专利名称：细胞群和混合细胞群变化的检测的制作方法
细胞群和混合细胞群变化的检测优先权本申请要求保护下列临时申请的权益2009年5月15日提交的美国顺序号 61/178，787,2009年11月2日提交的美国顺序号61/257，345,2010年1月19日提交的美国顺序号61/296, 099,2010年3月18日提交的美国顺序号61/315，144和2010年4月12 日提交的美国顺序号61/323，070的权益，所有申请均通过引用以其整体结合到本文中。
背景技术：
细胞分析，特别是干细胞分析、原代细胞分析和混合细胞群分析，由于缺乏准确的实时测定例如粘附、细胞迁移和趋化、侵入基底膜或组织、分化、由细胞粘附介导的分化、由三维环境(3-D细胞培养)介导的分化和与不同细胞类型共培养介导的分化等生物过程的可用工具，目前在本领域中受到限制，特别是当细胞数稀少时。本文公开了使用包括干细胞、原代细胞和混合细胞群在内的活细胞，采用实时无标记检测解决这些问题中的每一个的方法。另外，用于分析的生物样品的制备可能耗时又复杂。活细胞的分离和操作是许多生物学和医学分析的起始步骤，包括癌细胞的分离和检测、稀悬液中细胞的浓缩、根据特定性质分离细胞以及用于分析的各种细胞的分离和定位。流式细胞术和荧光激活细胞分选仪(FACS)广泛用于细胞分选和细胞分析。然而， 这些方法花费大，需要可检测标记，可能损害细胞使之无法用于进一步分析，并且需要相对大的样品体积。此外，装置难以灭菌、机械方面复杂且只能由经过培训的人员操作和维护。 因此，需要可快速有效地分选、计数、检测和分析活细胞(包括活细胞混合群和低细胞数测定)的便宜装置用于生物科学研究和医学诊断。发明概述本发明的一个实施方案提供检测一个容器中两种或更多种细胞类型对刺激或试验试剂的不同反应的方法，其中两种或更多种细胞类型不含可检测标记。该方法包括将两种或更多种细胞类型加到一个容器中，其中所述容器包含比色共振反射生物传感器 (colorimetric resonant reflectance biosensor) @胃、白勺M帛 (grating-based waveguide biosensor)表面或介电薄月莫叠式生物7I专感器(dielectric film stack biosensor)表面，其中生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质，且其中一种或多种特异性结合物质可结合两种或更多种细胞类型的一种或多种。允许两种或更多种细胞类型与一种或多种特异性结合物质结合。检测两种或更多种细胞类型的不同反应。不同反应可以是两种或更多种细胞类型与一种或多种特异性结合物质连接的不同时间；由两种或更多种细胞类型呈现的对一种或多种特异性结合物质的不同细胞连接形态；和/或两种或更多种细胞类型对一种或多种特异性结合物质的不同连接强度。所述方法还可包括将两种或更多种细胞类型暴露于一种或多种试验试剂或刺激， 并检测两种或更多种细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应。不同反应可以是两种或更多种细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应强度；由两种或更多种细胞类型在响应一种或多种试验试剂或刺激时呈现的不同细胞形态；两种或更多种细胞类型随时间推移对一种或多种试验试剂或刺激的不同细胞反应；和/或者两种或更多种细胞类型随时间推移的不同反应动力学。所述方法还可包括将两种或更多种细胞类型暴露于第一试验试剂或第一刺激；检测两种或更多种细胞类型对第一试验试剂或第一刺激的反应；将两种或更多种细胞类型暴露于第二试验试剂或第二刺激，其中两种或更多种细胞类型中的一种细胞类型对第二试验试剂或第二刺激的反应是已知的；检测两种或更多种细胞类型对第二试验试剂或第二刺激的反应；在生物传感器上鉴定具有对第二试验试剂或第二刺激的已知反应的两种或更多种细胞类型中的一种细胞类型；并检测两种或更多种细胞类型的不同反应。一种或多种试验试剂或刺激可由生物传感器表面上存在的两种或更多种细胞类型的一种或多种细胞表达。本发明的另一个实施方案包括检测混合细胞群中第一细胞类型的存在情况的方法，其中混合细胞群中的细胞不含可检测标记。该方法包括将混合细胞群加到一个容器中， 其中所述容器包含比色共振反射生物传感器表面、基于光栅的波导生物传感器表面或介电薄膜叠式生物传感器表面，其中生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质。允许混合细胞群与一种或多种特异性结合物质结合，其中对于结合一种或多种特异性结合物质，第一细胞类型具有与混合细胞群的其它细胞不同的反应。检测混合细胞群的不同反应，其中通过它们的不同反应检测第一细胞类型的存在情况。不同反应可以是第一细胞类型与一种或多种特异性结合物质连接的不同时间；由第一细胞类型呈现的对一种或多种特异性结合物质的不同细胞连接形态；第一细胞类型对一种或多种特异性结合物质的不同连接强度；和/或第一细胞类型随时间推移的不同反应。可测定混合细胞群中第一细胞类型的百分比。本发明的又一个实施方案提供检测混合细胞群中第一细胞类型的存在情况的方法，其中混合细胞群中的细胞均不含可检测标记。该方法包括将混合细胞群加到一个容器中，其中所述容器包含比色共振反射生物传感器表面、基于光栅的波导生物传感器表面或介电薄膜叠式生物传感器表面，其中生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质。允许混合细胞群与一种或多种特异性结合物质结合。将混合细胞群暴露于一种或多种试验试剂或刺激，其中与混合细胞群中的其它细胞相比，第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激具有不同反应。检测第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应，其中如果检出不同反应，则第一细胞类型存在于细胞的混合物中。不同反应是第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应强度；第一细胞类型在响应一种或多种试验试剂或刺激时呈现的不同细胞形态；第一细胞类型随时间推移对一种或多种试验试剂或刺激的不同细胞反应；和/或第一细胞类型随时间推移的不同反应动力学。可测定混合细胞群中第一细胞类型的百分比。一种或多种试验试剂或刺激可由存在于生物传感器表面上的混合细胞群的一种或多种细胞表达。本发明的又一个实施方案提供检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应的方法。该方法包括将一种或多种胞外基质配体固定在比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上，其中第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并且将第一细胞群加到生物传感器上。 或者，可将第一细胞群与一种或多种胞外基质配体混合，其中第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上。将凝胶、凝胶样物质或第二细胞群加到生物传感器表面上。将一种或多种试验试剂或刺激加到凝胶或凝胶样物质或第二细胞群中。检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应。一种或多种试验试剂或刺激可以是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。第二细胞群可以是上皮细胞群或内皮细胞群。第一细胞群可以是干细胞群。可以不使用检测标记。所述方法还可包括检测第二细胞群的反应。可通过在一个或多个期间内监测波长峰值(peak wavelength value) 或者通过在一个或多个期间内监测有效折射率变化，来检测第一细胞群或第二细胞群对一种或多种刺激的反应。可实时检测第一细胞群或第二细胞群的反应。本发明又一个实施方案提供检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应的方法。