专利名称：一种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种电化学免疫传感器、其制备方法及其用途，更具体而言，本发明涉及一种基于Pd杂化SBA-15(介孔ニ氧化硅分子筛)的电化学免疫传感器、其制备方法，以及由该方法制备的电化学免疫传感器在測定人绒毛膜促性腺激素中的用途。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是ー种主要由胎盘组织的滋养层细胞分泌的涎糖蛋白。在正常情况下，健康的未孕人体内的浓度很低，可能检测不到。而异位妊娠、许多恶性非滋养细胞肿瘤以及非性腺肿瘤可产生异位hCG，因此hCG的检测成为预报早孕及流产，帮助异位妊娠及其相关疾病诊断的常用手段。目前hCG的检测方法主要有酶联免疫分析法、放射免疫測定法、时间分辨免疫荧光法等。但是这些方法在灵敏度、选择性、稳定性和可操作性方面都存在ー些局限性。近年来，电化学免疫传感器受到了广泛地关注，其分为夹心型电化学免疫传感器和无标记型电化学免疫传感器。与夹心型的电化学免疫传感器相比，无标记型电化学免疫传感器操作更为简便，它不需要进行ニ抗的固定。SBA-15, 一种介孔ニ氧化硅分子筛，具有较好的生物相容性和可调的孔径等优点，因此被广泛地用于生物传感器的构建。到目前为止，SBA-15已被用于葡萄糖氧化酶、细胞色素C、抗体的固定等。但是与SBA-15相比，Pd纳米粒子引入到SBA-15的孔道中得到的Pd杂化SBA-15不仅保持了 SBA-15良好的生物相容性的优点，而且又表现出Pd的很好的催化活性，进ー步提高电子的传递效率，所以可以更好地用于hCG抗体的固定。石墨烯具有极好的结晶性和非凡的电子学、热力学和力学性能，因此是人们广泛关注的焦点。在石墨烯的研究和应用中，为了充分发挥其优良性质，必须对石墨烯进行功能化。也就是在石墨烯材料优势基础上，进ー步对材料进行性能改性和优化，合成水溶性良好的磺酸化石墨烯(HS03-GS)，从而达到更好固定修饰材料的目的。本发明将磺酸化石墨烯及硫堇的复合物滴涂到玻碳电极表面，形成具有高表面能和良好氧化还原活性的复合膜。硫堇作为电子媒介体，以戊ニ醛做交联剂共价键合带氨基的Pd杂化SBA-15介孔材料，制备了基于Pd杂化SBA-15的无标记型电化学免疫传感器，测试结果显示，上述方法制备的电化学免疫传感器的灵敏度、选择性和稳定性高，基于上述发现，发明人完成了本发明。

发明内容
本发明的ー个目的是提供ー种电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器包括工作电极、參比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰磺酸化石墨烯及硫堇的复合物、戊ニ醛、Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。本发明的再ー个目的在于提供ー种电化学免疫传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便，避免了传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程、繁琐等缺点。本发明的另一目的是提供所述电化学免疫传感器在測定人绒毛膜促进腺激素中的用途。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的电化学免疫传感器包括工作电极、參比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰磺酸化石 墨烯及硫堇的复合物、戊ニ醛、Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。所述工作电极与參比电极、对电极组成电化学免疫传感器来检测hCG抗原。所述參比电极为饱和甘汞电极，对电极为钼丝电极。本发明的电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤a、合成磺酸化石墨烯；b、制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液；C、制备电化学免疫传感器工作电极；d、制作电化学免疫传感器工作曲线。其中，步骤a的合成磺酸化石墨烯,具体包括以下步骤①预还原用硼氢化钠在80°C预还原氧化石墨烯lh，以除去多数含氧官能团；②磺酸化用磺胺酸的芳基重氮盐冰浴2h ；③彻底还原用肼再去还原(100°C，24h)，用以除去剩余的含氧官能团。