专利名称：真皮干细胞的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种从皮肤组织中分离真皮干细胞的方法。
背景技术：
干细胞是兼具产生分化为多个细胞的细胞的多分化能力、和通过细胞分裂产生与该细胞相同的细胞的自我复制能力这两种性质的细胞。源自作为受精卵的初期发育阶段的胚的干细胞被称为胚胎干细胞(ES细胞)。虽然人ES细胞被期待用于再生医疗，但由于存在利用受精卵这样的伦理上的问题，因此，制作新的人ES细胞尚未被认可。近年来，作为具有ES细胞类似性质的细胞，诱导多能干细胞(iPS细胞)也受到关注。但是，iPS细胞的制作在细胞癌化、制造功效等观点方面有许多问题。另一方面，具有分化为特定组织的能力的体性干细胞可由患者自身的身体组织、例如骨髓得到，因此，没有胚胎干细胞那样的伦理上的问题。在皮肤中，已知在表皮基底层存在表皮干细胞(非专利文献1)，还报告在毛囊的被称为隆起区的区域存在毛囊上皮干细胞(非专利文献幻和皮肤色素干细胞。另一方面， 在真皮中，在以胶原蛋白为主的纤维组织中存在形成细长纺锤形的成纤维细胞，但在真皮的成纤维细胞中是否存在干细胞尚未明确。虽然已知在真皮中存在分化为脂肪、神经胶质、 软骨、肌肉等多个细胞系列的皮肤源性前体细胞(skin-derived precursors :SKP)(非专利文献4)，但真皮成纤维细胞与SKP的关联尚未明确。作为成纤维细胞的前体细胞而从骨髓中被分离出的间充质干细胞(非专利文献 5)分化为属于间充质的各种细胞(骨细胞、肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等)，因此， 期待应用于骨、血管、肌肉的再构筑等再生医疗。最近，已明确具有间充质组织的组织可能大量存在，从脂肪、脐带血、胎盘等中分离出了间充质干细胞(非专利文献6-8)。但是，真皮中的间充质干细胞的存在依然未明确。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Watt FM, J Dermatol Sci. 28 173-180，2002非专利文献2 =Cotsarelis G et al.，Cell. 57 :201-209,1989非专利文献3 =Nishimura EK et al.，Nature. 416 :854-860,2002非专利文献4 =Wong CE al.，J Cell Biol. 175 :1005-1015,2006非专利文献5 =Pittenger MF et al.，Science. 284 143-147，1999非专利文献6 =Park Kff et al.，Cell Metab. 8 :454-457,2008非专利文献7 =Flynn A, et al.，Cytotherapy. 9 :717-726,2007非专利文献 8 Jgura K et al.，Cytotherapy. 6 :543-553,200
发明内容
发明要解决的课题
骨髓的间充质干细胞非常微少，脐带血及胎盘限定对象，因此，作为源自自身的间充质干细胞源有限。如果能够从真皮中分离出间充质干细胞，则皮肤可成为再生医疗及美容医疗中使用的间充质干细胞的宝贵的供给源。因此，本发明的课题在于，提供一种从真皮中分离间充质干细胞的方法。本发明者为了明确在真皮中存在间充质干细胞，同时确立有效地分离间充质干细胞的方法而进行了研究，结果实际确认了相对于干细胞标记物为阳性的细胞存在于真皮毛细血管及血管周围。但是，如果为了解离该细胞将皮肤组织进行酶处理，则特定的干细胞标记物的表达明显减少。本发明者对酶处理后的该细胞进行悬浮培养，结果明确了不仅该干细胞标记物的表达恢复，而且与粘附培养后的培养物相比，保持了高分化能力，从而完成了本发明。