该方法包括将一种或多种试验试剂或刺激加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；将基底膜基质、藻酸胶、胶原凝胶、琼脂糖凝胶、合成水凝胶或第二细胞群加到生物传感器表面上；将第一细胞群与一种或多种胞外基质配体混合，其中第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并且将第一细胞群加到生物传感器上；检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应。一种或多种试验试剂或刺激可以是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。第二细胞群可以是上皮细胞群或内皮细胞群。第一细胞群可以是干细胞群。 可以不使用检测标记。所述方法还包括检测第二细胞群的反应。可通过在一个或多个期间内监测波长峰值或者通过在一个或多个期间内监测有效折射率变化，来检测第一细胞群或第二细胞群对一种或多种刺激的反应。可实时检测第一细胞群或第二细胞群的反应。本发明的另一个实施方案提供检测第一细胞群分化的方法。该方法包括将第一细胞群加到比色共振反射生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上，其中生物传感器具有两个或更多个表面区域，其中每个表面区域具有共振值不同于其它表面区域的光栅； 检测两个或更多个表面区域中每一个的两个或更多个波长峰值；并检测生物传感器表面上第一细胞群的分化。可实时检测分化。可在检测两个或更多个表面区域中每一个的两个或更多个波长峰值之前，将一种或多种试验试剂或刺激加到生物传感器上。可检测一个或多个波长峰值，之后将一种或多种试验试剂或刺激加到生物传感器上。一种或多种试验试剂或刺激可以是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。第一细胞群可以是干细胞群。可以不使用检测标记。本发明又一个实施方案提供生物表达特征分析(biological expression profiling)以鉴定对特定干细胞群有特异性的生物反应特征(biological response signature)的方法。该方法包括将一种或多种胞外基质配体固定在比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的两个或更多个表面上，其中干细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并将干细胞群加到生物传感器的两个或更多个位置上。或者，可将干细胞群与一种或多种胞外基质配体混合， 其中干细胞具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的两个或更多个表面上。将生物传感器的两个或更多个表面暴露于两种或更多种试验试剂或刺激。在生物传感器的两个或更多个表面的每一个上检测干细胞对试验试剂或刺激的反应。鉴定特定干细胞群特有的对两种或更多种试验试剂或刺激的生物反应特征。可实时进行干细胞的反应检测。本发明的又一个实施方案提供用于筛选候选化合物调节细胞分化的能力的方法。 该方法包括将一种或多种细胞类型加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；诱导一种或多种细胞类型分化；并通过比较候选化合物存在或不存在时的波长峰值或有效折射率变化，来检测候选化合物存在或不存在时细胞分化的变化。与候选化合物不存在时的细胞分化活性相比，在化合物存在时细胞分化活性的变化表示候选化合物调节细胞分化的能力。细胞分化活性的变化可以是细胞分化活性提高、细胞分化活性降低、细胞分化活性受抑制、干细胞自我更新增加或减少和/或分化细胞类型改变。细胞分化活性的变化可以是胶原产生的增加或减少。细胞分化活性的变化可以是矿化结节(mineralized nodule)形成的增加或减少。一种或多种细胞类型可以是干细胞。一种或多种细胞类型可以是间充质干细胞。可通过检测细胞大小、细胞形状、细胞膜电位、细胞代谢活性或细胞对信号的反应性的变化，来检测细胞分化活性的改变。候选化合物可以是抑制性核酸分子。本发明的又一个实施方案提供用于筛选候选化合物调节细胞分化的能力的方法。 该方法包括将一种或多种细胞类型加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；诱导一种或多种细胞类型分化；并通过比较候选化合物存在或不存在时的波长峰值或有效折射率，来检测候选化合物存在或不存在时一种或多种细胞分化产物的产生。与候选化合物不存在时一种或多种细胞分化产物相比，候选化合物存在时一种或多种细胞分化产物的变化表示候选化合物调节细胞分化的能力。细胞分化产物可以是胶原或矿化结节。一种或多种细胞类型可以是干细胞。一种或多种细胞类型可以是间充质干细胞。候选化合物可以是抑制性核酸分子。本发明的另一个实施方案提供包含以下的比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面固定在生物传感器光栅表面上或与生物传感器光栅表面缔合(associate)的一种或多种特异性结合物质； 和在一种或多种特异性结合物质上的一层凝胶或凝胶样物质。生物传感器光栅表面可形成盛液容器的内表面。盛液容器可以是微量滴定板或微观流体槽。本发明又一个实施方案提供包括一个或多个比色共振反射生物传感器光栅表面、 一个或多个基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面和一个或多个凝胶或凝胶样物质的容器的试剂盒。试剂盒还可包括装有一种或多种特异性结合物质的容器。一个或多个比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面可包含固定在生物传感器光栅表面上或者与生物传感器光栅表面缔合的一种或多种特异性结合物质。本发明的又一个实施方案提供用于在比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面上检测特异性结合物质和结合配偶体之间的反应的改进方法。该方法包括将一种或多种特异性结合物质加到生物传感器光栅表面上，使得一种或多种特异性结合物质固定在生物传感器光栅表面上或者与生物传感器光栅表面缔合，并将凝胶或凝胶样物质加到生物传感器表面上。本发明的又一个实施方案提供从混合细胞群中分选两种或更多种细胞类型并检测分选细胞对刺激、培育或试验试剂的反应的方法，其中分选和检测发生在一个生物传感器表面上。该方法包括将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种类型的特异性结合物质固定在其一个表面上，且其中两种或更多种特异性结合物质可潜在结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型；从生物传感器的一个表面上洗去未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并在生物传感器表面上分选；将一种或多种结合细胞类型暴露于刺激、培育或试验试剂；并检测一种或多种结合细胞类型对刺激、培育或试验试剂的反应。两种或更多种特异性结合物质可包含一种或多种胞外基质蛋白与一种或多种其它特异性结合物质的组合。一个生物传感器表面可以是微量滴定板孔的底部。两种或更多种细胞类型和试验试剂不含可检测标记。本发明的另一个实施方案提供从混合细胞群中分选一种或多种细胞类型并且在一个生物传感器表面上从一种或多种细胞类型中检测胞内分析物的方法。该方法包括将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种特异性结合物质固定在其一个表面上，其中两种或更多种特异性结合物质包含(i)特异性结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型的第一特异性结合物质和(ii)特异性结合一种或多种细胞类型的一种或多种胞内分析物的第二特异性结合物质；洗去生物传感器表面上的未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并且在生物传感器表面上分选； 使一种或多种结合细胞类型溶解或透化；洗去生物传感器表面上的任何未结合的分析物； 并检测固定在生物传感器表面上的胞内分析物。第一特异性结合物质可包含一种或多种胞外基质蛋白。可在使一种或多种结合细胞类型溶解或透化之前将细胞培育一段时间，或者暴露于刺激，或者暴露于试验试剂。一个传感器表面可以是微量滴定板孔的底部。混合细胞群和两种或更多种特异性结合物质不含可检测标记。本发明又一个实施方案提供从混合细胞群中分选一种或多种细胞类型并在一个生物传感器表面上检测一种或多种细胞类型的分析物的方法。该方法包括将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种特异性结合物质固定在其一个表面上，其中两种或更多种特异性结合物质包含(i)特异性结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型的第一特异性结合物质和(ii)特异性结合一种或多种细胞类型的一种或多种分析物的第二特异性结合物质；洗去生物传感器表面上的未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并且在生物传感器表面上分选；将试验试剂加到细胞中，或培育细胞，或使细胞暴露于刺激或其组合；并检测固定在生物传感器表面上的分析物。第一特异性结合物质可以是一种或多种胞外基质蛋白。一个生物传感器表面可以是微量滴定板孔的底部。混合细胞群和两种或更多种特异性结合物质不含可检测标记。附图简述

