专利名称：血液检查方法
技术领域：
本发明涉及从血液中取出规定细胞内的成分，通过生物化学检查，可早期准确把握病态的血液检查方法。
背景技术：
以往，取出作为血液液体部分的血浆中的成分，进行生物化学分析的血液检查，作为有效把握患者病态的体检检查方法之一，在多数医疗现场进行。
通过这种血液检查想要把握的病态有许多种，但是，例如以糖尿病的情况为例，测定患者空腹时和饭后血液中(血浆中)的葡萄糖浓度。这样，所测葡萄糖的浓度，即血糖值高达规定值以上时，可判定糖尿病乃至糖尿病发生的可能性很高。另外，例如是慢性呼吸器官疾病或心衰、肾衰的场合，可测定血液中(血浆中)的乳酸浓度，所测乳酸浓度高达规定值以上时，可以判定慢性呼吸器官疾病或心衰、肾衰发生的可能性很高。
众所周知，人的细胞是将葡萄糖作为主要的能源，在夜间，脑，神经、血细胞、肌肉等全身的细胞都利用糖。另一方面，肝脏由脂肪或氨基酸合成糖并放出。通常肝脏的糖放出率与全身细胞的糖利用率一致，因此血糖值为一定值(109mg/dl)以下。
这样，由全身细胞摄入并有效利用葡萄糖的是称作胰岛素的激素。当摄取食物时，糖质形成葡萄糖，由小肠迅速吸收，进入血液中，从而流遍全身。由此，当血糖值上升时，瞬间从胰脏分泌出足量的胰岛素。这样，肝脏停止糖的释放。另一方面，成为全身细胞摄取糖，上述饭后上升的血糖值会迅速恢复到饭前的数值。重复这种过程是健康人的血糖值的变化。
然而，尽管饭后血糖值上升，但对于所谓“胰岛素分泌缓慢，或分泌量很少”的体质的人，再加上运动不足或过量饮食等，胰岛素的功能不断降低时，上述葡萄糖难以摄入到细胞内，血液中会积存过量的葡萄糖。这样，饭后即使经过相当长的时间，血糖值也不会降低。
这种状况是“高血糖”状态，通过上述以前一般的生化血液检查方法，要想把握该高血糖状态时，如上所述，将血液中的血浆成分作为检测体，进行空腹时的血糖值(FBS)和饭后的血糖值的测定。结果，例如，空腹时血浆中的血糖值在140mg/dl以上，饭后该血糖值在200mg/dl以上时，一般诊断为糖尿病(2型糖尿病)。当这种高血糖状态长时间持续时，会出现视网膜症、肾病等糖尿病所特有的血管障碍。另外，如果血糖值越高，其持续时间也就越长，视网膜症和肾病也就越恶化。
然而，近年来，使用上述以前一般的生化血液检查，即，血浆成分中的血糖值检查，对于诊断为糖尿病血糖值并不高的患者，心肌梗塞发病的情况增多。即，可以确认对于所谓的糖尿病予备大军的早期、轻症的糖尿病患者，也动脉硬化症也发作、进展。
例如，饭前的血糖值在正常范围内，属于健康正常。然而，发现每次饭后血糖值异常增高的情况(所谓轻症2型糖尿病)。象这样，即使饭前血糖值在正常范围内，饭后血糖值异常增高时，胰岛素慢于该血糖值的升高，但是，受高血糖刺激，过量分泌。当然，对于具有运动习惯的患者来说，上述由胰脏分泌的胰岛素将葡萄糖摄入肌肉中，但对于缺乏运动的患者来说，被脂肪细胞摄入。摄入脂肪细胞内的糖变成脂防，加速了肥胖，引起高血脂症。这样，高胰岛素血症的持续导致高血压症。
结果，具有上述所谓胰岛素分泌图形迟缓型体质的人，由于符合所说的「轻型糖尿病(轻症2型)」、「稍有肥胖」、「轻度高血脂症」、「轻度高血压」的恶化条件，所以动脉硬化症容易进展，这通过颈动脉壁的回波检查等，已经被证实。事实上，据报导，根据最近日本的研究，观察10年内已诊断为糖尿病的民众时，每10人中，就有1人并发心肌梗塞，还有1人并发脑梗塞。因此，如果直系亲属中有患糖尿病的人，在诊断为糖尿病之前，应当注意过量饮食和缺乏运动，说到此处，对于糖尿病，要求事前重视、早期掌握病态的必要性。
