专利名称：西瓜花叶病毒的单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体。
背景技术：
西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)在分类上属于马铃暮Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus),此病毒被多种姆虫以非持久方式传播。该病毒主要危害西瓜和甜瓜等葫芦科植物，引起花叶病，在国内西甜瓜产区广泛发生，造成的损失为30% 50%，甚至造成绝产，已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一。目前植物病毒的检测方法主要包括生物学、血清学和分子生物学方法，而单克隆抗体由于其是针对单一抗原决定簇产生的，所以具有特异性好的优势，为植物病毒免疫学方法的应用奠定了基础。

发明内容
本发明的目的是提供一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体及应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No. 6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。本发明还提供了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No. 6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生。所述的单克隆抗体在检测西瓜花叶病毒抗原中的应用也是本发明保护的范围。所述的单克隆抗体在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用；或所述的单克隆抗体在制备检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用，上述应用均是本发明保护的范围。含有所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的试剂盒也是本发明保护的范围；或含有所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条也是本发明保护的范围。经筛选得到能稳定分泌的西瓜花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6，该杂交瘤细胞株6C6的分类命名为分泌西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2012年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.6100。本发明的实验证明，本发明研制的西瓜花叶病毒单克隆抗体的特异性好、效价高，与购自ATCC的3个西瓜花叶病毒分离物均起反应，具有较好的广谱性，应用于植物病毒血清学诊断试剂中，特异性好，避免了交叉反应。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的病毒和试剂如下南瓜,品种名一味,购自北京世农种苗；本生烟(Nicotiana benthamiana):公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献黄峰，陈青，陈红运，白静，李桂芬等，黄瓜绿斑驳花叶病毒低风险参照物质的研制，植物检疫，2009年第4期，第23卷，24-26页。昆诺藜(Chenopodium guinoa):公众可以从中国检验检疫科学研究院获得；参考文献李桂芬，朱水芳、周群等，侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物的鉴定，植物保护，2007年第33卷，第I期，54-56页。西瓜花叶病毒(Watermelonmosaic virus,缩写WMV),购自 ATCC,编号PV-27 ;西瓜花叶病毒，购自ATCC，编号PV-379 ;西瓜花叶病毒，购自ATCC，编号PV-511。接种在南 瓜上。马铃薯A 病毒(Potato virus A，缩写PVA)，购自 DSMZ，DSMZ 编号PV_0320，接种在本生烟(Nicotiana benthamiana)上。莴苣花叶病毒(Lettucemosaic virus,缩写LMV),购自 ATCC,编号PV_63,接种在昆诺藜(Chenopodium quinoa)上。
李痘病毒(Plum pox virus，缩写PPV)，购自DSMZ，编号PV_0213，接种在本生烟上。碱性磷酸酯酶标记的马抗小鼠酶标抗体购自中杉金桥公司，货号AP_2000。样品抽提缓冲液为0. 5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 5)，配方如下Na2HPO4 12H20146. 837gKH2PO412. 248g先加入800ml蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至1000ml。实施例I、西瓜花叶病毒的单克隆抗体的制备和生物学特性的测定一、西瓜花叶病毒的单克隆抗体的制备I、病毒繁殖与纯化病汁液的制备将购自ATCC的西瓜花叶病毒毒源(PV-27)接种在南瓜上，18天采收病叶，病叶加2倍体积的0. 5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 5，含0. 1%巯基乙醇)，匀浆，双层纱布过滤，低速离心(3750 X g, 15min)，取上清即为病汁液。将上述病汁液中加入2. 5%TRIT0N X_100、0. lmol/L氯化钠、4%PEG(分子量6000)，4°C搅拌3h，离心(18160 Xg，20min)。沉淀悬浮于0. 5mol/L磷酸盐缓冲液(pH7. 5，含0. 5mol/L尿素)中，4°C搅拌过夜，离心(2860Xg，15min)。取上清经20%蔗糖垫离心(210000 X g，2. 5h )，沉淀悬浮于0. 05mo 1/L磷酸盐缓冲液(pH7. 5 )中，4 °C搅拌3h，离心(2860 X g, IOmin),上清液即为纯化的西瓜花叶病毒制剂。2、小鼠免疫将纯化的西瓜花叶病毒制剂在与其同体积的弗氏完全佐剂中乳化，乳化后对8周龄的BALB/c小鼠做腹腔注射,每只小鼠IOOii g纯化病毒。2周后,将纯化的西瓜花叶病毒制剂在与其同体积的弗氏不完全佐剂中乳化作第二次腹腔注射，每只小鼠100 yg纯化病毒。2周后第三次免疫小鼠(同第二次)。融合前3d加强免疫,加强免疫是采用200 ii g纯化的西瓜花叶病毒制剂直接注射小鼠腹腔。3、杂交瘤细胞的筛选将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合,用纯化的西瓜花叶病毒制剂4ug/ml的浓度包被酶标板，采用间接ELISA进行测定。对阳性孔的细胞用有限稀释法克隆3次，使阳性率达100%，阳性克隆细胞及时冻存。经间接ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了 I株能稳定分泌西瓜花叶病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:8000。经筛选得到能稳定分泌的西瓜花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6，该杂交瘤细胞株6C6的分类命名为分泌西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已于2012年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.6100。4、单克隆抗体的制备将上述筛选得到的杂交瘤细胞株6C6 CGMCC No. 6100置于细胞培养基(含体积百分含量为20%的胎牛血清的DMEM培养基)中，放置在二氧化碳培养箱中培养72小时(96小时)，得到6C6培养上清，即为单克隆抗体。DMEM培养基，购自ATCC，货号30-2002 ;上述培养时间3天，培养条件温度37°C，二氧化碳浓度5%，pH 7. O。用G蛋白柱(G蛋白柱购自GE公司，产品目录号为17-0404-01)对6C6培养上清进行纯化(完全按照G蛋白柱的使用说明进行操作)，得到纯化单克隆抗体(浓度为0. 63mg/ml), -20°C保存。二、单克隆抗体生物学特性的测定I、效价的测定方法①用纯化西瓜花叶病毒4 U g/mL的浓度包被酶标板，37°C孵育2h，洗酶标板。②用含5%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封板，37°C孵育30min，洗酶标板。③将由上述一得到的6C6培养上清(单克隆抗体)按一定比例稀释加入到酶标板中，37°C孵育2h，洗酶标板。④加入I :1000稀释的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠抗体，37°C孵育2h。洗酶标板。⑤加入底物溶液，室温避光孵育60min后用酶标仪测定405nm波长下各孔的吸收值，结果见表I。表I为效价的测定结果
权利要求
1.保藏号为CGMCCNo. 6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。
2.由权利要求I所述的保藏号为CGMCCNo. 6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用。
5.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的试剂盒。
6.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测西瓜花叶病毒的胶体金快速检测试纸条。
全文摘要
本发明公开了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体。本发明提供的一种保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6。还提供了一种西瓜花叶病毒的单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.6100的西瓜花叶病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株6C6产生。本发明的实验证明，本发明研制的西瓜花叶病毒单克隆抗体的特异性好、效价高，与购自ATCC的3个西瓜花叶病毒分离物均起反应，具有较好的广谱性，应用于植物病毒血清学诊断试剂中，特异型好，避免了交叉反应。
文档编号G01N33/577GK102749450SQ20121018901
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者吕玉峰, 周琦, 张永江, 李建光, 李桂芬, 梁新苗, 汪万春, 程琳, 边勇, 邓丛良, 高文娜 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局