图1表示SH-SY5Y细胞对比色共振反射生物传感器微孔板上的毒蕈碱配体、P2Y配体和β抑制蛋白配体的特征反应。图2表示当细胞位于包含PBS/卵清蛋白、纤连蛋白、胶原或层粘连蛋白的比色共振反射生物传感器上时，mP-M5和mP-M4细胞对以下3种配体的反应乙酰胆碱、卡巴胆碱和毛果芸香碱。图3A表示由与比色共振反射生物传感器连接的M5细胞产生的信号。图表示细胞与生物传感器连接后30分钟完成的扫描。图4A表示细胞顶面(连接比色共振反射生物传感器的细胞的相对面)的细胞相差图，而图4B表示细胞底面(结合生物传感器的细胞的一面)的相同细胞的连接信号。图5A表示M5细胞对比色共振反射生物传感器的连接反应。图5B表示M5细胞对加入卡巴胆碱的反应。图6表示加到比色共振反射生物传感器上的M4细胞和RBL亲代细胞的混合群。M4 细胞具有比RBL细胞多的卡巴胆碱受体。然后将ΙΟμΜ卡巴胆碱加入细胞中。中图表示卡巴胆碱加入细胞中后30分钟3 1比率的Μ4细胞RBL细胞。右图表示加入卡巴胆碱后 30分钟1 3比率的Μ4细胞RBL细胞。图6的中图显示比右图多的信号，因为存在的 Μ4细胞比RBL细胞多，各Μ4细胞具有更多的卡巴胆碱受体。图7表示与包含卵清蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原的比色共振反射生物传感器连接的大鼠MSC细胞。图8表示将细胞加到比色共振反射生物传感器上后不久(图8Α)和在生物传感器上16小时后(图8Β)的大鼠MSC细胞。图9表示大鼠MSC细胞在30小时内在比色共振反射生物传感器表面上的移动。左边的箭头(指向深色斑点)表示细胞在其与生物传感器表面连接后不久的所在位置，右边的箭头(指向浅色斑点)表示细胞在与生物传感器表面连接后30小时的所在位置。图10表示使用比色共振反射生物传感器微孔板和BIND READER所得的，THP-I 细胞(图10A)和CEM细胞(图10B)对不同浓度的SDF-I α的反应。图IlA表示MSC细胞对比色共振反射生物传感器微孔板上的SDF-I α的反应。图 IlB表示MSC细胞(384孔微量培养板上7，000个细胞)对SDF-I α和抑制剂(CXCR4封闭性抗体)的反应。图12表示用纤连蛋白包被的生物传感器上的大鼠MSC细胞。在3小时和16小时在比色共振反射生物传感器上检测细胞连接(左图)。将连接信号清零后，用或不用SDF-I α 刺激细胞(右图)。细胞的移动可参见图12右图。较深的斑点是检测前细胞所处位置，而较浅的斑点是当检出反应物时细胞所处位置。如果不将刺激加到细胞中，则可观察到细胞有些移动；然而，如果将SDF-I α加入细胞中，则观察到随同细胞在生物传感器上散开的细胞移动。图13Α-Β表示图12右图的放大图。在发生移动和/或细胞粘附的细胞边缘上观察到信号增强。增强的信号与细胞跨过生物传感器移动时的细胞前缘有关，正如通过延时成像证实的一样。图 14 表明 BIND READER(图 14A)和 BIND SCANNER(图 14B)的读数。观察至Ij 信噪比改进约7-10倍。图15表示升离测定(lift-off assay)示意图。图16表示与对照孔相比，在MATRIGEL 基底膜基质存在下MSC细胞升起离开生物传感器。可容易地用MATRIGEL 涂层鉴定MSC连接信号。与对照孔相比，MSC显示升起离开生物传感器的趋势。这通过图16中黑色部分所显示的负PWV变化来证实。
图17表示在用胶原包被的生物传感器上被诱导分化为成骨细胞的大鼠MSC。到第 14天，细胞矿化并产生骨。图18表示在用胶原包被的生物传感器上被诱导分化为成骨细胞的大鼠MSC。到第 14天，细胞矿化并产生骨。使用茜素红染料证实细胞确实产生了骨。自前一日对图像基线化。图19A表示图18的第17天图的近视图。白色区域是成骨细胞的矿化。图19B表示相同细胞部分的相差显微图。相差显微图未显示细胞分化。图20表示以100个细胞/孔接种在384孔比色共振反射生物传感器上并用成骨细胞分化培养基处理的大鼠MSC(Invitrogen)。在BIND SCANNER上获得每日图像，并基线化到至第0天细胞连接信号。正如茜素红染色的平行孔所表明的一样，在骨样矿物质沉积在传感器表面时，观察到逐步和稳步的PWV变化(约25nM)(图20A)。一种糖原合酶激酶 3 (GSK3 β )的抑制剂加快MSC-成骨细胞分化。图20Β表示由GSK3i3引起的加速分化的检测。图20C表明在检测矿化时BIND SCANNER比茜素红染色敏感。图21表示BINDTM生物传感器上分化的MSC。表明胶原形成在矿化之前，这与正常的骨形成一致。图22表示在有或没有GSK3 β抑制剂时在成骨细胞分化培养基中培养1_19天的大鼠MSC。每天收集BIND 图像，并基线化至前一天的测量，从而提供有关矿化率的信息(图 22A)。图22B表示在BIND SCANNER上测定的PWV变化的定量(+/_标准差，η = 12孔)。图23表示阻断MSC迁移的抗体，还显示孔中心非常亮的长方形的正PWV变化，表示PDGF-BB抗体与点在生物传感器上的PDGF-BB的相互作用。图23中，“趋化因子X”是 PDGF-BB ；“趋化因子X nAb”是对PDGF-BB有特异性的中和抗体。图24表示接种在384孔比色共振反射生物传感器板上的人MSC。将细胞用成骨细胞分化混合物处理。每日测量PWV。给出了未处理细胞(Ctrl)和成骨细胞分化的(OS-DifT) 细胞的代表性孔。图25表示当将对GSK3 β和ADK有特异性的siRNA分子在临分化前转染至人MSC 中时，在无标记测定中在BIND SCANNER上检测的加快的成骨细胞分化。图中给出第12天几个处理条件的样品孔。图26对图25所示结果量化。图27表示以1 1比率混合并接种在比色共振反射生物传感器孔中的RBL和M5/ RBL细胞。使细胞与生物传感器连接，并在BIND SCANNER上检测连接反应。结果见图27A 和图27B。细胞与乙酰胆碱的反应见图27C和图27D。发明详述本文使用的单数形式包括复数对象，除非文中另有明确说明。生物传感器本发明的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如Cunningham 等， “ Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique (作为直接生物化学测定技术的比色共振反射)，“Sensors and Actuators B，第81卷，第316-328页，2002年1月5日；美国专利公开号2004/0091397、美国专利号 7，094，595、美国专利号7，264，973。比色共振生物传感器不是表面等离子共振(SPR)生物传感器。SI^R生物传感器具有薄金属层，例如银、金、铜、铝、钠和铟。金属必须具有能够与合适波长的光共振的导带电子。暴露于光的sra生物传感器表面必须为纯金属。氧化物、硫化物和其它薄膜干扰SPR。比色共振生物传感器没有金属层，而是具有高折射率材料的介电涂层，例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽和氮化硅。