专利名称：水中痕量微囊藻毒素的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种测定水中痕量微囊藻毒素MCLR的简便常规检测方法。
背景技术：
随着水体污染和富营养化程度的加剧，我国的湖泊和水库频频发生大规模的水华，其水华优势种主要是微囊藻和鱼腥藻。水华微囊藻和鱼腥藻能够产生多种藻类毒素，称为微囊藻毒素。目前已经鉴定结构的微囊藻毒素有60多种，其中微囊藻毒素MCLR是已知的微囊藻毒素中毒性最大，分布最广泛的一种。它对蛋白磷酸酶I和IIA有强烈的抑制作用，其毒性主要是诱发肝癌。其结构如图1所示。世界卫生组织和我国最新的地表水水质标准《GB3838-2002》中规定，水中微囊藻毒素MCLR的安全浓度为1μg/L。对水体中特别是作为饮用水源水的湖泊和水库中的微囊藻毒素MCLR检测非常必要。
目前，微囊藻毒素MCLR的检测方法主要有化学检测法和生物化学检测法。化学检测法使用较多的是高效液相色谱、薄层分析、毛细管电泳以及它们的联用技术等。生物化学检测法主要包括酶联免疫吸附分析、蛋白磷酸酶抑制分析和生物传感器法等。化学检测法的优点在于可以准确定性定量，但其前处理比较复杂、时间长；生物化学分析法的优点是灵敏度高，在处理大批样品时分析速度快，但不能很好鉴别毒素，有时会出现假阳性反应。在实际应用中酶联免疫吸附分析等生物化学方法操作复杂，特异性强的抗体不易获得；带质谱检测器的高效液相色谱价格昂贵，不适应于水中微囊藻MCLR的常规水质分析检测。

发明内容
本发明的目的是提供一种测定水中痕量微囊藻毒素MCLR的简便常规检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案。该方案按下列步骤顺序进行(1)、水样的预处理取水样，用离心机获得上清液(A)和藻细胞并分别保存，待用；(2)、藻细胞的处理将藻细胞转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，经研麿后用离心机获取上清液(B)待用；(3)、样品的浓缩将上清液(A)加热，缩短至10mL左右，获得溶液(C)；将上清液(B)和溶液(C)放入氮吹仪中，用氮气吹脱浓缩至1mL左右。
(4)、样品的纯化取Water公司Oasis HLB固相萃取柱，加入1mL纯甲醇活化柱子，然后加1mL水调节，再加入样品上清液(B)或溶液(C)1mL，再加入甲醇∶水(体积比)＝80∶20的含2％氨水的溶液1mL作为淋洗液，再加入甲醇∶水(体积比)＝40∶60的含2％醋酸的溶液1mL作为洗脱液，收集洗脱液(D)和(E)待测；(5)、流动相的配制将甲醇和水按体积比为甲醇∶水＝50∶50进行混合，其中水溶液和甲醇分别用三氟乙酸(TFA)调节至pH为2.11±0.05，然后脱气，过滤后配制成流动相；(6)、样品分析Agilent 1100液相色谱仪，配二极管阵列DAD检测器、色谱数据工作站(A.09.01版)、HT-130型柱温箱和TC-100柱温控制器，DIAMONSIL(TM)ODS C18分析色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)和C18保护预柱，流动相按(5)方法配制，流动相流速1mL/min，等度洗脱，检测波长为238nm，进样量100μL，色谱柱柱温控制在30℃；自动进样器进样(D)和(E)液相色谱检测分析，色谱数据工作站计算结果。
所述的水样的预处理中的水样用离心机在4000转/分钟下，离心20分钟后，获得上清液和藻细胞。
本发明在所述的藻细胞转移至研钵后，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，研麿20分钟，并在离心机4000转/分钟转速下，离心20分钟，获取上清液(B)。
所述的样品浓缩过程中采用微波炉加热方法加热上清液。
本发明的优点为1.广泛适应性本检测法可以适用于包括湖泊、水库以及自来水等水样中和藻细胞微囊藻毒素MCLR的检测。
2.仪器化分析的先进性本发明应用了合理的色谱分离体系，微囊藻毒素MCLR可以与其它组分清晰分离，仪器分析确保了微囊藻毒素MCLAR定量的准确测定。
