专利名称：雪卡毒素钠离子荧光探针检测法的制作方法
技术领域：
本发明属于荧光检测方法领域，尤其涉及雪卡毒素钠离子荧光探针检测法。
背景技术：
当前，世界各国都在积极地开展雪卡毒素的检测和预防方面的研究。已有多种检测分析方法的研究成果，雪卡毒素的检测方法目前主要有小鼠生物法，免疫学检测法，高效液相色谱_质谱联用法，以及传统的细胞检测法。20世纪90年代末国外研究者首次报道雪卡毒素能与钠离子通道蛋白结合，使钠离子通道开放，具有钠离子通道激活剂的性质。传统的细胞检测法是利用雪卡毒素对细胞的毒性效应来检测毒素的一种技术。其基本原理是利用雪卡毒素使钠离子通道开放的性质，结合钠钾泵抑制剂，当雪卡毒素和钠钾泵抑制剂共同作用于细胞时，钠离子过度内流， 造成细胞肿胀，甚至死亡。当加入了拮抗剂毒素(如河豚毒素等)时，可使部分细胞“救活”， 从细胞存活率或者死亡率可反映雪卡毒素的存在。传统的细胞检测法通过细胞的存活状况来进行雪卡毒素含量的检测，而雪卡毒素使钠离子通道开放的性质不一定导致细胞死亡，细胞的死亡也不一定都是由Na +离子内流导致，因此传统的细胞检测法存在灵敏度较低，特异性不高，检测结果容易受干扰的缺点。

发明内容
为解决现有技术中存在的灵敏度较低，特异性不高，检测结果容易受干扰的问题， 本发明提供一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，可通过直接检测细胞钠离子流的变化来检测雪卡毒素。一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，包括如下步骤
A)培养细胞，种96孔黑板，置于细胞培养箱中培养；
B)培养24h后，弃去培养基，PBS洗涤2 3次，选用不同浓度的雪卡毒素染毒细胞；
C)染毒12 24h后，弃去培养基，加入钠离子荧光探针染色，置于细胞培养箱中避光孵
育；
D)平衡盐溶液洗涤2 3次后，多功能酶标仪检测各孔的荧光强度；
E)建立钠离子荧光探针检测法的标准曲线。作为本发明的进一步改进，所述步骤A)包括培养小鼠脑神经瘤细胞(N_2a)，待细胞长至80、0%汇合度，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后去上清液，加入 RPMI-1640培养基重悬细胞使其密度为3 X IO5个/mL，接种100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于细胞培养箱中培养。小鼠脑神经瘤细胞购自中科院上海细胞库，其钠离子通道丰富，对雪卡毒素敏感，接种量适当，有利于提高雪卡毒素检测的灵敏度。作为本发明的进一步改进，所述步骤B)包括每孔加入90 μ L0. 25 mmol/L的乌苯苷溶液和10 UL雪卡毒素标准品(P-CTX-I)或样品溶液，雪卡毒素标准品的浓度梯度为 Γ107 pg/L ；设置空白对照组每孔加入100 μ L RPMI-1640基础培养基；设置溶剂对照组每孔加入90 μ L0. 25 mmol/L的乌苯苷溶液和10 μ L 10%甲醇。雪卡毒素能与钠离子通道蛋白质结合，激活钠离子通道，使钠离子内流。在消耗ATP的情况下，细胞膜表面的钠钾泵能不断地将钠离子往细胞外运，将钾离子往细胞内运，因此，为了避免钠钾泵对钠离子流的干扰，本发明在用不同浓度的雪卡毒素染毒细胞的同时，加入乌苯苷溶液，乌苯苷起钠钾泵抑制剂的作用。作为本发明的进一步改进，所述步骤C)的染毒时间为18 h，与染毒12 h和24 h 相比，染毒18 h时标准曲线的确定系数更高。作为本发明的进一步改进，所述钠离子荧光探针为CoroNa Green,购自 Invitrogen公司，货号为C36676，用平衡盐溶液(HBSS)稀释至浓度为5 μ mol/L,每孔加入 100 μ Lo CoroNa Green的激发波长为492 nm，发射波长为516 nm。与现有技术相比，本发明的有益效果是雪卡毒素钠离子荧光探针检测法直接检测雪卡毒素导致的钠离子流变化，特异性强，能更灵敏地检测出雪卡毒素，检测时间由传统细胞检测法的24 h缩短为18 h。