本发明的生物传感器还可以是介电薄膜叠式生物传感器(参见例如美国专利号 6，320，991)、衍射光栅生物传感器(diffraction grating biosensor)(参见例如美国专利号 5，955，378、6，100，991)和衍射反常生物传感器(diffraction anomaly biosensor)(参见例如美国专利号5，925，878、RE37，473)。介电薄膜叠式生物传感器包含在具有开槽表面或光栅表面的基底上形成的一叠介电层(参见例如美国专利号6，320，991)。生物传感器从至少一个入射角接受光，部分光在介电层内传播。通过检测光学性反常的变化(即共振峰或谷(notch)的变化)来测定样品介质的参数。可以共振角的变化或共振波长的变化来检测光学性反常的变化。可用于本发明方法的其它生物传感器包括描述于例如美国专利号5，738，825的基于光栅的波导生物传感器。基于光栅的波导生物传感器包含将入射光场连接(incouple) 到波导薄膜中以产生衍射光场的波导薄膜和衍射光栅。检测波导薄膜的有效折射率的改变。其中波必须在装置内传送相当距离的装置，例如基于光栅的波导生物传感器，缺乏比色共振反射生物传感器的空间分辨率。比色共振反射生物传感器可供在生物传感器表面上测定生化相互作用而又无需使用荧光标签、比色标记或任何其它类型的检测标签或检测标记。介电薄膜叠式生物传感器的运作与比色共振反射生物传感器的非常相似。生物传感器表面含有这样的光学结构，其被设计成当用准直光和/或白光照射时，只反射或透射窄带波长(“共振光栅效应 (resonant grating effect)”)。对于反射，窄波长带描述为波长“峰”。对于透射，窄波长带描述为波长“谷(dip)”。当将材料(例如生物材料)沉积到或从生物传感器表面去除时， “波长峰值” (PWV)改变。还可检测波长谷。使用读出仪器用准直光和/或白光照射生物传感器表面的独特位置，并收集反射光。将收集的光集中到波长分光计中以测定PWV。可通过使结构(生物传感器面向上)与无底微量滴定板盒(microtiter plate cartridge)底部结合将生物传感器整合到标准的一次性实验器材(例如微量滴定板)上。 对于与现有的微量滴定板处理设备(例如混合器、培养箱和液体分配装置)的兼容性，生物传感器与通用实验板盒的整合是合乎需要的。还可将生物传感器与例如微观流体、宏观液体或微阵列装置整合(参见例如美国专利号7，033，819、美国专利号7，033，821)。生物传感器可与本领域众所周知的方法一起使用(参见例如Methods of Molecular Biology，由 Jun-Lin Guan 主编，第 294 卷，Humana Press, Totowa, New Jersey)，以在暴露于一种或多种胞外试剂时，监测细胞行为变化或这些变化的缺乏。比色共振反射生物传感器包含子波长结构化表面(subwavelength structured surface, SWS)，并且是可模拟薄膜涂层的效果的非传统衍射光学类型(Peng和Morris， "Resonant scattering from two-dimensional gratings (二维光栅的共振散身寸)，，，J. Opt. Soc. Am. A，第 13 卷，第 5 期，第 993 页，1996 年 5 月；Magnusson和 Wang，“New principle for optical filters (滤光器的新原理)，” Appl. Phys. Lett.，61，第 9 期，第 1022 页， 1992 年 8 月；Peng 禾口 Morris, "Experimental demonstration of resonant anomaliesin diffraction from two-dimensional gratings ( 二维光栅衍射的共振异常的实验证明)，”0ptics Letters，第21卷，第8期，第549页，1996年4月)。SWS结构含有一维、二维或三维光栅，其中光栅周期比入射光波长的小，使得不允许反射和透射零阶以外的衍射阶次传播。不支持横向波导模的传播。更确切地说，波导模共振效应发生在距任何光子进入生物传感器结构的点约3微米的十分有限的区域内。可通过将分子例如配体、特异性结合物质、细胞或结合配偶体或两者加到生物传感器的上表面来调节比色共振反射生物传感器的反射光或透射光。所加入的分子增加入射辐射通过结构的光程长度，并因此修正可能发生最大反射比或透射比的波长。在一个实施方案中，设计了当用白光和/或准直光照射时反射单波长或窄带(例如约Ι-lOnm)波长(“共振光栅效应”)的比色共振反射生物传感器。当将物质沉积在生物传感器表面上时，由于生物传感器上显示的光的光程改变而使反射波长改变。检测系统由例如光源和分光计组成，光源通过例如光纤探头以正入射照射生物传感器的某一小点，分光计通过例如第二光纤探头同样以正入射收集反射光。由于在激发/ 检测系统和生物传感器表面之间不发生实体接触，所以不需要特殊的耦合棱镜，且生物传感器可容易地适于任何常用的测定平台，包括例如微量滴定板。可在几毫秒内进行一次分光计读数，因此可快速测定生物传感器表面上平行发生的大量的分子相互作用，并实时监测反应动力学。比色共振反射生物传感器包含例如光栅，其由高折射率材料、支持光栅的基底层和任选一种或多种固定在基底层相对面的光栅表面上的特异性结合物质或接头组成。 高折射率材料具有比基底层高的折射率。参见例如美国专利号7，094，595、美国专利号 7，070，987。任选覆盖层覆盖光栅表面。光栅涂有高折射率介电薄膜，该薄膜可由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽、氮化硅和二氧化硅的材料组成。具有光学特征的光栅的截面轮廓可包含任何周期性重复功能，例如“方波”。光栅还可包含选自以下形状的重复图式线形(一维)、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六边形。本发明的比色共振反射生物传感器还可包含由例如塑料或环氧树脂组成的光栅，所述光栅用高折射率材料包覆。线性光栅(即一维光栅)具有其中照射光偏振垂直于光栅周期定向的共振特性。 比色共振反射生物传感器还可包含例如二维光栅，例如孔或方格的六边形阵列。也可使用其它形状。线性光栅具有与六边形阵列光栅相同的节距(Pitch)(即高折射率区和低折射率区之间的距离)、周期、层厚度和材料性质。然而，为了与光学结构共振耦合，光必须垂直于光栅线偏振。因此，必须将以其偏振轴垂直于线性光栅定位的偏振滤波器插入发光源和生物传感器表面之间。因为仅少部分的发光源被正确的偏振，与六边形光栅相比，需要较长的积分时间收集等量的共振反射光。光栅还可包含例如“台阶式”轮廓，其中将单一固定高度的高折射率区包埋在较低折射率的覆盖层中。高折射率和低折射率的交替区提供与生物传感器顶面平行的光波导。本发明的比色共振反射生物传感器还可包含基底层相对面的光栅表面上的覆盖层。如果覆盖层存在，则将一种或多种特异性结合物质固定在光栅相对面的覆盖层表面上。 优选覆盖层包含具有比包含光栅的材料低的折射率的材料。覆盖层可由例如玻璃(包括旋涂玻璃(spun-on glass，S0G))、环氧树脂或塑料组成。
例如，可将符合生物传感器的折射率要求的各种聚合物用于覆盖层。由于其有利的折射率、易于操作和采用多种玻璃表面活化技术用特异性结合物质激活的便利，因此可使用S0G。如果生物传感器表面的平直度对特定系统设置不是问题，则SiN/玻璃的光栅结构可直接用作敏感表面，可采用与在玻璃表面上一样的方法对其进行活化。可获得共振反射而又不使光栅上的覆盖层偏振。例如，生物传感器可只含有用高折射率材料的结构化薄膜层涂覆的基底。无需使用偏振覆盖层，周围的介质(例如空气或水)便会充满光栅。因此，特异性结合物质被固定在暴露于特异性结合物质的光栅的所有表面上的，而不只是在上表面上的生物传感器上。总的来说，比色共振反射生物传感器可用容纳每个偏振角的光的白光和/或准直光照射。偏振角相对于生物传感器光栅中的重复特征的方向决定共振波长。例如，由一组重复线条和间隙组成的“线性光栅”(即一维光栅)生物传感器具有可产生单独共振反射的两种光偏振。垂直于线条偏振的光称为“S偏振”，而平行线条偏振的光称为“P偏振”。入射光的S和P分量两者在未过滤发光束中同时存在，而且各自产生独立的共振信号。一般可将生物传感器设计成仅使一种偏振(S偏振)的性质最优化，非最优化的偏振容易通过偏振滤波器去除。为了去除偏振依赖性，使得每个偏振角产生相同的共振反射谱，可以使用由一组同心环组成的交替生物传感器结构。