然而，上述将血液的血浆成分作为检测体的以前的生化检查方法，只不过是相同成分从作为血液细胞的红细胞中向外部渗出，在血浆中表象，然后开始进行分析判断，因此无论怎样，判定缓慢，存在未必能有效应对上述早期掌握病态的要求的问题。
到目前为止，临床进行的红细胞检查，只有红细胞数、血细胞比容值、血红蛋白量的测定、网状红细胞、异常血红蛋白的检查等，实际上，取出红细胞中细胞内液成分，简便地进行生化检查的血液检查方法还未提出。
发明公开本发明人对能够进行早期准确把握病态的血液检查方法进行了悉心研究，结果发现分析先期支配血浆中葡萄糖浓度的血液细胞红细胞内的成分状态变化(葡萄糖浓度的升高，代谢状态等)本身，对于掌握早期病态是十分重要的。即，为了能够掌握本来早期的病态，作为血液细胞成分，具有将血浆中摄入的葡萄糖解糖分解的代谢功能，知道在上流侧先期支配血浆中血糖值的红细胞细胞内的葡萄糖浓度(血糖值状态)是非常重要的。另一方面发现，如果测定具有上述糖尿病及其他病态的患者的血液中氧化还原电位(ORP)，病态时，氧化还原电位处于氧化状态，健康时，处于还原状态。这些均成为能够把握上述早期病态的有益判定参量，此时，上述红细胞中乳酸浓度对确定该氧化还原电位具有很大的影响，和上述情况一样，与该红细胞内的氧化还原电位一起，知道作为糖质代谢物的丙酮酸浓度和乳酸浓度是非常重要的。本发明着眼于这样的事实，其目的是提供一种血液检查方法，其特别是通过测定血液的红细胞细胞内葡萄糖浓度、乳酸浓度和丙酮酸浓度，以及氧化还原电位等，分别利用这些参量或将这些参量综合，适当把握病态，从而对于一般血液生化检查有效的各种病态，能从早期轻症阶段准确且确实地把握病态。
本发明为达到上述目的，提供一种具有如下(a)～(h)步骤的血液检查方法。
(a)将哺乳动物血样离心，分离成血浆成分和血细胞成分的步骤，(b)从该血细胞成分除去棕黄层，得到红细胞的步骤，(c)用缓冲生理食盐水洗涤该红细胞的步骤，(d)向该洗净过的红细胞中加入缓冲生理食盐水，得到红细胞悬浮液的步骤，(e)将该红细胞悬浮液离心，除去上清液成分，得到红细胞层的步骤，(f)向该红细胞层中加入高渗压液，为得到含有利用浸透压渗出的红细胞细胞内成分的悬浮液，将得到的混合物在25～40℃下保持充分时间的步骤，(g)将该悬浮液离心，收集含有上述红细胞细胞内成分的上清液的步骤，(h)测定该上清液，确定选自葡萄糖浓度、丙酮酸浓度、乳酸浓度和氧化还原电位中至少1个因素的步骤。
根据这样的构成，与以前使用作为血细胞外液体成分的血浆成分进行血液检查的方法不同，由先期支配血浆中成分状态的血液细胞即红细胞内的成分，测定血糖值，或丙酮酸值、乳酸值、氧化还原电位，在时间上，先期知道尚未在血浆侧表现的红细胞细胞内的血糖值上升和丙酮酸值、乳酸值、氧化还原电位的变化，这与在血浆侧表现出相比要早。
为此，对糖尿病、慢性呼吸器官疾病、心衰、肾衰等各种病症状况，可作出早期诊断，并进行准确的相应治疗。
结果，如果利用本发明的血液检查方法，则可以正确判断利用以往由血液细胞外成分即血浆测定血糖值、丙酮酸值、乳酸值等，判定糖尿病等病态的血液检查方法不能准确判定病态的正常血糖值状态、正常丙酮酸值或低丙酮酸值状态、正常乳酸值或低乳酸值状态患者的真实病态，从而能作出更准确的早期诊断和早期治疗。
关于本发明的血液检查方法的详细内容，以下更详细地进行说明。


图1是表示利用本发明的血液检查方法，求出红细胞内氧化还原电位时制作的标准曲线的图。
具体实施例方式
本发明的血液检查方法，由以下(a)～(h)步骤构成。
(a)步骤中，将静脉血样离心，分离成血浆成分和血细胞成分。例如，使用装入规定量肝素或EDTA作为防止红细胞凝固的血液凝固防止剂的采血管，从被检者采集静脉血。将得到的静脉血样(例如2ml)，优选以130～200×g离心5～10分钟，特别优选以150×g离心5分钟，从而分离成血浆成分和血细胞成分。血细胞成分是血液中的细胞成分，包括红细胞、白细胞、血小板等。
