专利名称：人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测 试齐U盒。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为 犬、猫等动物。典型症状为恐水症，又称恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100%。随 着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断 扩大。从宠物医疗市场得到的信息，人们迫切希望了解宠物犬接种狂犬疫苗后犬只是否获 得保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，没有得到广泛的 应用。狂犬病毒是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于 印度。由于狂犬病是人畜共患性疾病，多数的人狂犬病是由与人类密切接触的带毒犬传播 的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。目前，用于人狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒，有一定的研究和报道，也 有一定的产品上市。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括普通ELISA方法、荧光免疫法、 放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。普通ELISA试剂盒多用原核表达的重组蛋 白或培养的全病毒做包被抗原。重组蛋白存在复性困难，缺乏空间构象表位的缺点，全病毒 存在不易纯化的缺点，这些都会导致检测灵敏度低下。荧光免疫法、放射免疫法及化学发光 法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免疫层 析法虽然有操作简单的优点，但是灵敏度比较低。宁波天润生物药业有限公司产品“人狂犬 病病毒IgG抗体测定试剂盒(酶联免疫法)，国药准字20060008”采用的狂犬病毒全病毒抗 原包被微孔板。中国专利公开号为CN101251537的专利申请公开了一种人和动物狂犬病中 和抗体竞争ELISA检测试剂盒。上述专利所用检测板包被方法为抗原直接包被法。

发明内容
本发明的目的是提供一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，本发明采 用单克隆抗体包被法间接包被抗原制备反应板，进而组成用间接免疫吸附实验检测犬抗狂 犬病毒IgG抗体的试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还弥补了由于抗 原问题而致的灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。本发明的技术方案为一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包 被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、 酶底物溶液和终止液，其特征在于酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液 0. 05M ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔 0. I-Iug ；封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗 原，包被量为每孔0. Ι-lug;样品稀释液为含有质量浓度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含有
3质量浓度0. 01-0. 05% NaN3的0. Olmol/L及pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为 辣根过氧化物酶_小鼠抗人IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0. 05%吐温-20 的0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液为3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液，酶底 物B溶液为双氧水溶液；终止液为lmol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。辣根过氧化物酶标记的是小鼠抗人IgG单克隆抗体。人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，其步骤是(1)抗狂犬 病毒单克隆抗体的制备用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾脏 细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞，用 ELISA方法和IFA(间接免疫荧光)方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆 化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克隆抗 体；(2) HRP-小鼠抗人IgG酶结合物的制备按常规方法提取纯化人IgG ；免疫BALB/c小 鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培 养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗人IgG的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后得 到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗人IgG的单克隆抗体；用改 良的过碘酸氧化法进行标记；最后酶标记物加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白 和50%的中性甘油，测定工作浓度后，-20°C保存备用；(3)上述各种溶液的配制①样品稀 释液0. 1-10% BSA,0. 01-0. 05% NaN3 的 0. 01mol/L,pH7. 2-7. 4 的磷酸盐缓冲液(PBS)；② 洗涤液在1000ml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐温-20 (Tween-20)；③酶底物3，3，-5， 5，-四甲基联苯胺(TMB)溶液i)底物A液称取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO) 中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL 纯化水，用乙酸调PH值为5. 0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度 为95-98%浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波 破碎、差速离心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，-20°C保存，作为包被用狂犬病毒用抗 原。本发明实验结果及分析1.特异性检测用本发明制造的试剂盒分别检测人狂犬病毒免疫血清，人阴性血 清，人乙脑疫苗免疫血清，操作和判定按照具体实施方式
中人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA 检测试剂盒的操作步骤进行，结果显示，人狂犬病毒免疫血清检测为阳性，其他样品检测为 阴性，特异性为100%。2.灵敏度检测用本发明制造的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清，操作和 判定按照具体实施方式
中人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤进行，检 测结果为最高检测到阳性参考样品的稀释度为1 640。


图1为本发明工艺流程图。
具体实施例方式一 .人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法
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1.狂犬病毒单克隆抗体的制备用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗 原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选 杂交瘤细胞，用ELISA方法和IFA方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆 化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克隆抗 体；2. HRP-小鼠抗人IgG酶结合物的制备按常规方法提取纯化人IgG ；免疫BALB/c 小鼠，得到抗原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性 培养基筛选杂交瘤细胞，用ELISA方法鉴定抗人IgG的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆化后 得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗人IgG的单克隆抗体；用 改良的过碘酸氧化法进行标记；最后酶标记物加入牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的 中性甘油，测定工作浓度后，-20°C保存备用；3.所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声 波破碎、差速离心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，-20°C保存，作为包被用狂犬病毒用 抗原；4.将狂犬病毒单克隆抗体均勻的包被在酶标板孔上，包被缓冲液为0.05M pH9.6 的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔0. I-Iug ；封 闭液为BSA或脱脂牛奶，浓度是1-10% ；封闭完再包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为每 孔0.I-Iug ；5.试剂盒其他溶液配制①样品稀释液BSA，0.05% NaN3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液在IOOOml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐 温-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液i)底物A液称取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩 液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度为95%浓硫酸加蒸馏水至IOOOml即可。二 .人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤1.将待检样本用样本稀释液10倍稀释，每孔加lOOul，同时加入阳性和阴性对照 液，设空白对照。置37°C孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加酶标抗体100ul，37°C 孵育1小时；洗涤液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光显色5-10分钟，加 入终止液，每孔50 μ 1。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm.2.结果判定Cutoff (C0值)=阴性对照光吸收值A450nmX2. 1倍，样品值=样品 光吸收值A450nm/C0值，样品值大于1判为阳性；样品值小于1判为阴性。
权利要求
一种人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其特征在于酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，1升溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，包被量为每孔0.1 1ug；封闭液为质量浓度是1 10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1 1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1 10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01 0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶 小鼠抗人IgG单抗酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温 20的0.01mol/L及pH7.2 7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’ 5，5’ 四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。
2.根据权利要求1所述的人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所 述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离 心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，_20°C保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。
全文摘要
本发明涉及人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。本发明试剂盒的特异性达100％；灵敏度为1∶640。本试剂盒用于人接种狂犬疫苗后的免疫效果评价。
文档编号G01N33/535GK101936997SQ20101025726
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者刘汉平, 刘洁, 廖园园, 彭杏, 温文生, 漆世华, 王威, 谢红玲 申请人:武汉中博生物股份有限公司