在这种结构中，各个同心环的内径和外径之间的差异等于约光栅周期的二分之一。每个相继的环具有比前一环内径大约1个光栅周期的内径。 同心环图式延伸以覆盖单个传感器位置一例如阵列点或微量滴定板孔。每个单独的微阵列点或微量滴定板孔具有单独的同心环图式位于其内。这类结构的所有偏振方向具有相同的截面轮廓。必须准确照射同心环结构的中心以保持偏振独立性。同心环结构的光栅周期小于共振反射光的波长。光栅周期为约0.01微米至约1微米。光栅深度为约0. 01微米至约 1微米。在另一个实施方案中，将孔或柱(post)的阵列排列以紧密接近上述同心圆结构而不需要将照射光束集中在任何特定的网格位置上。通过3个激光束以相同角度从三个方向射在表面上的光干涉自动产生这类阵列图式。在这种图式中，孔(或柱)集中在紧密排列的六边形的阵列的角落中。孔或柱还出现在各六边形的中心。孔或柱的这类六边形网格具有3个“看到(see)”相同截面轮廓的偏振方向。因此，使用任何偏振角的光，六边形网格结构都会提供等效的共振反射谱。因此，不需要偏振滤波器去除不需要的反射信号分量。 孔或柱的周期可为约0. 01微米至约1微米，深度或高度可为约0. 01微米至约1微米。检测系统可包括比色共振反射生物传感器、将光导向比色共振反射生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过应用滤波器简化读出仪器，使得仅超出确定阈值的阳性结果引发检测。通过测定本发明的比色共振反射生物传感器各个独特位置上的共振波长的变化， 可确定哪些独特位置具有例如沉积在其上的生物材料。变化的程度可用来测定例如试验样品中结合配偶体的量和一种或多种特异性结合物质与试验样品的结合配偶体之间的化学亲和力。可照射比色共振反射生物传感器两次。第一次测量测定例如将细胞加入生物传感器之前，生物传感器的一个或多个独特位置的反射谱。第二次测量测定例如将一种或多种细胞加到生物传感器之后的反射谱。这两次测量之间的波长峰值的差异是生物传感器上细胞的存在情况、量或状态的度量。这种照射方法可控制生物传感器表面的小缺陷，所述缺陷可导致区域具有峰值共振波长的微小变化。这种方法还可控制生物传感器上细胞物质的不同浓度或密度。还可照射比色共振反射生物传感器两次以上，测定并记录PWV。例如，1秒钟可照射生物传感器1、2、4、5或10次，或1分钟、或每1分钟、5分钟、10分钟、20分钟或 60分钟照射1、2、3、4、5、10、20或30次，或一天照射1、2、3、4、5、10或更多次。检测系统检测系统可包括生物传感器、将光导向生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过应用滤波器来简化读出仪器，使得只有超出确定阈值的阳性结果引发检测。光源可从其顶面(即固定有一种或多种特异性结合物质的表面)或从其底面照射比色共振反射生物传感器。通过测定本发明的生物传感器的各个独特位置上的共振波长的变化，可测定哪些独特位置具有与之结合的结合配偶体。变化的程度可用来测定试验样品中结合配偶体的量和一种或多种特异性结合物质与试验样品的结合配偶体之间的化学亲和力。用于照射生物传感器表面和用于收集反射光的检测系统的一种类型是含有例如6 个与光源连接的照射光纤和一个与分光计连接的收集光纤的探头。光纤数目不是关键性的，照射或收集光纤的任何数目都是可行的。光纤以束排列，使得收集光纤位于束的中央， 并且被6个照射光纤包围。光纤束末端与将照射光聚焦在生物传感器表面上的准直透镜连接。在这种探头排列中，照射光纤和收集光纤是并排的。因此，当准确调整准直透镜使光聚焦在生物传感器表面上时，会观察到6个界限分明的环形照射区和中心暗区。因为生物传感器不散射光，而是反射准直光束，因此光不入射到收集光纤，而且观察不到共振信号。只有通过使准直透镜散焦直到6个照射区在中心区重叠，任何光才反射到收集光纤。由于只是散焦，所以稍稍未准直的光便可产生信号，不用单一入射角，而是用一系列入射角照射生物传感器。一系列入射角导致共振波长的混合。因此，测量到比其它方式可能测定到的更宽的共振峰。因此，合乎需要的是照射和收集光纤探头在空间上具有相同的光程。可采用若干方法使照射光程和收集光程共处在一起。例如，在其第一末端与将光导向生物传感器的光源连接的单一照射光纤，以及在其第一末端与检测从生物传感器反射的光的检测器连接的单一收集光纤，各自可在其第二末端与可用作发光器和收集器两者的第三光纤探头连接。 第三光纤探头与生物传感器成正入射角定位并支持反向传播照射和反射光学信号。另一种检测方法包括使用分束器，所述分束器能够使与光源连接的单一照射光纤与同检测器连接的收集光纤成90度角定位。将光通过照射光纤探头导向分束器，分束器将光导向生物传感器。将反射光导回到分束器，而分束器将光导向收集光纤探头中。分束器可供照射光和反射光在分束器和生物传感器之间具有共同的光程，因此可使用精确准直光而无需散焦。生物传感器的表面配体或特异性结合物质是与另一种分子结合的分子。配体和特异性结合物质是类似术语。配体或特异性结合物质可以是例如核酸、肽、胞外基质配体(参见表1)、蛋白质溶液、肽溶液、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA杂合体溶液、含有来自组合化学文库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab' )2 片段、Fv片段、有机小分子、细胞、病毒、细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是例如血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤勻浆物、滑液、排泄物、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液或前列腺液。聚合物选自每分子具有多个活性部位的长链分子水凝胶、葡聚糖、聚氨基酸及其衍生物，包括聚赖氨酸(包括聚-ι-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、聚-phe-赖氨酸和聚-glu-赖氨酸。在本发明的一个实施方案中，配体是胞外基质蛋白配体。例如，将结合配偶体加到包含特异性结合物质、配体或细胞的生物传感器表面以测定例如结合配偶体是否与特异性结合物质、配体或细胞结合，或者是否以任何方式改变特异性结合物质、配体或细胞(例如引起细胞分化或去分化)。结合配偶体可以是例如核酸、肽、胞外基质配体(参见表1)、蛋白质溶液、肽溶液、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、 RNA-DNA杂合体溶液、含有来自组合化学文库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、有机小分子、细胞、病毒、细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是例如血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤勻浆物、 滑液、排泄物、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液或前列腺液。聚合物选自每分子具有多个活性部位的长链分子水凝胶、葡聚糖、聚氨基酸及其衍生物，包括聚赖氨酸(包括聚-1-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、聚-phe-赖氨酸和聚-glu-赖氨酸。使一种或多种配体固定在生物传感器上，使得配体不会被任何漂洗步骤洗去，并且使得生物传感器表面不会阻碍配体与试验样品中的结合配偶体结合。一种或多种配体可通过物理吸附(即无需使用化学接头)或通过化学结合(即使用化学接头)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合与生物传感器表面连接。化学结合可导致配体在生物传感器表面上更牢固的连接，并提供方向和构象确定的表面结合分子。在本发明的一个实施方案中，配体或特异性结合物质可与生物传感器表面缔合，使得它不是固定的，但由于重力或者加在配体或特异性结合物质上的凝胶或凝胶样物质仍保持与生物传感器表面缔合。