(b)步骤中，从该血细胞成分除去棕黄层，得到红细胞。这时，作为易于使红细胞和其以外的血细胞成分，即白细胞、血小板等棕黄层分离的分离促进剂，例如，优选向该血细胞成分中加入0.2ml浓度约25％的甲泛葡胺，将得到的混合物，优选以800～1200×g离心7～12分钟，特别优选以1000×g离心10分钟，分离成白细胞、血小板等的棕黄层和红细胞。这样，如果从血细胞成分中确实除去白细胞、血小板等棕黄层，则可有效地分离出红细胞，在以后的步骤中，容易以高精度取出红细胞中的成分，可准确地测定出红细胞内的葡萄糖、乳酸浓度。
(c)步骤中，用缓冲生理食盐水洗涤该红细胞。优选向除去棕黄层的红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水(PBS)，优选以130～200×g离心5～10分钟，特别优选以1 50×g离心5分钟，进行洗涤。这样，进一步确实除去附着在红细胞表面上的血浆成分和白细胞、血小板等杂质。
(d)步骤中，向该洗净的红细胞中加入缓冲生理食盐水，得到红细胞悬浮液。优选再次向该洗净的红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水(PBS)，使用自动血细胞计算器，利用公知的方法，制作规定量，如2ml的血细胞比容值优选为40～50％，特别优选为50％的红细胞悬浮液。或者，也可以用自动血细胞计算器，制作红细胞数为400万/μl～500万/μl，例如400万/μl的红细胞悬浮液。使得到的红细胞悬浮液形成难以破坏红细胞，而且易于取出细胞内成分的稳定状态。
(e)步骤中，将该红细胞悬浮液离心，除去上清液，得到红细胞层。将该红细胞悬浮液优选以130～200×g离心5～10分钟，特别优选以150×g离心5分钟，除去其磷酸缓冲生理食盐水(PBS)的上清液，得到红细胞层。
(f)步骤中，向该红细胞层中加入高渗压液，为得到含有由于渗透压而渗出的红细胞细胞内成分的悬浮液，将得到的混合物在25～40℃下保持充分时间。为了易于取出红细胞细胞内的成分，作为高渗压液，优选向该红细胞层中加入浓度为5～10重量％，优选浓度为5重量％的食盐水(NaCl)，使总量为2ml，将该混合物优选在35～38℃下，特别优选在37℃下，优选保持7～15分钟，特别优选保持10分钟。结果，通过红细胞细胞内和食盐水之间作用的渗透压，使含有葡萄糖和乳酸成分的内液成分与水分一起，从红细胞中完全渗出到该食盐水中。温度低于25℃时，所要求的成分会从红细胞中取出不完全，温度超过40℃时，存在细胞内成分变性等危险。
(g)步骤中，将(f)步骤中得到的悬浮液离心，收集含有上述红细胞细胞内成分的上清液。优选将该红细胞悬浮液以1500～2000×g离心7～12分钟，特别优选以1750×g离心10分钟，收集上述红细胞细胞内成分渗出的上清液成分。
(h)步骤中，测定该上清液，确定选自葡萄糖浓度、丙酮酸浓度、乳酸浓度(L-乳酸浓度(mg/dl))和氧化还原电位中的至少一个参量。