因此，本申请包括下述发明(1) 一种真皮干细胞的分离方法，其特征在于，将通过酶处理从皮肤上解离出的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。(2)根据上述⑴所述的方法，所述干细胞标记物阳性细胞是CD34阳性细胞。(3)根据上述(2)所述的方法，所述CD34阳性细胞进一步是NG2阳性。(4)根据上述⑴ (3)的任一项所述的方法，所述悬浮培养，进行对于使所述细胞的干细胞标记物的表达恢复所需足够的时间。发明的效果虽然不打算限定于理论，但一般认为，真皮干细胞以周细胞样的细胞群的形式存在于微脉管部位，在皮肤损伤时活化，分化为成纤维细胞、肌成纤维细胞，参与皮肤的再生和/或修复。另外还推测，真皮干细胞因年龄增长、皮肤刺激等被消耗，结果除了导致皮肤功能降低以外，还造成皮肤再生能力降低、血管不稳定化，从而产生皮肤老化。根据本发明方法，可以容易地分离真皮干细胞。通过本发明得到的真皮干细胞被期待有助于阐明皮肤的稳态、老化等机理，和/或应用于使用该干细胞的再生医疗。


图1是按照本发明的方法，通过将从人真皮中分离出的细胞中的粘附性高的细胞在间充质干细胞培养基中进行培养而得到的成纤维细胞样的细胞的显微镜照片。图2显示由图1所示的成纤维细胞样的细胞形成的菌落。图3显示图1所示的成纤维细胞样的细胞分化为脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞。图4是使用了干细胞标记物CD34和NG2以及核染色剂Hoechst33258的真皮中的血管部位的组织染色图。图5是对通过从人真皮进行CD34细胞分选而得到的细胞级分的菌落形成能力进行比较的显微镜照片；图6是显示源自人真皮的CD34阳性细胞是分化为脂肪和骨的真皮间充质干细胞的显微镜照片；图7是显示按照本发明方法获得的真皮干细胞中的间充质干细胞标记物NAN0G、 SDF-I α、HGF的基因表达比的图。在此，该表达比是与通过粘附培养而得的干细胞的表达量比较后的结果。
具体实施例方式本发明提供一种分离真皮干细胞的方法，其特征在于，将通过酶处理从皮肤中解离出的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。在此，对上述源自皮肤的细胞没有限定，可以按照从骨髓中分离间充质干细胞的方法使其解离。例如，对细切后的皮肤组织进行酶处理，使真皮细胞从皮肤组织中解离。该酶处理可以使用胰蛋白酶、胶原酶等一般的蛋白质分解酶来进行。使用的皮肤组织为哺乳动物的皮肤组织，优选为源自人的皮肤组织，但并不限定于这些皮肤组织。在这种受到酶处理的细胞中，特定的干细胞标记物的表达低下。在此，本说明书中使用的用语“干细胞标记物”是指在对分离真皮干细胞有效的干细胞标记物中，特别由于从组织中解离时因酶处理而使其表达降低的标记物，例如指细胞表面抗原⑶34。如下所述，本发明者确认，作为造血干细胞已知的细胞表面抗原CD34在真皮中的血管部位表达，但刚酶处理后的细胞的CD34表达量极低。因此，即使对通过酶处理而得到的源自皮肤的细胞使用流式细胞仪，也不能充分地分离干细胞标记物阳性的细胞。另外，酶处理后的细胞的干细胞阳性标记物的表达在进行作为间充质干细胞的一般培养方法的粘附培养的情况下也显著低下。但是，明确了通过将对皮肤组织进行酶处理而得到的细胞在规定期间进行悬浮培养， 从而干细胞标记物的表达恢复。更令人吃惊的是，与通过粘附培养而得到的真皮干细胞相比，经由悬浮培养分离而得到的真皮干细胞显示高分化能力。所述悬浮培养进行对于恢复降低的干细胞标记物的表达足够的时间，例如4小时，根据情况可进行数天，例如5天。从利用糖链等的干细胞标记物的翻译后修饰的观点考虑，悬浮培养优选进行6小时。该悬浮培养可使用间充质干细胞所使用的培养基。