配体或特异性结合物质还可通过以下特异性结合物质与生物传感器表面特异性结合例如核酸、肽、蛋白质溶液、肽溶液、含有来自组合化学文库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' ) 2片段、Fv片段、有机小分子、 病毒、聚合物或生物样品，其中特异性结合物质被固定在生物传感器表面上。此外，可将配体或特异性结合物质排列在生物传感器表面上的一个或多个独特位置阵列中，其中表面可存在于多孔板的一个或多个孔内，并包含多孔板或微阵列的一个或多个表面。配体阵列在微孔板内的生物传感器表面上包含一种或多种配体，使得表面含有各具有不同配体的一个或多个独特位置。例如，阵列可包含1、10、100、1，000、10，000或 100，000个或更多个独特位置。因此，多孔板或微阵列的各孔在其中可具有与多孔板的其它孔分开的一个或多个独特位置的阵列，这可供在一个多孔板上处理多种不同的样品。任何一个孔内的一个或多个阵列可与存在于相同微量滴定板的任何其它微量滴定板孔中的一个或多个阵列相同或不同。另外，本发明的阵列可以任何规则或不规则图式类型包含一种或多种特异性结合物质。例如独特位置可限定一种或多种结合物质的点的阵列。阵列点的直径可为约 10、20、30、40、50、100、200、300、400 或 500 微米。特异性结合物质与加到本发明的生物传感器表面上的结合配偶体(即细胞或细胞上的分子)特异性结合，使得细胞固定在生物传感器上。特异性结合物质与其结合配偶体特异性结合，但基本不与加到生物传感器表面上的其它结合配偶体结合。例如，当特异性结合物质是抗体，其结合配偶体是特定抗原时，抗体与特定抗原特异性结合，但基本不与其它抗原结合。结合配偶体可以是例如细胞或存在于细胞上或细胞内的任何分子，例如核酸、 重组核酸、蛋白质、重组蛋白、胞外基质蛋白受体、脂质或碳水化合物。在本发明的一个实施方案中，结合配偶体是可与固定在生物传感器上的特异性结合物质结合的受体，其中受体位于细胞表面。虽然微量滴定板是用于生化测定的最普遍形式，但微阵列越来越被视为使一次可测量的生化相互作用的数量最大化同时使贵重试剂的体积减到最小的手段。通过用微阵列点样器(spotter)将特异性结合物质加到本发明的一个生物传感器表面，可获得密度为 10，000个特异性结合物质/in2的特异性结合物质。通过将照射光束聚焦以探测单一微阵列位置，生物传感器便可用作无标记微阵列读出系统。还可通过与例如下列官能接头结合来影响配体与生物传感器表面的固定镍基、 胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、 腈基、糖基、巯基、有机磷酸基、脂基、磷脂基或类固醇基。此外，配体可通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水结合或亲水结合和免疫捕获方法固定在生物传感器表面上。在本发明的一个实施方案中，生物传感器可用例如以下接头包覆镍基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、腈基、糖基、巯基、有机磷酸基、脂基、磷脂基或类固醇基。例如，胺表面可用来连接若干类型的接头分子，而醛表面可用来直接结合蛋白质而不需要加入接头。镍表面可用来结合已掺入组氨酸(“his”)标签的分子。用镍激活表面检测“加his标签”的分子是本领域众所周知的 (ffhitesides, Anal. Chem. 68，490，(1996))。可将接头、配体和特异性结合物质固定在生物传感器表面上，使得每孔都有固定在其中的相同的接头、配体和/或特异性结合物质。或者，各孔可含有接头、配体和/或特异性结合物质的不同组合。配体或特异性结合物质与固定在生物传感器表面上的接头特异性或非特异性结合。或者，生物传感器的表面可能无接头，且配体或特异性结合物质可与生物传感器表面非特异性结合。使一种或多种特异性结合物质或接头固定在生物传感器上，使得特异性结合物质或接头不会被漂洗步骤洗去，而且生物传感器表面不阻碍其与试验样品中的配体的结合。 可实施若干不同类型的表面化学策略以使特异性结合物质与例如用于各种类型的微阵列和生物传感器的玻璃共价连接。可容易地使这些相同方法适于本发明的生物传感器。使之含有用于结合一种或多种特异性结合物质的合适官能团的生物传感器的表面制备是生物传感器制造过程的必要部分。可通过物理吸附(即无需使用化学接头)或通过化学结合(即使用化学接头)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合，使一种或多种特异性配体或特异性结合物质与生物传感器表面连接。化学结合可导致配体在生物传感器表面上更牢固的连接，并提供方向和构象确定的表面结合分子。将配体固定于塑料、环氧树脂或高折射率材料上基本上可按照固定在玻璃上所述方法进行。然而，如果这类处理将破坏固定有特异性结合物质的材料，则可排除酸洗步骤。细胞(例如原代细胞或干细胞)可通过一种或多种配体固定在生物传感器上。在本发明的一个实施方案中，细胞通过与胞外基质配体反应而固定在生物传感器上。整联蛋白是与胞外基质(ECM)相互作用并介导胞内信号的细胞表面受体。整联蛋白负责细胞骨架组织、细胞移动、细胞周期调节、整联蛋白亲和力的细胞调节、细胞与病毒连接、细胞与其它细胞或ECM连接。整联蛋白还负责信号转导，一种细胞藉此将一种信号或刺激在胞内和胞间转变成另一种信号或刺激的过程。整联蛋白可将ECM的信息转导至细胞，并将细胞的信息转导至其它细胞(例如通过其它细胞上的整联蛋白)或转导至ECM。整联蛋白及其ECM 配体列表可参见Takada等，Genome Biology 8 :215 (2007)，如下表1所示。表1
整联蛋白ECM配体
"α^层粘连蛋白、胶原
层粘连蛋白、胶原、血小板反应蛋白、E-钙 α2β 黏着蛋白、生腱蛋白层粘连蛋白、血小板反应蛋白、uPAR
血小板反应蛋白、MadCAM-I、VCAM-K
(Χ4β
纤连蛋白、骨桥蛋白、ADAM、ICAM-4 "a^i纤连蛋白、骨桥蛋白、肌原纤蛋白、血小板
权利要求
1.一种检测一个容器中的两种或更多种细胞类型对刺激或试验试剂的不同反应的方法，其中两种或更多种细胞类型不含可检测标记，所述方法包括(a)将两种或更多种细胞类型加到一个容器中，其中所述容器包括比色共振反射生物传感器表面、基于光栅的波导生物传感器表面或介电薄膜叠式生物传感器表面，其中所述生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质，且其中一种或多种特异性结合物质可结合两种或更多种细胞类型中的一种或多种；(b)使两种或更多种细胞类型与一种或多种特异性结合物质结合；和(c)检测两种或更多种细胞类型的不同反应。
2.权利要求1的方法，其中所述不同反应是两种或更多种细胞类型与一种或多种特异性结合物质连接的不同时间。
3.权利要求1的方法，其中所述不同反应是由两种或更多种细胞类型呈现的对一种或多种特异性结合物质的不同细胞连接形态。
4.权利要求1的方法，其中所述不同反应是两种或更多种细胞类型对一种或多种特异性结合物质的不同连接强度。
5.权利要求1的方法，所述方法还包括(a)将两种或更多种细胞类型暴露于一种或多种试验试剂或刺激；和(b)检测两种或更多种细胞类型的不同反应。
6.权利要求5的方法，其中所述不同反应是两种或更多种细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应强度。
7.权利要求5的方法，其中所述不同反应是由两种或更多种细胞类型在响应一种或多种试验试剂或刺激时呈现的不同细胞形态。
8.权利要求5的方法，其中所述不同反应是两种或更多种细胞类型随时间推移对一种或多种试验试剂或刺激的不同细胞反应。
9.权利要求5的方法，其中所述不同反应是两种或更多种细胞类型随时间推移的不同反应动力学。
10.权利要求1的方法，所述方法还包括(d)将两种或更多种细胞类型暴露于第一试验试剂或第一刺激；(e)检测两种或更多种细胞类型对第一试验试剂或第一刺激的反应；(f)将两种或更多种细胞类型暴露于第二试验试剂或第二刺激，其中两种或更多种细胞类型中的一种细胞类型对第二试验试剂或第二刺激的反应是已知的；(g)检测两种或更多种细胞类型对第二试验试剂或第二刺激的反应；(h)在生物传感器上鉴定对第二试验试剂或第二刺激具有已知反应的两种或更多种细胞类型中的一种细胞类型；(i)检测两种或更多种细胞类型的不同反应。
11.权利要求1的方法，其中一种或多种试验试剂或刺激由生物传感器表面上存在的两种或更多种细胞类型中的一种或多种细胞表达。
