccatgaagac gacatggtag ataggccggg agtggacgta cagtaatgta tggagcggac 120cggtactaat agaccgagga cttgacttaa gcaaagaagc aatagaaaga accatgtaga 180tggtgtaaga gttagacggg tagttaaggt ccgaaatact tttcgatgta gttgtcagga 240tacgaatcct gaaacgaatt cagtggtgat ggctgcaggg accacctgtt cccataccga 300acacag306<210>17<211>449<212>DNA<213>Selenomonas lacticifex<400>17aagtgctgaa agcatctagg cgtgaagcct gtcccgagat gaagtatctc atggagtaat 60ccagtaagat tccttgaaga agacaaggta gataggttgg gagtgtaagc atcgtaaggt 120gttcagcgga ccaatactaa taaatcgagg gcttaacttt acagacctgt ccaagaagcg 180aagcggattg ggtaacaggt cgtatgcgaa aacatcccaa gaatcgagtc cgaagggcga 240agatgattgg cagatgttga ccgctaataa tctagaatgt ttcgatacaa tttttcttct 300gtatagtttt gagtggacat cgttcattca ataatatcca gtgacgatag ctgagtggta 360ccacctgttc ccataccgaa cacagtagtt aagcactcat acgccgaaag tacttgtctg 420gaaacgggct gcgagaatag gacgtcgcc 449<210>18<211>343<212>DNA<213>Selenomonas lacticifex<400>18aagtgctgaa agcatctaag cgtgaagcct gtcccgagat gaagtatctc atggagtaat 60ccagtaagat tccttgaaga agacaaggta gataggttgg gagtgtaagc atcgtaaggt 120gttcagcgga ccaatactaa taaatcgagg gcttatctta ataatctaga atgtttcgat 180acaatttttc ttctgtatag ttttgagtgg acatggttca ttcaataata tccagtgacg 240atagctgagt ggtaccacct gttcccatac cgaacacagt agttaagcac tcatacgccg 300aaagtacttg tctggaaacg ggctgcgaaa ataggacgcc gcc 343<210>19<211>395<212>DNA<213>Zymophilus raffinosivorans<400>19aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacca gccttaagat gaggtttctc acagagcaat 60ctggtaagac cccttgaaga agacaaggta gataggtcgg gagtggaagc gcagtaatgt 120gtgcagcgga ccgatactaa taggtcgagg gcttgactta aagccagaac gaaaactaaa 180atgcgaacat ttctttcttc tgtatagttt tgagagaaca aactcttaag atggagtagt 240ctgaggcgaa agcggaaggc agcgatatct aaaaaaagaa tatctggtag tgatagccaa 300gtggacccac ctgttcccat accgaacaca gtagttaagc acttgaacgt cgaaagtact 360tgggtggaaa cgccctgcga aaataggaca ccgcc395<210>20<211>395<212>DNA<213>Zymophilus paucivorans<400>20aagtgctgaa agcatctaag cgtgaaacca gccttaagat gaggtttctc acagagcaat 60ctggtaagac cccttgaaga agacaaggta gataggtcgg gagtggaagc gcagtaatgt 120gtgtagcgga ccgatactaa taggtcgagg gcttgactta aagccagaac gaattctaaa 180atgcgaacat ttctttcttc tgtatagttt tgagagaaca gactcttaag atgagcagtc 240tgaggcgaaa gctaaaggca gcgatatcta aaaaaaagaa tatctggtag tgatagccaa 300gtggacccac ctgttcccat accgaacaca gtagttaagc acttgaacgt cgaaagtact 360tgggtggaaa cgccctggga aaataggaca ccgcc395<210>21<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus brevis种特异性序列<400>21ccaagtcaac aacgtagttg t 21<210>22<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus lindneri种特异性序列<400>22gacacagggt taaatcaaag ttg23<210>23<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus casei和Lactobacillusparacasei种特异性序列<400>23aggtttctgc gactgcgaac20<210>24<211>25<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus coryniformis种特异性序列<400>24atgtacgtag tgttagttta agggc 25<210>25<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus curvatus种特异性序列<400>25cttctcagtg cgcaagcaca 20<210>26<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pediococcus damnosus种特异性序列<400>26gtgttctcaa gagaaggatt cg 22<210>27<211>27<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pediococcus inopinatus种特异性序列<400>27gttctcaaag