图1为本发明实施例一的标准曲线。图2为本发明实施例二的标准曲线。图3为本发明实施例三的标准曲线。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例一钠离子荧光探针检测法检测雪卡毒素。培养小鼠脑神经瘤细胞(N-2a)，待细胞长至80 90%汇合度，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后去上清液，加入RPMI-1640培养基重悬细胞使其密度为 3 X IO5个/mL，接种100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于37°C及5% CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。培养24 h后，弃去培养基，PBS洗涤2 3次，实验组各孔加入90 μ L乌苯苷溶液和10 μ L雪卡毒素标准品(P-CTX-1)，雪卡毒素标准品的浓度梯度为广IO7 pg/L，设置溶剂对照组和空白对照组，各试验组均设置3个平行。染毒12 h后，弃去培养基，加入 100 μ L浓度为5 μ mol/L的钠离子荧光探针CoroNa Green染色，置于细胞培养箱中避光孵育30 min0孵育后，HBSS洗涤2次，用TECAN多功能酶标仪检测各孔的荧光强度，激发波长492 nm，发射波长516 nm。以P-CTX-l浓度为横坐标，实验组减去空白对照组的荧光强度值为纵坐标，建立雪卡毒素钠离子荧光探针检测法的标准曲线，如图1所示。从图1可以看出，荧光强度值与P-CTX-I浓度在1(Γ105 pg/L范围内具有线性关系(R2=O. 9632)。当 P-CTX-I浓度高于IO5 pg/L时，应先进行稀释后再检测。表ι不同浓度P-CTX-I染毒12 h对焚光强度值的影响
权利要求
1.一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，其特征在于包括如下步骤A)培养细胞，种96孔黑板，置于细胞培养箱中培养；B)培养24h后，弃去培养基，PBS洗涤2 3次，选用不同浓度的雪卡毒素染毒细胞；C)染毒12 24h后，弃去培养基，加入钠离子荧光探针染色，置于细胞培养箱中避光孵育；D)平衡盐溶液洗涤2 3次后，多功能酶标仪检测各孔的荧光强度；E)建立钠离子荧光探针检测法的标准曲线。
2.根据权利要求1所述的雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，其特征在于所述步骤A) 包括培养小鼠脑神经瘤细胞(N-2a)，待细胞长至80 90%汇合度，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA 消化收集细胞，离心后去上清液，加入RPMI-1640培养基重悬细胞使其密度为3 X IO5个/ mL，接种100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于细胞培养箱中培养。
3.根据权利要求1所述的雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，其特征在于所述步骤B) 包括设置实验组每孔加入90 μ L0. 25 mmol/L的乌苯苷溶液和10 μ L雪卡毒素标准品 (P-CTX-I)或样品溶液，雪卡毒素标准品的浓度梯度为广IO7 pg/L ；设置空白对照组每孔加入100 μ L RPMI-1640基础培养基；设置溶剂对照组每孔加入90 μ L0. 25 mmol/L的乌苯苷溶液和10 μ L 10%甲醇。
4.根据权利要求1所述的雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，其特征在于所述步骤C) 的染毒时间为18 h。
5.根据权利要求1至4中任一项所述雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，其特征在于 所述钠离子荧光探针为CoroNa Green0
全文摘要
本发明涉及一种雪卡毒素钠离子荧光探针检测法，属于荧光检测方法领域。本发明包括步骤A)培养细胞，种96孔黑板，置于细胞培养箱中培养；B)培养24h后，弃去培养基，PBS洗涤2~3次，选用不同浓度的雪卡毒素染毒细胞；C)染毒12~24h后，弃去培养基，加入钠离子荧光探针染色，置于细胞培养箱中避光孵育；D)平衡盐溶液洗涤2~3次后，多功能酶标仪检测各孔的荧光强度；E)建立钠离子荧光探针检测法的标准曲线。本发明主要应用于雪卡毒素的检测。
文档编号G01N21/64GK102253023SQ201110149270
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月3日 优先权日2011年6月3日
发明者刘建军, 庄志雄, 徐新云, 杨慧, 柯跃斌, 程锦泉, 袁建辉 申请人:深圳市疾病预防控制中心