如果使用的培养基中含有血清，则因血清中的粘附因子而产生对培养器表面的粘附，因此优选使用无血清培养基。为了抑制细胞彼此粘附，在培养基中也可以含有甲基纤维素。培养基包含在悬浮培养用的培养器中而被使用。干细胞标记物阳性细胞可以通过使用流式细胞仪、例如细胞分选仪等进行分离。 例如作为细胞分选仪，可以使用MACS(注册商标)珠系统进行分离。用语“干细胞标记物阳性细胞”广义上通常是指表达作为体性干细胞的标记物已知的因子、⑶34、⑶44、⑶105、 ⑶133、⑶146、c-kit、p75NTR、整联蛋白α 6、整联蛋白β 1等的细胞。作为本发明中使用的干细胞标记物阳性细胞的例子，可以举出CD34阳性细胞。另外，通过使用存在于血管内皮细胞周围的周细胞标记物NG2，可以更正确地分离真皮干细胞。因此，本发明中分离的干细胞标记物阳性细胞优选为⑶34/NG2双阳性细胞。分离的干细胞标记物阳性细胞在间充质干细胞用的培养基中进行平面培养。通过选择其中的粘附性高的细胞进行培养，可得到增殖成菌落的真皮干细胞。如上得到的真皮干细胞可分化为骨细胞、脂肪细胞等各种细胞。实施例以下通过实施例更详细地说明本发明。此外，本发明并不限定于这些实施例。实验方法从人皮肤组织的细胞分离将人皮肤组织在含10%胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen)中，在立体显微镜下用手术刀除去脂肪层部分，使用解剖用的剪刀细切成l_2mm2的皮肤组织片。在50mL管中使得到的组织片分散在IOmL的含有0. 胰蛋白酶和0. 2%胶原酶的DMEM培养基中，使用恒温振荡仪并在37°C振荡3小时，用酶消化皮肤组织。在酶消化反应结束后加入30ml的 DMEM培养基，用移液器分散细胞。在离心分离后，将细胞再悬浮于DMEM培养基中，然后进行细胞计数，作为源自人皮肤的细胞。人皮肤细胞的原代培养将从皮肤中解离的源自皮肤的细胞悬浮于5ml的间充质干细胞用培养基 MesenPro(Invitrogen)中，然后接种在无涂层的T-25培养瓶(Falcon)中在CO2培养箱中培养一夜。吸去培养液，仅残留粘附的细胞，加入5ml新的MesenPro培养基继续培养。每隔 2天边更换培养基边继续培养，当细胞密度达到汇合的时刻回收细胞，将得到的细胞作为源自人真皮的细胞。使用磁珠的源自人真皮的细胞的分选将源自人皮肤的细胞悬浮于IOml的悬浮培养培养基(DMEM/F-12 (3 1) (Invitrogen)、40ng/ml FGF2 (Sigma)、20ng/ml EGF (R&D systems)、B27 (Invitrogen)、抗菌剂(和光纯药))中，然后接种在无涂层的T-25培养瓶(Falcon)中，在CO2培养箱中培养5 天。接着，使用 Miltenyibiotec 公司制的 CD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec)进行细胞分选。操作条件根据Miltenyi Biotec公司提示的方案。首先，将悬浮培养的源自人皮肤的细胞团使用前端呈圆形的巴氏吸管进行物理分散，使细胞悬浮液通过孔径为40 μ m的过滤器O^lcon)。接着，用冰冷却的MACS缓冲液(含 0. 5%BSA,2mM EDTA的PBS、pH值7. 2)清洗一次并进行细胞计数，将100万个细胞再悬浮于 300 μ 1的MACS缓冲液中。接着，加入100 μ 1的FcR阻断剂并进行混合，再加入100 μ 1的 ⑶34微珠并再次充分混合，然后在冰箱中孵育30分钟。使用5ml的MACS缓冲液并通过清洗、离心操作回收细胞，然后用500μ1 MACS缓冲液进行再悬浮。将MS柱插入到MACS分离器的磁场中，用500 μ 1的MACS缓冲液进行清洗，将上述的细胞悬浮液上柱。