步骤b的制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液，具体包括以下步骤 ①将SBA-15加入到含有3-氨丙基三こ氧基硅烷的无水甲苯中回流反应20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；②称取PdCl2,向其中加入0. 2mol/L的HC1，用红外灯烤干即得H2PdCl4 ；③将氨基功能化的SBA-15与H2PdCl4以质量比I : I混合并用水稀释成溶液，将混合物在室温下搅拌24h ；④离心后用水重新稀释，用稀HCl调节溶液的pH小于2并搅拌至少30min。搅拌完之后，将50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都还原成金属Pd ；⑤将上述混合液离心并真空干燥，即得所需的Pd杂化SBA-15 ；⑥将hCG抗体溶液加入到6 8mg/mL的Pd杂化SBA-15溶液中超声，得到分散均匀的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液。步骤c的制备电化学免疫传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；②取一定浓度的磺酸化石墨烯和硫堇的复合物(体积比为2 : I I : I)均匀滴涂在上述玻碳电极表面，室温下晾干；③滴涂Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体，清洗晾干；④将上述处理的电极放置在I % BSA溶液中温育lh，用于封闭电极上的非特异性活性位点，最后修饰上hCG抗原，电极晾干井清洗。将制备好的免疫电极置于冰箱，在4. (TC下保存备用，即得到电化学免疫传感器的工作电极。步骤d的制作电化学免疫传感器工作曲线,步骤如下①将參比电极-饱和甘汞电极、对电极-钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；②pH 7.4的PBS缓冲溶液(含0. lmol/L KCl作为支持电解质)作为底液，采用循环伏安法分别测定不同hCG抗原浓度下电流值；绘制人绒毛膜促性腺激素传感器工作曲线。本发明的另一方面提供上述方法制备的电化学免疫传感器在測定人绒毛膜促进腺激素中的用途。本发明的有益成果(I)本发明的发明人首次将金属纳米粒子-介孔材料复合物(Pd杂化SBA-15)引入到人绒毛膜促进腺激素的电化学免疫传感器的制备当中，利用纳米材料的增效作用与介孔材料优异的固载作用，使所制作的电极有更高的灵敏度和更宽的检测范围。
(2)在本发明的制备方法中，将hCG抗体与Pd杂化SBA-15直接孵化，减少了电极的修饰步骤，提高了传感器的重现性和稳定性。(3)由本发明的方法制备的电化学免疫传感器，操作简单，检测速度快，可在短时间内实现大量样品的測定。(4)使用本发明的方法制备的电化学免疫传感器，因在检测液中加入了电子媒介体，使得电化学免疫传感器具有更高的灵敏度。本发明的电化学免疫传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，免疫分析检测迅速、方便，可用于临床分析。


下面结合

和具体实施例对本发明做进ー步详细描述。图I为本发明的电化学免疫传感器的工作曲线。
具体实施例方式本发明使用的人绒毛膜促性腺激素(hCG)和人绒毛膜促性腺激素抗体购自郑州市博赛生物技术研究所，PdCl2、碳酸钠和亚硝酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，硼氢化钠和对氨基苯磺酸购自中国上海试剂ー厂。除了玻碳电极用超纯水清洗外，整个实验过程用的均是二次水。CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。实施例I(I)磺酸化石墨烯的合成将37. 5mg的氧化石墨分散到37. 5g的水中。然后超声Ih后得到棕色的氧化石墨