agaagatttc gatatta 27<210>28<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus cerevisiiphilus种特异性序列<400>28tgagagcgta aaactgcgga ctt 23<210>29<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus frisingensis种特异性序列<400>29cagataagtt tcctggttac tg 22<210>30<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus spec.DSM 20764种特异性序列<400>30cactaaggtg cagaaaagaa cgt 23<210>31<211>26<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Megasphaera cerevisiae种特异性序列<400>31cttttcgatg tagttgtcag gatacg 26<210>32<211>25<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述selenomonas lacticifex种特异性序列<400>32gttcattcaa taatatccag tgacg25<210>33<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Zymophilus raffinosivorans种特异性序列<400>33aactcttaag atggagyagt ctg 23<210>34<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Zymophilus paucivorans种特异性序列<400>34actcttaaga tgagcagtct ga 22<210>35<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pediococcus属特异性序列<400>35agtstagtga tacatggagc g21<210>36<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus属特异性序列<400>36gtgaagtttt gagtgtgcaa ga 22<210>37<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Megasphaera属特异性序列<400>37gaccgaggac ttgacttaag ca 22<210>38<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Selenomonas属特异性序列<400>38tccagtgacg atagctgagt 20<210>39<211>25<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Zymophilus属特异性序列<400>39aagaatatct ggtagtgata gccaa25<210>40<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>40gtcgtgagac agttcggtc 19<210>41<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>41cytagtacga gaggaccggr r21<210>42<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>42gctaccctgg ggataacagg c21<210>43<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>43atcgacgggg aggtttssca c21<210>44<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>44cacctcgatg tcggctcrtc 20<210>45<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>45ccaagggttg ggctgttc18<210>46<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>46aagggccatc rctcaacgg 19<210>47<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述
Consensus-序列<400>47aagtgctgaa agcatctaag 20<210>48<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>48tgtgttcgii atgggaacag gtg 23<210>49<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>49tgtgttcgga atgggaacag gtg 23<210>50<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>50tgtgttcgaa atgggaacag gtg 23<210>51<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>51tgtgttcggt atgggaacag gtg 23<210>52<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>52tgtgttcgat atgggaacag gtg 23<210>53<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>53tgtgttcggc atgggaacag gtg 23<210>54<211>23<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>54tgtgttcgac atgggaacag gtg 23<210>55<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>55ggcrrygtcc taytytcsc 19<210>56<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>56ggcagtgtcc tactttccc 19<210>57<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>57ggcagcgtcc tactttcgc 19<210>58<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>58ggcagtgtcc tactttcgc 