3.低毒害性本发明所用流动相为含三氟乙酸的甲醇水溶液，避免了传统的流动相使用乙晴对实验人员的毒害和使用磷酸盐缓冲液对仪器的损害。
4.本测定方法还具有操作简便、快速的特点。微波加热浓缩样品可大大节省前处理的时间。本发明的液相色谱条件检测MCLR的出峰时间为3.587分钟，与传统的10-15分钟出峰相比，更快速，更方便。
5.微囊藻毒素MCLR的标定值一经建立，并输入色谱工作站电脑中，可长期使用此响应值作为定量值；无须再作化学标定。
本发明所述的方法，其线性范围0.1-20mg/L，线性相关系数为0.9999，最小检测量为2ng。方法的回收率82％以上，日内和日间RSD分别小于0.64％和2.4％。本发明重现性好，能够方便灵敏的测定水中和藻细胞中痕量微囊藻毒素MCLR。


图1是微囊藻毒素MCLR的结构2是本发明的实际样品的色谱图。
具体实施例方式实施例1，本发明按下列步骤顺序进行1.样品是某池塘水样2.水样的预处理取水样500mL用离心机在4000转/分钟下，离心20分钟，获得上清液(A)和藻细胞，并将上清液(A)和藻细胞分别保存，待用。
3.藻细胞的处理将藻细胞转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，研磨20分钟，在4000转/分钟下，离心20分钟，取上清液(B)待用。
4.样品的浓缩将上清液(1)用微波加热，缩短至10mL左右，获得溶液(C)。将上清液(B)和溶液(C)放入氮吹仪中，用氮气吹脱浓缩至1mL左右。
5.样品的纯化取Water公司Oasis HLB固相萃取柱，加入1mL纯甲醇活化柱子，然后加1mL水调节，再加入样品上清液(B)或溶液(C)1mL，再加入甲醇∶水(体积比)＝80∶20的含2％氨水的溶液1mL作为淋洗液，再加入甲醇∶水(体积比)＝40∶60的含2％醋酸的溶液1mL作为洗脱液，收集洗脱液(D)和(E)待测。
6.流动相的配制将甲醇和水按体积比为甲醇∶水＝50∶50进行混合，其中水溶液和甲醇分别用三氟乙酸(TFA)调节至pH为2.11±0.05，然后脱气，过滤后配制成流动相；7.样品分析Agilent 1100液相色谱仪，配二极管阵列DAD检测器、色谱数据工作站(A.09.01版)、HT-130型柱温箱和TC-100柱温控制器，DIAMONSIL(TM)ODS C18分析色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)和C18保护预柱，流动相按(5)方法配制，流动相流速1mL/min，等度洗脱，检测波长为238nm，进样量100μL，色谱柱柱温控制在30℃。自动进样器进样(D)和(E)液相色谱检测分析，色谱数据工作站计算结果。
8.色谱分离结果色谱分离情况良好分离图示于图2。所得结果，该池塘水样中微囊藻毒素MCLR的含量为0.45μg/L。
实施例2，本实施例按下列步骤顺序进行1.样品是某湖泊水样2.水样的预处理取水样350mL用离心机在3200转/分钟下，离心30分钟，获得上清液(A)和藻细胞，并将上清液(A)和藻细胞分别保存，待用；3.藻细胞的处理将藻细胞转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，研磨16分钟，在3200转/分钟下，离心30分钟，取上清液(B)待用；4.样品的浓缩将上清液(A)用其它加热方式如红外线加热，缩短至10mL左右，获得溶液(C)。将上清液(B)和溶液(C)放入氮吹仪中，用氮气吹脱浓缩至1mL左右。
以下步骤顺序与实施例1相同。
实施例3，本实施例按下列步骤顺序进行1.样品是某地自来水水样2.水样的预处理取水样650mL用离心机在4600转/分钟下，离心15分钟，获得上清液(A)和藻细胞，并将上清液(A)和藻细胞分别保存，待用；3.藻细胞的处理将藻细胞转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，研磨25分钟，在4600转/分钟下，离心15分钟，取上清液(B)待用；4.样品的浓缩将上清液(A)用其它加热方式如红外线加热，缩短至10mL左右，获得溶液(C)。将上清液(B)和溶液(C)放入氮吹仪中，用氮气吹脱浓缩至1mL左右。
以下步骤顺序与前两实施例相同。
权利要求