烯悬浮液。预还原先用5wt%的碳酸钠溶液调节上述氧化石墨烯悬浮液的pH为9,将300mgNaBH4溶解到7. 5g水中，然后再将NaBH4溶液加到氧化石墨烯悬浮液中。将混合物在80°C条件下不断搅拌lh。该还原过程在氮气气氛下进行。悬浮液由咖啡色变为黑色。在还原反应结束后看到聚集，用水离心和清洗2 3次之后，经过超声，将部分还原的氧化石墨烯分散在37. 5g的水中，得到悬浮液；磺酸化23mg对氨基苯磺酸和9mg亚硝酸钠在5g水和0. 25g lmol/LHCl中反应，冰浴中形成重氮盐。在冰浴且不断搅拌的条件下，向部分还原的氧化石墨烯悬浮液中加入上述重氮盐溶液，且保持冰浴2h。反应混合物通入氮气赶走气泡。反应结束后离心并用水清洗2 3次后，将磺酸化的氧化石墨烯分散到37. 5g水中，得到悬浮液；彻底还原在之后的还原步骤中，把Ig的肼(50% )滴到2. 5g水中并加入到磺酸化步骤得到的悬浮液中，且反应混合物在不断搅拌的条件下保持100°c，24h。之后向混合物中加入5wt%的碳酸钠溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水彻底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通过超声将其均·勻分散在水中以配制成2mg/mL的磺酸化石墨烯溶液。(2)制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液将Ig SBA-15加入到含有ImL 3_氨丙基三こ氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流反应20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；称取0. 0887g的PdCl2，向其中加入6mL 0. 2mol/L的HC1，用红外灯烤干即得H2PdCl4 ；将氨基功能化的SBA-15与H2PdCl4以质量比I : I混合并用水稀释成溶液，将混合物在室温下搅拌24h ；离心后用水重新稀释，用稀HCl调节溶液的pH小于2并搅拌至少30min。搅拌完之后，将50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都还原成金属Pd；将上述混合液离心并真空干燥，即得所需的Pd杂化SBA-15 ；称取上述制备的Pd杂化SBA-15固体将其溶解在水中配制成浓度为6mg/mL的Pd杂化SBA-15溶液；将5mL浓度为12ng/mL hCG抗体溶液加入到5mL浓度为6mg/mL Pd杂化SBA-15溶液中，在4°C恒温振荡箱中震荡24h，得到分散均匀的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液；(3)制备电化学免疫传感器工作电极将4mm直径的玻碳电极用I. 0,0. 3,0. 05 u m的三氧化ニ铝抛光粉抛光处理，こ醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05mol/L铁氰化钾溶液中，在-0. 2
0.6V扫描，使峰电位差小于IlOmV,用超纯水清洗电极表面，吹干；固定上述步骤(I)制备的磺酸化石墨烯和硫堇溶液的浓度均为2mg/mL,将体积比为2 I的磺酸化石墨烯和硫堇混合溶液均匀滴涂在上述处理的玻碳电极表面，室温下晾干;然后滴涂上述步骤⑵中制备的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液，清洗晾干；将上述处理的电极放置在1% BSA溶液中温育lh，用于封闭电极上的非特异性活性位点，最后修饰上hCG，电极晾干井清洗。将制备好的免疫电极置于冰箱，在4. (TC下保存备用，即得电化学免疫传感器的工作电极。(4)制作电化学免疫传感器工作曲线打开电化学工作站，将參比电极-饱和甘汞电极、对电极-钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；IOmL pH 7. 4的PBS缓冲溶液作为底液，分别测定不同hCG抗原浓度下氧化峰的电
流值；
根据所得氧化峰电流值与hCG抗原浓度呈线性关系，绘制工作曲线，如图I所示。測定结果表明，hCG浓度在0.01 16.00ng/mL范围内成线性关系，线性相关系数为
0.9991。检出限为 8. 60pg/mL。实施例2(I)磺酸化石墨烯的合成将37. 5mg的氧化石墨分散到37. 5g的水中。然后超声Ih后得到棕色的氧化石墨