19<210>59<211>19<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>59ggcagcgtcc tactttccc 19<210>60<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>60gyttmrcttc yrdgttcg18<210>61<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>61gcttaacttc cgtgttcg18<210>62<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>62gcttaacttc tatgttcg18<210>63<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>63gcttaacttc tgtgttcg18<210>64<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>64gcttaacttc catgttcg18<210>65<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>65gcttaacttc cgggttcg18<210>66<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>66gcttaacttc taggttcg18<210>67<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-序列<400>67gcttaacttc tgggttcg18<210>68<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Consensus-下列<400>68gcttaacttc 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45<210>78<211>58<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus casei种特异性序列<400>78gcgtttcgat gaaatacact ggttcccgac aacacaaaaa caacaatgat agccagtt 58<210>79<211>29<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus casei和Lactobacillusparacasei种特异性序列<400>79ttagaaaccg gagcataagc gggcctgag29<210>80<211>46<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus paracasei种特异性序列<400>80gcgtgatggc cgggctttgg ccattgcggt cagggtcctt atgtgc 46<210>81<211>46<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus paracasei种特异性序列<400>81caagtacgtt aagttcaagg cagcaattaa acaatgatag ctagtt 46<210>82<211>44<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus coryniformis种特异性序列<400>82aaagaaatga atatccagtt ttgagagcgc aacgttctca gaaa 44<210>83<211>48<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Lactobacillus curvatus种特异性序列<400>83aggtgcaatg ttaggctttt gaaatgaaat attacttatt atgcagtt 48<210>84<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pediococcus damnosus种特异性序列<400>84gccgcgtaag tggatcggag aa 22<210>85<211>22<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pediococcus inopinatus种特异性序列<400>85gccgcggaag tggatcggag aa 22<210>86<211>25<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述鉴别Pediococcus damnosus，Pediococcusinopinatus和Pediococcus parvulus菌种的序列<400>86gagagaataa atttctttca cacga25<210>87<211>39<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus cerevisiiphilus种特异性序列<400>87aaaatcatcg aaaaaaatgt ttggtctgag atttcttct 39<210>88<211>25<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus cerevisiiphilus种特异性序列<400>88cactctggtt gaagggcagg gaacg25<210>89<211>39<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus frisingensis种特异性序列<400>89gatttcatca aaaaagagaa atgtttggtc agagatttt 39<210>90<211>33<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus frisingensis种特异性序列<400>90tatataccgg ctgaggtgct gaggcactga agg 33<210>91<211>36<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus spec.DSM 20764种特异性序列<400>91aatttcatct ataaatgttt ggtcctgatt tcttct36<210>92<211>54<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus spec.DSM 20764种特异性序列<400>92agattagttc ctggtttact ttatatatga gcactaaggt gcagaaaaga acgt54<210>93<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Pectinatus spec.DSM 