将柱用500 μ 1 的MACS缓冲液清洗3次，将此时回收的细胞作为CD34阴性的源自皮肤的细胞。接着，将柱从磁场取出，置于回收用的管上，在柱中加入Iml的MACS缓冲液，从柱上方用附带的活塞进行挤出，将回收的细胞作为CD34阳性的源自皮肤的细胞。将得到的CD34阳性或阴性的源自皮肤的细胞用MesenPro培养基培养，将所得的细胞作为人CD34阳性的源自真皮的细胞或人CD34阴性的源自真皮的细胞。菌落形成试验将源自真皮的细胞悬浮在MesenPro培养基中，然后以低浓度接种于6cm或IOcm 培养皿中，在(X)2培养箱中培养2周。在培养结束后进行吉姆萨染色，计算形成的菌落数。 吉姆萨染色如下进行。将细胞用甲醇固定后轻轻风干，在培养皿中注入用自来水稀释至5 倍的吉姆萨染色液(t力，4 f ζ々)，最后用流水清洗适当时间。源自人真皮的细胞的传代培养使用MesenPro培养基以每Icm2 1000个的比例接种，从而进行源自人真皮的细胞的传代培养。在每隔2天更换培养基的同时进行培养，在细胞密度达到汇合的时刻进行冷冻保存及传代培养。分化培养实验
使用 R&D Systems 公司的 Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit对在MesenPro培养基中进行传代培养的源自各样本的源自人真皮的细胞进行向脂肪细胞及骨细胞分化的分化培养。将各个源自真皮的细胞悬浮于含10%胎牛血清的α MEM培养基中，将其接种于用酸性胶原溶液(Koken)涂敷的2孔腔室培养玻片中， 在脂肪细胞分化的情况下接种4万个，在骨细胞分化的情况下接种1万8千个。然后，在含 10%胎牛血清的α MEM培养基中在每隔2天更换培养基的同时进行培养。接着，在脂肪细胞分化的情况下，在细胞达到汇合的时刻，更换为加入有上述试剂盒中所含的脂肪细胞分化的添加剂的含10%胎牛血清的αΜΕΜ培养基，培养2周。另外， 在骨细胞分化的情况下，在细胞达到亚汇合的时刻，更换为加入有上述试剂盒中所含的骨细胞分化的添加剂的含10%胎牛血清的αΜΕΜ培养基，培养2周。进而，关于向软骨细胞的分化，将25万个源自真皮的细胞在15ml的管中通过离心分离使其沉淀，用Iml DMEM/ F-12 (Invitrogen)清洗后，更换为加入有上述试剂盒中所含的软骨细胞分化的添加剂的 0. 5ml的DMEM/F-12培养基，将细胞以团块的状态培养3周。油红0染色将进行脂肪分化培养的源自真皮的细胞用4%多聚甲醛-磷酸缓冲液在室温固定 15分钟。用灭菌蒸馏水冲洗后，在室温下用60%异丙醇处理1分钟，接着，在室温下与油红 0染色液反应15分钟。用60%异丙醇处理1分钟来进行分级，进而在灭菌蒸馏水中驯化后进行显微镜观察。Kossa 法染色将进行骨分化培养的源自真皮的细胞用4%多聚甲醛-磷酸缓冲液室温固定15分钟。用灭菌蒸馏水清洗3次后，加入在就要使用前配置的5%硝酸银水溶液，在距27W荧光灯下约IOcm处静置腔室培养玻片并用铝箔整体覆盖，在室温下反应1. 5小时。反应结束后， 用灭菌蒸馏水清洗3次，加入5%硫代硫酸钠水溶液并静置2分钟，进而用灭菌蒸馏水清洗 3次，然后进行显微镜观察。人皮肤组织染色将人皮肤组织包埋在冷冻组织包埋剂OTC混合物(&ikura Finetek Japan)中，用冷冻切片制作装置低温恒温器(Leica)制作冷冻切片。将在室温下风干冷冻切片，在室温下使用经_20°C冷却15分钟的冷丙酮固定15分钟。接着，用TBS清洗后，用无血清阻断剂 (DAKO)进行阻断处理30分钟，4°C下与用含3% BSA的TBST稀释至100倍的小鼠抗人⑶34 抗体(Becton Dickinson)和家兔抗人NG2抗体(Millipore)反应一夜。