可利用生化自动分析装置，以公知的适宜方法，测定该上清液中葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)、丙酮酸浓度、乳酸浓度(L-乳酸浓度)。在(d)步骤中，制作2ml血细胞比容值为50％的红细胞悬浮液时，上述静脉血样的红细胞中葡萄糖浓度、丙酮酸浓度、乳酸浓度(mg/dl)是各测定值乘以2的值。另一方面，在(d)步骤中，利用自动血细胞计算器，制作红细胞数为规定值的规定量红细胞悬浮液时，上述静脉血样的红细胞中葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度(mg/dl))、丙酮酸浓度(mg/dl)、乳酸浓度(L-乳酸浓度(mg/dl)能够容易地由各测定值、用自动血细胞计算器同时计测的平均红细胞容积、红细胞数以及红细胞悬浮液量计算出。
另外，利用氧化还原电位计(ORP计)以适宜的公知方法，可以测定该上清液的氧化还原电位(Rc-ORP)。在上述实验过程中，使用5％食盐水制作血细胞比容值为50％的红细胞悬浮液时的标准曲线如下制成。即，认为在细胞外液即血清的氧化还原电位的正或负方向的延长线上，存在细胞内液的氧化还原电位，因而如表1所示，使用从同一个被检者采集的血清，制作图1所示的标准曲线，根据使用上述氧化还原电位计实测的氧化还原电位(ORP)，求出最终红细胞细胞内的氧化还原电位(Rc-ORP)。
表1

首先，使用装入规定量血液凝固促进剂和血清分离剂的采血管，将规定量从被检者采集的静脉血，例如4ml，以例如3000rpm离心约10分钟，可以得到血清。接着分别求出血清的氧化还原电位和用5％食盐水稀释为2倍的该血清的氧化还原电位，将由此确定的点作为图示中A点。接着，由将原血清用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)稀释为2倍的血清的氧化还原电位，和将该用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)稀释为2倍的血清再用5％食盐水稀释为2倍的血清的氧化还原电位得到的点作为图示B点。同样，C点为由将原血清用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)稀释为4倍的血清的氧化还原电位，和将用磷酸缓冲生理食盐水(PBS)稀释为4倍的血清再用5％食盐水稀释为2倍的血清的氧化还原电位求出的点。将A、B、C各点连接，向正或负方向引出延长线，将其作为标准曲线。然后，在先前的标准曲线的Y轴(将血清用5％食盐水稀释求出的氧化还原电位的坐标轴)上套用细胞内液和上述5％食盐水的混合液的氧化还原电位的实测值，读取由X轴的坐标推测的细胞内液的氧化还原电位。
另外，在上述(h)步骤中，使用上述氧化还原电位计(ORP计)求出氧化还原电位(ORP)时，对测定值加上比较电极的电位。该比较电极的电位，根据此时上清液成分的温度进行确定，例如，该温度在0-60℃之间，如表2所示。
表2 通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1通过以下(a)～(i)步骤，对胰岛素非依赖性糖尿病患者(MIDDM患者)37名和健康正常人52名，测定任意时刻的红细胞细胞内葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)。
步骤(a)将2ml静脉血样以150×g离心5分钟，分离成血浆成分和血细胞成分。
步骤(b)向该血细胞成分中加入0.2ml浓度为25％的甲泛葡胺后，以1000×g离心10分钟，分离成白细胞、血小板等棕黄层和红细胞。
步骤(c)向该红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水(PBS)后，以150×g离心5分钟，进行洗涤。
步骤(d)向该洗净的红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水(PBS)，用自动血细胞计算器，制作2ml血细胞比容值为50％的红细胞悬浮液。