20764种特异性序列<400>93aggaaacgcg gcgttcgtaa 20<210>94<211>56<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Selenomonas lacticifex种特异性序列<400>94taataatcta gaatgtttcg atacaatttt tcttctgtat agttttgagt ggacat 56<210>95<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Zymophilus raffinosivorans种特异性序列<400>95gaggcgaaag cggaaggcag cgat 24<210>96<211>24<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Zymophilus paucivorans种特异性序列<400>96gaggcgaaag ctaaaggcag cgat 24<210>97<211>37<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述Megasphaera cerevisiae种特异性序列<400>97aatcctgaaa cgaattcagt ggtgatggct gcaggga 37<210>98<211>20<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述鉴别与酿造有关的Lactobacillaceae菌科的序列<400>98tatggaagta agacccctga 20<210>99<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述鉴别与酿造有关的Lactobacillaceae菌科的序列<400>99agatgatcag gtagataggc t21<210>100<211>21<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述鉴别与酿造有关的Lactobacillaceae菌科的序列<400>100agatgatcag gtcgataggt 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1.检测样品中与酿造有关的微生物的方法。该方法包括下列步骤(a)将样品与至少包括两个一级核酸分子(引物)的组合接触。此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交；(b)扩增微生物核酸分子或其一部分，以产生至少一个扩增片段；(c)将在步骤(b)中获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子(探针)接触，上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行杂交，这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的，或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异的片段；(d)鉴别至少一个由扩增片段和从c)中得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。
2.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于是包括PCR扩增步骤的方法。
3.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于是又包括连接酶链反应的方法。
4.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于是又包括等温核酸扩增反应的方法。
5.根据上述权利要求1到4之一所述的检测方法，其特征在于是又对二级核酸分子进行修饰和标记的方法；此修饰和标记可选用以下物质完成(i)放射性物质，(ii)染料，(iii)荧光物质(iv)能够固定在固定项上的物质和(v)可以与核苷酸分子直接或间接地，特别是借助抗体，抗原，酶和/或与酶亲和的物质或酶合物进行反应的物质。
6.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于其中一级和/或二级核酸分子的长度至少为10个，最好为15-30碱基。
7.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于是对其中的一级和/或二级核酸分子进行过修饰的方法；此修饰是将10个相连的核苷酸中的至多20％，特别是10er片段中的1或2个核苷酸，通过细菌中非天然存在的核苷酸替代。
8.根据上述权利要求之一所述的检测方法，其特征在于保守区域存在于含有细菌的23S和5S基因的基因片段的方法。
9.作为探针和/或引物检测与酿造有关的微生物的核酸分子，其选取范围如下(i)包含SEQ ID NO 1-107的一个序列，或此序列中一长度为10个，最好是15到30个碱基的片段的核酸分子；(ii)与一个(i)中核酸分子发生特异性杂交的核酸分子；(iii)与一个(i)或(ii)中的核酸分子具有70％，最好至少90％的相同性的核酸分子；(iv)与一个(i)到(iii)中的核酸分子互补的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于是DNA或RNA的核酸分子。
11.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于是PNA的核酸分子。
12.根据权利要求9至11所述的核酸分子，其特征在于其中10个相连的核苷酸中的至多20％，特别是10er片段中的1或2个核苷酸，被细菌中非天然存在的核苷酸替代。
13.至少包括两个核酸分子的组合，该组合从以下选出(1)由至少两个权利要求9到12中所述的核酸分子组成的组合；(2)由至少一个带有SEQ ID-No.40到47序列之一的核酸分子，与另一个至少带有SEQ ID-No.48-54中或SEQID-No.55-59或SEQ ID-No.60-72序列之一的核酸分子的组合。
14.含有一个权利要求9到12中所述核苷酸分子和/或一个 13中的核酸分子组合的试剂盒。
15.根据权利要求1到8中所述的方法，其特征在于此方法中的步骤(a)中使用了至少两个按照权利要求13得出的核酸分子的组合。
16.根据权利要求1到8及权利要求15中所述的方法，其特征在于此方法中使用至少一个由权利要求9到12中得出的核酸分子作为二级核酸分子(探针)。
17.根据权利要求16中所述的方法，其特征在于此方法中使用至少一个带有SEQ ID No.35-39或98-107序列之一的核酸分子作为二级核酸分子(探针)。
18.根据权利要求16或17中所述的方法，其特征在于此方法中使用至少一个带有SEQ ID No.31-34或73-97序列之一的核酸分子作为二级或其它级的核酸分子(探针)。
19.应用权利要求9到12中所述的核酸分子和/或按照权利要求13得出的组合鉴别与酿造有关的细菌的方法。
20.应用权利要求9到12中所述的核酸分子鉴别和/或确定与酿造有关的细菌的方法。