12.—种检测混合细胞群中第一细胞类型的存在情况的方法，其中所述混合细胞群中的细胞不含可检测标记，所述方法包括(a)将混合细胞群加到一个容器中，其中所述容器包括比色共振反射生物传感器表面、基于光栅的波导生物传感器表面或介电薄膜叠式生物传感器表面，其中所述生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质；(b)使混合细胞群与一种或多种特异性结合物质结合，其中对于与一种或多种特异性结合物质结合，第一细胞类型具有与混合细胞群的其它细胞不同的反应；和(C)检测混合细胞群的不同反应，其中通过它们的不同反应检测第一细胞类型的存在情况。
13.权利要求12的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型与一种或多种特异性结合物质连接的不同时间。
14.权利要求12的方法，其中所述不同反应是由第一细胞类型呈现的对一种或多种特异性结合物质的不同细胞连接形态。
15.权利要求12的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型对一种或多种特异性结合物质的不同连接强度。
16.权利要求12的方法，其中测定混合细胞群中的第一细胞类型的百分比。
17.权利要求12的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型随时间推移的不同反应。
18.—种检测混合细胞群中第一细胞类型的存在情况的方法，其中所述混合细胞群中的细胞均不含可检测标记，所述方法包括(a)将混合细胞群加到一个容器中，其中所述容器包括比色共振反射生物传感器表面、 基于光栅的波导生物传感器表面或介电薄膜叠式生物传感器表面，其中所述生物传感器表面具有一种或多种固定在其表面上的特异性结合物质；(b)使混合细胞群与一种或多种特异性结合物质结合，(c)将混合细胞群暴露于一种或多种试验试剂或刺激，其中与混合细胞群中的其它细胞相比，第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激具有不同反应；(d)检测第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应，其中如果检出不同反应，则第一细胞类型存在于细胞的混合物中。
19.权利要求18的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型对一种或多种试验试剂或刺激的不同反应强度。
20.权利要求18的方法，其中所述不同反应是由第一细胞类型在响应一种或多种试验试剂或刺激时呈现的不同细胞形态。
21.权利要求18的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型随时间推移对一种或多种试验试剂或刺激的不同细胞反应。
22.权利要求18的方法，其中所述不同反应是第一细胞类型随时间推移的不同反应动力学。
23.权利要求18的方法，其中测定混合细胞群中的第一细胞类型的百分比。
24.权利要求18的方法，其中一种或多种试验试剂或刺激由存在于生物传感器表面上的混合细胞群中的一种或多种细胞表达。
25.一种检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应的方法，所述方法包括(a) (i)将一种或多种胞外基质配体固定在比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上，其中第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并且将第一细胞群加到生物传感器上；或(ii)将第一细胞群与一种或多种胞外基质配体混合，其中第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并将第一细胞群与一种或多种胞外基质配体一起加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；(b)将凝胶、凝胶样物质或者第二细胞群加到生物传感器表面上；(C)将一种或多种试验试剂或刺激加到凝胶或凝胶样物质或者第二细胞群中；和(d)检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应。
26.权利要求25的方法，其中一种或多种试验试剂或刺激是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。
27.权利要求25的方法，其中所述第二细胞群是上皮细胞群或内皮细胞群。
28.权利要求25的方法，其中所述第一细胞群是干细胞群。
29.权利要求25的方法，其中不使用检测标记。
30.权利要求25的方法，其还包括检测第二细胞群的反应。
31.权利要求25的方法，其中通过在一个或多个期间内监测波长峰值或者通过在一个或多个期间内监测有效折射率变化，来检测第一细胞群或第二细胞群对一种或多种刺激的反应。
32.权利要求25的方法，其中实时检测第一细胞群或第二细胞群的反应。
33.一种检测第一群细胞对一种或多种试验试剂或刺激的反应的方法，所述方法包括(a)将一种或多种试验试剂或刺激加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；(b)将基底膜基质、藻酸胶、胶原凝胶、琼脂糖凝胶、合成水凝胶或第二细胞群加到生物传感器表面上；(c)将第一细胞群与一种或多种胞外基质配体混合，其中所述第一细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；且将第一细胞群加到生物传感器上；(d)检测第一细胞群对一种或多种试验试剂或刺激的反应。
34.权利要求33的方法，其中一种或多种试验试剂或刺激是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。
35.权利要求33的方法，其中所述第二细胞群是上皮细胞群或内皮细胞群。
36.权利要求33的方法，其中所述第一细胞群是干细胞群。
37.权利要求33的方法，其中不使用检测标记。
38.权利要求33的方法，其还包括检测第二细胞群的反应。
39.权利要求33的方法，其中通过在一个或多个期间内监测波长峰值或者通过在一个或多个期间内监测有效折射率变化，来检测第一细胞群或第二细胞群对一种或多种刺激的反应。
40.权利要求33的方法，其中实时检测第一细胞群或第二细胞群的反应。
41.一种检测第一细胞群分化的方法，所述方法包括(a)将第一细胞群加到比色共振反射生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上，其中所述生物传感器具有两个或更多个表面区域，其中每个表面区域具有共振值不同于其它表面区域的光栅；(b)检测两个或更多个表面区域中每个的两个或更多个波长峰值；和 (C)检测生物传感器表面上第一细胞群的分化。
42.权利要求41的方法，其中实时检测分化。
43.权利要求41的方法，其中将一种或多种试验试剂或刺激加到生物传感器上之后， 检测来自两个或更多个表面区域中每个的两个或更多个波长峰值。
44.权利要求41的方法，其中在将一种或多种试验试剂或刺激加到生物传感器上之前，检测一个或多个波长峰值。
45.权利要求41的方法，其中一种或多种试验试剂或刺激是趋化物质或者产生试验试剂或刺激的第三细胞群。
46.权利要求41的方法，其中所述第一细胞群是干细胞群。
47.权利要求41的方法，其中不使用检测标记。
48.一种生物表达概况分析以鉴定对特定干细胞群有特异性的生物反应特征的方法， 所述方法包括(a)(i)将一种或多种胞外基质配体固定在比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的两个或更多个表面上，其中干细胞群具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并将干细胞群加到生物传感器的两个或更多个位置上；或者( )将干细胞群与一种或多种胞外基质配体混合，其中所述干细胞具有对一种或多种胞外基质配体有特异性的细胞表面受体；并将干细胞群与一种或多种胞外基质配体一起加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的两个或更多个表面上；(b)将生物传感器的两个或更多个表面暴露于两种或更多种试验试剂或刺激；(c)在生物传感器的两个或更多个表面的每个上检测干细胞对试验试剂或刺激的反应；(d)鉴定特定干细胞群特有的对两种或更多种试验试剂或刺激的生物反应特征。
