专利名称：腺苷脱氨酶诊断试剂盒及腺苷脱氨酶活性浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱 氨酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核 酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别
诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病 鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据
申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结
晶粉末)+水(H20 )腺苷脱氨酶肌苷(Inosine ) +氨离子(NH/)，此反 映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸 光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院 的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广 应用。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还 原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定腺 苷脱氨酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的腺苷脱 氨酶诊断试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动
5生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高， 因而可以得到切实的推广应用。
本发明腺苷脱氨酶活性浓度测定方法原理如下 腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子
氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶 谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l，3-双磷酸+还原型辅酶
这种方法应用腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase; EC 3.5.4.4)酶(偶)联谷 氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶j足反应连续监湖lj 法。腺苷脱氨酶酶解腺苷反应产生氨离子，再通过(偶)联合谷氨酰胺合成 酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还 原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在 340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测 算腺苷脱氨酶酶的活性浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无 论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂较为 理想
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
月泉昔 6 mmol/L
谷氨酸 12mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 2mmol/L
本发明的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺 苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试 剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-
磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷 酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉 状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸。试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。
辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷 酸、甘油醛-3-磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以 是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法，其 辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液100 mmol/L
稳定剂500 mmol/L
辅酶3 mmol/L
谷氨酰胺合成酶6000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶10000U/L
腺苷6 mmol/L
谷氨酸12 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
甘油醛-3-磷酸2 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂 的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约l分钟左 右，检测时间2分钟左右，理论K值4180。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓
本实〗 试剂1
腺苷脱氨酶诊断试剂为双试剂，包括:
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液
稳定剂
辅酶
腺苷
腺苷三磷酸
甘油醛-3-磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
试剂2
二 f始
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
谷氨酰胺合成酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶
100mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 10000 U/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度
《0.1,测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测腺苷脱氨酶样品与试剂 1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大 约1分钟左右，检测时间2分钟左右，理论K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓 度大小。
实施例三 本实扭
腺苷脱氨酶诊断试剂为三试剂，包括:
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
腺苷
腺苷三磷!
甘油醛-3-磷酸
画mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 6 mmol/L 12 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
甘油醛-3-磷酸脱氢酶
100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L
试剂3
10三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定腺苷脱氨酶活性浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反 应时间10分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm， 被测腺苷脱氨酶样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应 方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右， 理论K值2170。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪 下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓 度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达 到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪 器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光度 时间反应曲线应呈直线上升；试剂可测有效(R^0.99)线形范围可达450U/L; 试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过士 5 %;试剂测试的精密度(重复 性)的变异系数(CV) 《2 %;试剂的灵敏度可达0.0003 ± 0.0001 △A/min/U/L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广 应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶活性浓度测定方法，其方法原理如下腺苷+水 <u>腺苷脱氨酶</u> 肌苷+氨离子氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 <u>甘油醛-3-磷酸脱氢酶</u>甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小测定结果。
2. —种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液20—一500 mmol/L稳定剂1———4000 mmol/L辅酶l一6 mmol/L谷氨酰胺合成酶IOOO-——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶画O-——80000 U/L腺苷l一50 mmol/L谷氨酸l一50 mmol/L腺苷三磷酸l一50 mmol/L甘油醛-3-磷酸l一50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、 谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、 谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成。辅酶、 谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘 油醛-3-磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、腺苷、 谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、 稳定剂、辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定 齐U、谷氨酰胺合成酶组成。辅酶、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、 腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中 的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 l"4000mmol/L或0.1。/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定腺苷脱氨酶活性浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、腺苷、谷氨酸、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、谷氨酰胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464264SQ20071019141
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司