烯悬浮液。预还原先用5wt%的碳酸钠调节上述氧化石墨烯悬浮液的pH为10,将300mg NaBH4溶解到7. 5g水中，然后再将NaBH4溶液加到上述氧化石墨烯悬浮液中。将混合物在80°C条件下不断搅拌lh。该还原过程在氮气气氛下进行。悬浮液由咖啡色变为黑色。在还原反应结束后看到聚集，用水离心和清洗2 3次之后，经过超声，将部分还原的氧化石墨烯分散在37. 5g的水中，得到悬浮液；磺酸化23mg对氨基苯磺酸和9mg亚硝酸钠在5g水和0. 25g lmol/LHCl中反应，冰浴下形成重氮盐。在冰浴且不断搅拌的条件下，向部分还原的氧化石墨烯悬浮液中加入上述重氮盐溶液，且保持冰浴2h。反应混合物通入氮气赶走气泡。反应结束后离心并用水清洗2 3次后，将磺酸化的氧化石墨烯分散到37. 5g水中，得到悬浮液；彻底还原在之后的还原步骤中，把Ig的肼(50% )滴到2. 5g水中并加入到磺酸化步骤得到的悬浮液中，且反应混合物在不断搅拌的条件下保持100°c，24h。之后向混合物中加入5wt%的碳酸钠溶液用以沉淀磺酸化的石墨烯。在用水彻底清洗和真空干燥之后，得到磺酸化的石墨烯，通过超声将其均勻分散在水中以配制成2mg/mL的磺酸化石墨烯溶液。(2)制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液将Ig SBA-15加入到含有ImL 3_氨丙基三こ氧基硅烷的80mL无水甲苯中回流反应20h，得到氨基功能化的SBA-15 ；称取0. 0887g的PdCl2，向其中加入6mL 0. 2mol/L的HC1，用红外灯烤干即得H2PdCl4 ；将氨基功能化的SBA-15与H2PdCl4以质量比I : I混合并用水稀释成溶液，将混合物在室温下搅拌24h ；离心后用水重新稀释，用稀HCl调节溶液的pH小于2并搅拌至少30min。搅拌完之后，将50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都还原成金属Pd；将上述混合液离心并真空干燥，即得到所需的Pd杂化SBA-15 ；称取一定量的Pd杂化SBA-15固体将其溶解在水中配制成浓度为8mg/mL的Pd杂化SBA-15溶液；将5mL浓度为12ng/mL hCG抗体溶液加入到5mL浓度为8mg/mL Pd杂化SBA-15溶液中，在4°C恒温振荡箱中震荡24h，得到分散均匀的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液；(3)制备电化学免疫传感器工作电极将4mm直径的玻碳电极用I. 0,0. 3,0. 05 U m的三氧化ニ铝抛光粉抛光处理，こ醇
超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0. 05mol/L铁氰化钾溶液中，在-0. 2 0.6V扫描，使峰电位差小于IlOmV,用超纯水清洗电极表面，吹干；固定上述制备的磺酸化石墨烯和硫堇溶液的浓度均为2mg/mL,将体积比为I : I的磺酸化石墨烯和硫堇混合溶液均匀滴涂在上述玻碳电极表面，室温下晾干；然后滴涂上述Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液，清洗晾干；将上述处理的玻碳电极放置在 Iwt% BSA溶液中温育lh，用于封闭电极上的非特异性活性位点，最后修饰上hCG，电极晾干井清洗。将制备好的免疫电极置于冰箱，在4. (TC下保存备用，即得电化学免疫传感器的工作电极。(4)制作电化学免疫传感器工作曲线打开电化学工作站，将參比电极-饱和甘汞电极、对电极-钼丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；对人血清中的hCG进行了測定，根据实施例I所得工作曲线，计算血清中hCG的含量。五次测定结果表明，人体血样的五次测定结果分别为I. 54、I. 56、I. 52、I. 55、I. 51ng/mL，平均hCG含量为I. 54ng/mL，其结果与采用标准酶联免疫法得到的结果I. 57ng/mL基本一致。同时采用标准加入法，hCG的加入量为5. 00ng/mL，得到的平均回收率为101%，相对标准偏差为1.4%。说明本发明的制备方法得到的电化学免疫传感器具有较高的准确度和精密度。
权利要求
1.ー种电化学免疫传感器，其包括工作电极、參比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰磺酸化石墨烯及硫堇的复合物、戊ニ醛、Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液、牛血清蛋白和hCG抗原。
2.—种电化学免疫传感器的制备方法,所述方法包括 a、合成磺酸化石墨烯； b、制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液； C、制备电化学免疫传感器的工作电极； d、制作电化学免疫传感器的工作曲线。