用TBST清洗2次， 每次15分钟，用TBS清洗15分钟，共清洗3次后，与用含3% BSA的TBST稀释至200倍的 Alexa 488标记抗家兔IgG和Alexa 594标记抗小鼠IgG标记的二次抗体(Invitrogen)反应1小时。将反应后的切片用TBST清洗2次，每次15分钟，用TBS清洗15分钟，共清洗3 次后，用Hoechist 33258进行核染色，然后使用共聚焦荧光显微镜LSM5 PASCAL (kiss)进行观察。细胞染色将进行了脂肪细胞分化或骨细胞分化的源自真皮细胞用PBS清洗后，用4% PFA 固定15分钟。用TBS清洗后，与含0. Triton X-100的TBS溶液反应15分钟，从而进行提高细胞膜的透过性的处理(透化)。在软骨细胞分化的情况下，制作分化实验后的源自真皮的细胞的细胞团的冷冻切片，进行与上述同样的操作用于染色。接着，用无血清阻断剂(DAKO)进行阻断处理30分钟后，在4°C下与用含3% BSA的TBST稀释至200倍的抗 FABP-4抗体(脂肪检测用)、抗Osteocalcin抗体(骨检测)或抗Aggrecan抗体(软骨检测用)反应一夜。用TBST清洗2次，每次15分钟，用TBS清洗15分钟，共清洗3次后，与用含 3% BSA 的 TBST 稀释至 200 倍的 Alexa ；350(或 Alexa 448、Alexa 594)标记的二次抗体(Invitrogen)反应1小时。用TBST清洗2次，每次15分钟，用TBS清洗15分钟，共清洗3次后，用含防褪色剂的Vector Sheered (Vector公司)和盖玻片封入，使用荧光显微镜(Olympus)进行观察。定量PCR使用ISOgen( 二 , ^ > ”一 >)，使用提供的方案从源自真皮的细胞中提取总RNA。通过核酸定量装置Nanodrop (Thermo scientific)测定纯化后的总RNA的浓度。对于各源自真皮的细胞，使用等量的总RNA，利用随机引物和逆转录酶Superscript III (Invitrogen)，按照hvitrogen公司的手册来合成cDNA。将合成的cDNA作为模板并使用反应试剂 Light Cycler FastStart DNA Master PLUS SYBR Green (Roche)，反应装置 Light Cycler(Roche)来进行定量PCR。组成条件按照Roche的方案。另外，PCR条件为初始变性95°C下10分钟，变性95°C下10秒，退火60°C下10秒，延伸72°C下10秒。使用的引物的序列如下。
G3PDH 正向引物反向引物
:5，-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3，(序列号 1) :5，-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3，(序列号 2)HGF
-GAGGGAAGGTGACTCTGAATGAG-3，(序列号 3) -AATACCAGGACGATTTGGAATGGCAC-3，(序列号 4)SDFla
正向引物5’ 反向引物5’ NANOG
正向引物5，-TGCTTATTCAGGACAGCCCT-3，(序列号 5) 反向引物5，-TCTGGTCTTCTGTTTCTTGACT-3，(序列号 6)正向引物5，-TGSGCTACAGATGCCCATGC-3，(序列号7)反向引物5，-CCACTTTAGCTTCGGGTCAA-3，(序列号8)使用LightCycler的附属软件测定各基因的表达量。此外，使用G3PDH作为内标， 在分别定量各基因时，使用该内标修正对照组的cDNA量。结果将去除了脂肪层的人皮肤组织用酶解离，将粘附在无涂层培养皿中达M小时的细胞在间充质干细胞培养基MesenPro中进行培养，结果从培养开始至1周的时刻确认出现了如图1所示的成纤维细胞样的细胞。