49.权利要求48的方法，其中实时进行干细胞的反应的检测。
50.一种用于筛选候选化合物调节细胞分化的能力的方法，所述方法包括(a)将一种或多种细胞类型加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；(b)诱导一种或多种细胞类型分化；(c)通过比较候选化合物存在或不存在时的波长峰值或有效折射率变化，检测候选化合物存在或不存在时细胞分化的变化，其中与候选化合物不存在时的细胞分化活性相比，在化合物存在时细胞分化活性的变化表示候选化合物调节细胞分化的能力。
51.权利要求50的方法，其中所述细胞分化活性的变化是细胞分化活性增加、细胞分化活性降低、细胞分化活性受抑制、干细胞自我更新增加或降低或者分化细胞类型改变。
52.权利要求50的方法，其中所述细胞分化活性的变化是胶原产生的增加或降低。
53.权利要求50的方法，其中所述细胞分化活性的变化是矿化结节形成的增加或降低。
54.权利要求50的方法，其中一种或多种细胞类型是干细胞。
55.权利要求50的方法，其中一种或多种细胞类型是间充质干细胞。
56.权利要求50的方法，其中通过检测细胞大小、细胞形状、细胞膜电位、细胞代谢活性或细胞对信号的反应性的变化，来检测细胞分化活性的变化。
57.权利要求50的方法，其中所述候选化合物是抑制性核酸分子。
58.一种用于筛选候选化合物调节细胞分化的能力的方法，所述方法包括(a)将一种或多种细胞类型加到比色共振反射生物传感器、基于光栅的波导生物传感器或介电薄膜叠式生物传感器的表面上；(b)诱导一种或多种细胞类型分化；(c)通过比较候选化合物存在或不存在时的波长峰值或有效折射率，检测候选化合物存在或不存在时一种或多种细胞分化产物的产生，其中与候选化合物不存在时的一种或多种细胞分化产物相比，候选化合物存在时一种或多种细胞分化产物的变化表示候选化合物调节细胞分化的能力。
59.权利要求58的方法，其中所述细胞分化产物是胶原或矿化结节。
60.权利要求58的方法，其中一种或多种细胞类型是干细胞。
61.权利要求58的方法，其中一种或多种细胞类型是间充质干细胞。
62.权利要求58的方法，其中所述候选化合物是抑制性核酸分子。
63.一种比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面，其包含固定在生物传感器光栅表面上或与生物传感器光栅表面缔合的一种或多种特异性结合物质；以及一种或多种特异性结合物质上面的一层凝胶或凝胶样物质。
64.一种试剂盒，所述试剂盒包括一个或多个比色共振反射生物传感器光栅表面、一个或多个基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面和一个或多个凝胶或凝胶样物质的容器。
65.权利要求64的试剂盒，其还包括一种或多种特异性结合物质的容器。
66.权利要求64的试剂盒，其中一个或多个比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面包含固定在生物传感器光栅表面上或与生物传感器光栅表面缔合的一种或多种特异性结合物质。
67.权利要求63的共振反射比生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面，其中所述生物传感器光栅表面形成盛液容器的内表面。
68.权利要求67的比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面，其中所述盛液容器是微量滴定板或微观流体槽。
69.一种用于在比色共振反射生物传感器光栅表面、基于光栅的波导生物传感器光栅表面或介电薄膜叠式生物传感器光栅表面上检测特异性结合物质和结合配偶体之间的反应的改进方法，所述方法包括将一种或多种特异性结合物质加到生物传感器光栅表面上，使得一种或多种特异性结合物质固定在生物传感器光栅表面上或者与生物传感器光栅表面缔合；将凝胶或凝胶样物质加到生物传感器表面上。
70.一种从混合细胞群中分选出两种或更多种细胞类型并检测分选细胞对刺激、培育或试验试剂的反应的方法，其中所述分选和检测发生在一个生物传感器表面上，所述方法包括(a)将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种类型的特异性结合物质固定在其一个表面上，且其中两种或更多种特异性结合物质可潜在结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型；(b)从生物传感器的一个表面上洗去未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并在生物传感器表面上分选；(c)将一种或多种结合细胞类型暴露于刺激、培育或试验试剂；和(d)检测一种或多种结合细胞类型对刺激、培育或试验试剂的反应。
71.权利要求70的方法，其中所述两种或更多种特异性结合物质包含一种或多种胞外基质蛋白与一种或多种其它特异性结合物质的组合。
72.权利要求70的方法，其中一个生物传感器表面是微量滴定板孔的底部。
73.权利要求70的方法，其中两种或更多种细胞类型和试验试剂不含可检测标记。
74.—种在一个生物传感器表面上从混合细胞群中分选一种或多种细胞类型并检测一种或多种细胞类型的胞内分析物的方法，所述方法包括(a)将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种特异性结合物质固定在其一个表面上，其中两种或更多种特异性结合物质包含(i) 特异性结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型的第一特异性结合物质和(ii)特异性结合一种或多种细胞类型的一种或多种胞内分析物的第二特异性结合物质；(b)洗去生物传感器表面上的未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并且在生物传感器表面上分选；(c)使一种或多种结合细胞类型溶解或透化；(d)洗去生物传感器表面上的任何未结合的分析物；和(d)检测固定在生物传感器表面上的胞内分析物。
75.权利要求74的方法，其中第一特异性结合物质包含一种或多种胞外基质蛋白。
76.权利要求74的方法，其中在使一种或多种结合细胞类型溶解或透化之前将所述细胞培育一段时间，或暴露于刺激，或暴露于试验试剂。
77.权利要求74的方法，其中一个生物传感器表面是微量滴定板孔的底部。
78.权利要求74的方法，其中所述混合细胞群和两种或更多种特异性结合物质不含可检测标记。
79.—种在一个生物传感器表面上从混合细胞群中分选一种或多种细胞类型并检测一种或多种细胞类型的分析物的方法，所述方法包括(a)将混合细胞群加到一个比色共振反射生物传感器表面、一个基于光栅的波导生物传感器表面或一个介电薄膜叠式生物传感器表面上，其中一个生物传感器表面具有两种或更多种特异性结合物质固定在其一个表面上，其中两种或更多种特异性结合物质包含(i) 特异性结合混合细胞群中的一种或多种细胞类型的第一特异性结合物质和(ii)特异性结合一种或多种细胞类型的一种或多种分析物的第二特异性结合物质；(b)洗去生物传感器表面上的未结合细胞，使得一种或多种细胞类型与生物传感器表面结合并且在生物传感器表面上分选；(C)将试验试剂加到细胞中，或培育细胞，或使细胞经受刺激或其组合；和 (d)检测固定在生物传感器表面上的分析物。
80.权利要求79的方法，其中第一特异性结合物质是一种或多种胞外基质蛋白。
81.权利要求79的方法，其中一个生物传感器表面是微量滴定板孔的底部。
82.权利要求79的方法，其中所述混合细胞群和两种或更多种特异性结合物质不含可检测标记。
全文摘要
本发明提供无标记检测细胞群和混合细胞群中的变化的方法。
文档编号G01N33/50GK102460171SQ201080033792
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月17日 优先权日2009年5月15日
发明者A·于斯哈科夫, B·罗克尼, E·桑德伯格, L·G·莱恩, M·格特曼, M·阿博迪利, R·沃纳, S·C·舒尔斯, S·沙马, Z·帕达利亚 申请人:Sru生物系统公司