1.一种水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于该方法按下列步骤顺序进行(1)、水样的预处理取水样，用离心机获得上清液(A)和藻细胞并分别保存，待用；(2)、藻细胞的处理将藻细胞转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，经研磨后用离心机获取上清液(B)待用；(3)、样品的浓缩将上清液(A)加热，缩短至10mL左右，获得溶液(C)；将上清液(B)和溶液(C)放入氮吹仪中，用氮气吹脱浓缩至1mL左右。(4)、样品的纯化取Water公司Oasis HLB固相萃取柱，加入1mL纯甲醇活化柱子，然后加1mL水调节，再加入样品上清液(B)或溶液(C)1mL，再加入甲醇∶水(体积比)＝80∶20的含2％氨水的溶液1mL作为淋洗液，再加入甲醇∶水(体积比)＝40∶60的含2％醋酸的溶液1mL作为洗脱液，收集洗脱液(D)和(E)待测；(5)、流动相的配制将甲醇和水按体积比为甲醇∶水＝50∶50进行混合，其中水溶液和甲醇分别用三氟乙酸(TFA)调节至pH为2.11±0.05，然后脱气，过滤后配制成流动相；(6)、样品分析Agilent1100液相色谱仪，配二极管阵列DAD检测器、色谱数据工作站(A.09.01版)、HT-130型柱温箱和TC-100柱温控制器，DIAMONSIL(TM)ODS C18分析色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)和C18保护预柱，流动相按(5)方法配制，流动相流速1mL/min，等度洗脱，检测波长为238nm，进样量100uL，色谱柱柱温控制在30℃；自动进样器进样(D)和(E)液相色谱检测分析，色谱数据工作站计算结果。
2.根据权利要求1所述的水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于水样的预处理中的水样用离心机在3200---4600转/分钟下，离心15---30分钟后，获得上清液(A)和藻细胞。
3.根据权利要求2所述的水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于水样是用离心机在4000转/分钟下，离心20分钟后，获得上清液(A)和藻细胞。
4.根据权利要求1或2或3所述的水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于藻细胞在转移至研钵中，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，研磨16---25分钟，并在离心机3200---4600转/分钟转速下，离心15---30分钟，获取上清液(B)。
5.根据权利要求4所述的水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于所述的研磨时间为20分钟，并在离心机4000转/分钟转速下，离心20分钟，获取上清液(B)。
6.根据权利要求1所述的水中痕量微囊藻毒素MCLR的检测方法，其特征在于所述的样品浓缩是采用微波炉加热方法加热上清液。
全文摘要
本发明公开了一种测定水中痕量微囊藻毒素的简便常规检测方法，它采用微波处理浓缩水样，用75％的甲醇作为藻细胞中微囊藻毒素MCLR的提取剂，用OasisHLB固相萃取柱纯化样品，用甲醇∶水(体积比)＝80∶20的含2％氨水的溶液作为固相萃取洗脱液，用甲醇∶水(体积比)＝40∶60的含2％醋酸的溶液作为固相萃取淋洗液，用液相色谱紫外检测器测定微囊藻毒素MCLR的含量；该方法线性范围0.1－20mg/L，线性相关系数为0.9999，最小检测量为2ng；方法的回收率82％以上，日内和日间RSD分别小于0.64％和2.4％；本发明重现性好，能够方便灵敏的测定水中和藻细胞中痕量微囊藻毒素MCLR。
文档编号G01N1/34GK1546991SQ20031010910
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月5日 优先权日2003年12月5日
发明者张杭君, 张建英, 陈英旭 申请人:浙江大学