3.如权利要求2中所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤a的 合成磺酸化石墨烯包括 (1)预还原用硼氢化钠在80°C预还原氧化石墨烯lh，以除去多数含氧官能团； (2)磺酸化用磺胺酸的芳基重氮盐冰浴2h； (3)彻底还原在100°C用肼再去还原24h，用以除去剰余的含氧官能团。
4.如权利要求2中所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤b的制备Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液包括 (1)将SBA-15加入到含有3-氨丙基三こ氧基硅烷的无水甲苯中回流反应20h，得到氨基功能化的SBA-15 ； (2)称取PdCl2,向其中加入0.2mol/L的HCl，用红外灯烤干即得H2PdCl4 ； (3)将氨基功能化的SBA-15与H2PdCl4以质量比I: I混合并用水稀释成溶液，将混合物在室温下搅拌24h ； (4)离心后用水重新稀释，用稀HCl调节溶液的pH小于2并搅拌至少30min;搅拌完之后，将50mmol/L的NaBH4溶液逐滴的加入到混合液中，直到所有的H2PdCl4都还原成金属Pd； (5)将上述混合液离心并真空干燥，即得所需的Pd杂化SBA-15； (6)将hCG抗体的溶液加入到6 8mg/mL的Pd杂化SBA-15溶液中超声，得到分散均匀的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体溶液。
5.如权利要求2中所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤c的制备电化学免疫传感器的工作电极包括 (1)将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁； (2)以体积比为2: I I : I取步骤a合成的磺酸化石墨烯和硫堇的复合物，均匀滴涂在所述玻碳电极表面，室温下晾干； (3)滴涂步骤b制备的Pd杂化SBA-15孵化的hCG抗体，清洗晾干； (4)将上述处理的玻碳电极放置在Iwt% BSA溶液中温育lh，用于封闭电极上的非特异性活性位点，最后修饰上hCG抗原，电极晾干井清洗，将制备好的免疫电极置于冰箱，在4.(TC下保存备用，即得电化学免疫传感器工作电极。
6.如权利要求2中所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤d的制作电化学免疫传感器工作曲线包括 (I)将參比电极、对电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上，所述參比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为钼丝电极；(2)pH 7. 4的含0. lmol/L KCl作为支持电解质的PBS缓冲溶液作为底液，采用循环伏安法分别测定不同hCG抗原浓度下电流值；绘制人绒毛膜促性腺激素电化学免疫传感器エ作曲线。
7.权利要求I所述的电化学免疫传感器在測定人绒毛膜促进腺激素中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种电化学免疫传感器、其制备方法和应用。本发明首次将金属纳米粒子-介孔材料复合物(Pd杂化SBA-15)引入到人绒毛膜促进腺激素(hCG)的电化学免疫传感器的制备当中磺酸化石墨烯及硫堇的复合物滴涂到玻碳电极表面，形成具有高表面能和良好氧化还原活性的复合膜。硫堇作为电子媒介体，以戊二醛做交联剂共价键合带氨基的Pd杂化SBA-15介孔材料，制备了基于Pd杂化SBA-15的hCG电化学免疫传感器，在最佳条件下绘制了工作曲线并实现了血清样品中hCG的测定。本发明的电化学免疫传感器在检测hCG中表现出灵敏度高、重现性好、操作简便、快速的优点，为其它肿瘤标志物的检测提供了一条新的途径。
文档编号G01N27/26GK102735728SQ201210230340
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月5日 优先权日2012年7月5日
发明者吴丹, 张勇, 杜斌, 桑欣欣, 蔡燕燕, 马洪敏, 魏琴 申请人:济南大学