步骤(e)将该红细胞悬浮液以150×g离心5分钟，除去该磷酸缓冲生理食盐水(PBS)的上清液，得到红细胞层。
步骤(f)向该红细胞层中加入5重量％的食盐水(NaCl)，使总量为2ml，将该混合物在37℃下保持10分钟，得到悬浮液。
步骤(g)将悬浮液以1750×g离心10分钟，得到红细胞细胞内的成分渗出的上清液成分。
步骤(h)测定该上清液，确定葡萄糖浓度。
另外，采用和以前一样的方法，分别测定血液的血浆中的血糖值。
结果，胰岛素非依赖性糖尿病患者的场合，血浆中的血糖值很高时，红细胞细胞内的葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)也很高，血糖值为350mg/dl，红细胞细胞内葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)也达到50mg/dl，即，确认两者间存在正的相关性。
另一方面，正常健康成人的场合，血糖值达到150mg/dl时，红细胞细胞内葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)最大为10mg/dl，确认依然存在正的相关性。
从这些胰岛素非依赖性患者和正常健康成人的全部数据可以看出，在血浆中的血糖值和红细胞细胞内葡萄糖浓度(D-葡萄糖浓度)之间存在着明显的正的相关性。
实施例2以和实施例1相同的方法，对进行性血管营养障碍患者(4岁，男性)进行血液检查。结果示于表3。测定1和2分别是进行负离子照射治疗前和后的测定结果。
表3

在该病例中，测定1时，细胞内ORP极高(248mV)，认为细胞内的氧化显著。为此，由于细胞膜的氧化，Na+/H+通道的驱动力降低，细胞内的pH也降低(7.13)。通常，尽管细胞内乳酸比血中乳酸稍高，但细胞内乳酸为10.6，比血中乳酸的16.8颇低。红细胞中没有TCA回路，仅有解糖体系，因此，糖分解变成丙酮酸后，变化成乳酸结束。细胞内乳酸比血中乳酸低这一事实，意味着细胞内的代谢降低了。即，细胞内pH降低，ORP升高，所以细胞内的酸性、氧化亢进，代谢降低。这时，表示肌肉炎症的CPK、肌红蛋白、LDH、醛缩酶达到了显著高的值，患者的病态极差。另一方面，测定2时，细胞内ORP低到221，细胞内pH也接近于正常(7.24)，细胞内没有显著的酸性、氧化，认为新陈代谢良好。实际上，细胞内乳酸和丙酮酸分别为18.4和1.2，呈现出比血中的这些值稍高的趋势。不管怎么说，这些实测值比正常值高，细胞呈现酸性，所以需要改善。因此，研究细胞内外的有机酸浓度，或者测定pH和ORP，可及早把握疾病的发生或病况。结果，对于测定2，CPK、肌红蛋白、LDH、醛缩酶的值都比测定1有了显著改善。实际上，该患者由于肌肉萎缩造成站立和行走障碍，但在测定2的阶段，症状得到大幅度改善。
实施例3
以和实施例2相同的方法，对糖尿病患者(70岁，男性)进行血液检查。结果示于表4。测定1和2分别是进行负离子照射治疗前和后的测定结果。
表4

在测定1中，细胞内乳酸为17.5，比血中的15.9稍高，由于其实测值稍微超过正常值，乍一看细胞的新陈代谢并不那么差。而且，细胞内ORP也为229，认为没有氧化亢进。然而，细胞内pH为7.11，显著降低，所以认为细胞内的糖代谢处于停止状态。另一方面，在测定2中，由于细胞内乳酸很高(23.8)，ORP也高达250，所以预测因细胞氧化，新陈代谢恶化。然而，由于细胞内pH最适宜，所以认为在该阶段进行糖代谢。实际上，血糖为309，与测定1的380相比，得到了很好的改善。