21.应用一个带有SEQ ID No.35或SEQ ID No.86序列的核酸分子鉴别和/或鉴定和/或确定片球菌属(Pediococcus)中的细菌的方法。
22.应用一个带有SEQ ID No.36或SEQ ID No.104序列的核酸分子鉴别和/或鉴定和/或确定梳状菌属(Pectinatus)中的细菌的方法。
23.应用一个带有SEQ ID No.37或SEQ ID No.107序列的核酸分子鉴别和/或鉴定和/或确定大孢菌属(Megasphaera)中的细菌的方法。
24.应用一个带有SEQ ID No.38或SEQ ID No.105序列的核酸分子鉴别和/或鉴定和/或确定硒单胞菌属(Selenomonas)中的细菌的方法。
25.应用一个带有SEQ ID No.39或SEQ ID No.106列的核酸分子鉴别和/或鉴定和/或确定嗜酶菌属(Zymophilus)中的细菌的方法。
26.应用一个带有SEQ ID No.1、SEQ ID No.21或SEQ ID No.73-74序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus brevis菌群中的细菌的方法。
27.应用一个带有SEQ ID No.2，SEQ ID No.22或SEQ ID No.75-76序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacilluslindeneri菌群中的细菌的方法。
28.应用一个带有SEQ ID No.3，SEQ ID No.23或SEQ ID No.77-79序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus casei菌群中的细菌的方法。
29.应用一个带有SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.23或SEQID No.79-81序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus paracasei ssp.paracasei菌群中的细菌的方法。
30.应用一个带有SEQ ID No.6，SEQ ID No.24或SEQ ID No.82序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus coryniformisssp.coryniformis菌群中的细菌的方法。
31.应用一个带有SEQ ID No.7，SEQ ID No.24或SEQ ID No.82序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus coryniformisssp.torquens菌群中的细菌的方法。
32.应用一个带有SEQ ID No.8，SEQ ID No.25或SEQ ID No.83序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Lactobacillus curvatus菌群中的细菌的方法。
33.应用一个带有SEQ ID No.9，SEQ ID No.26，SEQ ID No.84或SEQID No.86序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Pediococcusdamnosus菌群中的细菌的方法。
34.应用一个带有SEQ ID No.10，SEQ ID No.27，SEQ ID No.85或SEQ ID No.86序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Pediococcus inopinatus菌群中的细菌的方法。
35.应用一个带有SEQ ID No.11，SEQ ID No.28或SEQ ID No.87-88序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Pectinatuscerevisiiphilus菌群中的细菌的方法。
36.应用一个带有SEQ ID No.12，SEQ ID No.29或SEQ ID No.89-90序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Pectinatusfrisingensis菌群中的细菌的方法。
37.应用一个带有SEQ ID No.13，SEQ ID No.14，SEQ ID No.30或SEQ ID No.91-93序列之一的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Pectinatus sp.DSM20764菌群中的细菌的方法。
38.应用一个带有SEQ ID No.15，SEQ ID No.16，SEQ ID No.31或SEQ ID No.97序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Megasphaera cerevisiae菌群中的细菌的方法。
39.应用一个带有SEQ ID No.17，SEQ ID No.18，SEQ ID No.32或SEQ ID No.94序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Selenomonas lacticifex菌群中的细菌的方法。
40.应用一个带有SEQ ID No.19，SEQ ID No.33或SEQ ID No.95序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Zymophilus rafinosivorans菌群中的细菌的方法。
41.应用一个带有SEQ ID No.20，SEQ ID No.34或SEQ ID No.96序列的核酸分子或其自身的，长度至少为10个，最好为15到30个碱基的片段以鉴别和/或鉴定和/或确定Zymophilus paucivorans菌群中的细菌的方法。
全文摘要
本发明涉及检测与酿造有关的微生物的方法和可用于此方法的核酸分子及其组合。此外,本发明还涉及用于鉴别和/或鉴定和/或确定与酿造有关的微生物的属或种的核酸分子及其组合的使用方法。为此,本发明目的在于提供检测啤酒及其酿造原料的微生物污染的最快速的方法和手段。此测试应包括鉴别所有可致啤酒污染的微生物。本发明通过以下步骤完成上述任务:(a)将样品与至少包括两个核酸分子(引物)的组合接触,此核酸分子与和酿造有关的微生物核酸的一个保守区域杂交;(b)扩增微生物的核酸分子或其一部分,以产生至少一个扩增片段。(c)将在步骤(b)中获得的扩增片段与至少一个二级的核酸分子(探针)接触,上述二级核酸分子与至少一个扩增片段进行杂交,这个扩增片段包括一个对于所有与酿造有关的微生物的,或对于一个或多个与酿造有关的微生物的科、属、种的微生物核苷酸的特异的片段;(d)鉴别至少一个由扩增片段和从c)中得出的二级核酸分子共同构成的杂交核酸分子。
文档编号G01N33/58GK1376206SQ00813331
公开日2002年10月23日 申请日期2000年9月8日 优先权日1999年9月24日
发明者马库斯·范德克, 亚力克山大·加什, 克纳利亚·柏克豪夫 申请人:生物技术检测股份有限公司