接着，在该细胞增加到汇合之后进行菌落检验，结果是形成了多个圆形的菌落(图2)。另外，进行2次传代培养并研究向脂肪、骨、软骨的细胞分化，结果确认了如图3所示，在开始分化培养的2 3周的时刻，表达各自的分化标记物， 分化为脂肪、骨、软骨。由以上的结果表明，在人皮肤中存在间充质干细胞。接着，通过组织染色法明确人皮肤中的间充质干细胞的分布。首先，研究了作为造血干细胞、血管内皮前体细胞、源自脂肪的干细胞等前体细胞或干细胞的标记物广为人知的CD34在人真皮组织中的分布，结果可知其与真皮胶原纤维中散在的成纤维细胞不同，其局部存在于血管部位(数据未显示)。接着，为了与血管内皮细胞进行区别，进行了周皮细胞标记物NG2和干细胞标记物⑶34的双重染色，结果可知相对于周皮细胞标记物NG2和干细胞标记物⑶；34为双阳性细胞存在于真皮中的血管部位(图4)。一般认为，这些细胞群可能是真皮间充质干细胞。为了表明NG2/⑶34双阳性细胞为真皮间充质干细胞，以及使用这些标记物能够有效地分离真皮间充质干细胞，除利用这些标记物进行细胞分选以外，还进行了调查分化能力的研究。在此，显示利用CD34得到的结果。将人皮肤2cm2大小的组织在酶液(含0. 1% 胰蛋白酶/0. 2%胶原酶的DMEM培养基)中在37°C下处理3小时，使细胞解离，结果可以得到约10万个细胞。将该细胞悬浮培养至5天，然后离心回收，使用将前端用火烧成圆形的巴氏滴管使其物理解离。使用Miltenyibiotec公司的CD34 MicroBead Kit (Miltenyi Biotec)对得到的细胞(100万个)进行细胞分选。将得到的CD34阳性或阴性的各细胞级分悬浮在MesenPro培养基中后，以每IOcm培养皿5000个的比例进行接种，在(X)2培养箱中培养2周。在开始培养至2周的时刻在倒置显微镜下进行观察，结果⑶34阳性细胞级分形成了多个增殖性菌落，与此相对，对于CD34阴性细胞仅发现了几个分化型菌落，之后也不能使其增殖(图幻。另外，在不进行悬浮培养、在皮肤组织解离后直接进行细胞分选的情况下，对于⑶；34阳性细胞级分也发现菌落，接着，将⑶34阳性细胞级分在MesenPro培养基中进行2次传代培养研究向脂肪和骨的分化能力，结果是高效分化为油红0阳性脂肪细胞或Kossa法阳性骨细胞(图6)。这说明，通过细胞分选得到的间充质干细胞与通过粘附法得到的真皮间充质干细胞相比，维持了高的分化能力(表1)。进而，可知在通过细胞分选得到的间充质干细胞中，间充质干细胞中高表达的因子NANOG、SDF-I α、HGF的表达也明显高于粘附法中得到的真皮间充质干细胞(图7)。表1 真皮间充质干细胞的分化能力
权利要求
1.一种真皮干细胞的分离方法，其特征在于，将通过酶处理从皮肤上解离出的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，所述干细胞标记物阳性细胞是CD34阳性细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，所述CD34阳性细胞进一步是NG2阳性。
4.根据权利1 3的任一项所述的方法，所述悬浮培养，进行对于使所述细胞的干细胞标记物的表达恢复所需足够的时间。
全文摘要
本发明提供一种真皮干细胞的分离方法，其特征在于，通过进行酶处理将从皮肤上解离的细胞进行悬浮培养，然后从该培养细胞中分离干细胞标记物阳性细胞。
文档编号G01N33/53GK102498205SQ20108004117
公开日2012年6月13日 申请日期2010年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者山西治代, 相马勤 申请人:株式会社资生堂