根据细胞内外的有机酸、pH、和ORP，可以予测发病的可能性和病况的好坏。根据目前收集的数据结果，认为发病或病况恶化时的经过顺序为①与细胞内外有机酸的实测值的平衡恶化②与细胞内外ORP的实测值的平衡恶化③与细胞内外pH实测值的平衡恶化参考值如下。
细胞内ORP 235mV以下细胞内乳酸8～16mg/dl细胞内丙酮酸 0.5～1.2mg/dl
细胞内pH 7.24～7.30血液ORP 130mV以下血中乳酸 6～14mg/dl血中丙酮酸0.3～0.9mg/dl血液pH7.36～7.4权利要求
1.一种血液检查方法，其特征是包括以下步骤，即，(a)将哺乳动物血样离心，分离成血浆成分和血细胞成分的步骤，(b)从该血细胞成分除去棕黄层，得到红细胞的步骤，(c)用缓冲生理食盐水洗涤该红细胞的步骤，(d)向该洗净过的红细胞中加入缓冲生理食盐水，得到红细胞悬浮液的步骤，(e)将该红细胞悬浮液离心，除去上清液成分，得到红细胞层的步骤，(f)向该红细胞层中加入高渗压液，为得到含有利用浸透压渗出的红细胞细胞内成分的悬浮液，将得到的混合物在25～40℃下保持充分时间的步骤，(g)将该悬浮液离心，收集含有上述红细胞细胞内成分的上清液的步骤，(h)测定该上清液，确定选自葡萄糖浓度、丙酮酸浓度、乳酸浓度和氧化还原电位中至少1个因素的步骤。
2.根据权利要求1记载的血液检查方法，其特征是，在(a)步骤中，以130～200×g的离心力，将该血样离心5～10分钟。
3.根据权利要求1或2记载的血液检查方法，其特征是，在(b)步骤中，向该血细胞成分中加入沉淀剂，将得到的混合物以800～1200×g离心7～12分钟。
4.根据权利要求1～3中任一项记载的血液检查方法，其特征是，在(c)步骤中，向该红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水，将得到的混合物以130～200×g离心5～10分钟，进行洗涤。
5.根据权利要求1～4中任一项记载的血液检查方法，其特征是，在(d)步骤中，向该洗净的红细胞中加入磷酸缓冲生理食盐水，将得到的混合物用自动血细胞计算器，制作成规定量的血细胞比容值为40～50％的红细胞悬浮液。
6.根据权利要求1～5中任一项记载的血液检查方法，其特征是，在(e)步骤中，将该红细胞悬浮液以130～200×g离心5～10分钟，除去上清液成分，得到红细胞层。
7.根据权利要求1～6中任一项记载的血液检查方法，其特征是，在(f)步骤中，向该红细胞层中加入5～10重量％的食盐水，使总量为规定量，将该混合物在35～38℃下保持7～15分钟。
8.根据权利要求1～7中任一项记载的血液检查方法，其特征是，在(g)步骤中，将该红细胞悬浮液以1500～2000×g离心7～12分钟，收集上述红细胞细胞内成分渗出的上清液成分。
9.根据权利要求1～8中任一项记载的血液检查方法，其特征是，利用生化自动分析装置，测定该上清液中的葡萄糖浓度、丙酮酸浓度、乳酸浓度。
10.根据权利要求1～8中任一项记载的血液检查方法，其特征是，利用氧化还原电位计测定该上清液中的氧化还原电位。
全文摘要
本发明涉及能早期把握病态，操作简便的血液检查方法，可简便地测定血液红细胞细胞内的葡萄糖浓度、乳酸浓度、丙酮酸浓度，以及氧化还原电位等，分别利用这些参量或将这些参量综合，适当地把握病态，从而对一般血液生化检查有效的各种病态，能从早期轻症阶段准确而确实地把握病态。
文档编号G01N1/28GK1605869SQ20031011839
公开日2005年4月13日 申请日期2003年10月9日 优先权日2003年10月9日
发明者堀口升, 堀口裕 申请人:堀口升