专利名称：一种基于荧光dUTP的自动检测SSR分子标记的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种基于荧光dUTP在测序仪上自动检测 SSR分子标记的方法。
背景技术：
SSR(Simple sequence r印eats，简单序列重复，也称微卫星)是一类由几个碱基 串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短(每单元长度在1 6bp之间)，广泛分布于基 因组的不同位置。不同遗传材料重复次数的可变性，导致了 SSR标记产生的基础。SSR标记 是当今流行的分子标记技术之一，其原理为根据SSR两端的保守的单拷贝序列设计一对 特异引物，通过PCR技术将其间的核心SSR序列扩增出来，利用电泳分析技术就可以获得其 长度多态性。为了满足高通量和准确性的需要，目前有条件的实验室都是通过测序仪进行 自动化的电泳检测。通过测序仪进行SSR分子标记自动检测的一大障碍是PCR产物必须具 有荧光，以便激光探头自动识别荧光信号。利用荧光dUTP进行SSR分子标记实验在教科书中尚未提及，至今只见报道 有 4 篇文献(文献 1 :Patrick K. Ε. M 等，“ Analysis of loss of heterozygosity inmicrodissected tumor cells from Cervical carcinoma using fluorescent dUTP IabelingofPCR products", BioTechniques 21:844—847;文 ^ 2 :MacAvoy E. S.等, "Geneticvariation island populations of tuatara inferred from microsatellite markers”，Conservatioin Genetics 8 :305_318 ；文献 3 :Woolbright S. A.等，“A dense linkagemap of hybrid cottonwood contributes to long-term ecological research andcomparison mapping in a model forest tree”， Heredity 100 :59_70 ；文献 4 : BuschJ. D.等，"Development of polymorphic tetranucleotide microsatellites for Pinyonjays”，Conservation Genetics 10 :689_691)。但上述文献中荧光信号偏弱，大大影 响了谱带判读的准确性。其中除文献2中涉及的dNTP浓度为10(^1(降落？0 ，PCR反应 体系为25 μ L)之外，文献1、3和4中报道的dNTP浓度均为200 μ M( —般PCR，PCR反应体 系为15 50 μ L)。由此可见，行业内技术人员利用荧光dUTP进行SSR分子标记时几乎均 釆用浓度为100 200 μ M的dNTP。此外，分子生物学领域技术人员在进行一般PCR反应时使用的dNTP浓度为 200 μ Μ，可参考C. W.迪芬巴赫等人著的《PCR技术实验指南》(科学出版社，1998，第1页)寸。

发明内容
为解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种新的既能提高目的片段的荧光 信号，从而提高标记判读的准确性，又能合理节约反应原料，降低成本、提高实验通量的方 法。本发明提供了一种基于荧光dUTP的自动检测SSR分子标记的方法，包括以下步骤(1)配制 PCR 反应体系取 l.OyL 10Xbuffer、dNTP 25 50 μ M、MgCl22. OmM、前 向引物0.5“] 、后向引物0.5“]\^39酶1个单位、荧光(1^13 IOpmol和基因组DNA 5ng混 合，加超纯水补至IOyL ；(2)进行降落PCR :94°C4min ；20 个循环94°C 30s、70 60°C或者 66°C 56°C 30s 且每个循环降低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 个循环94°C 30s、60 或者 56°C 30s,72°C Imin ；最 后 72 °C lOmin，得 PCR 产物；(3)取PCR产物1. O μ L加入9. 34 μ L超纯甲酰胺、0. 16 μ L分子量内标，95°C 5min 后放置冰上快速冷却，在测序仪上进行标记检测。步骤(1)中，dNTP为三磷酸脱氧核糖核苷(deoxy-ribonucleoside triphosphate)的缩写。是dATP、dGTP、dTTP和dCTP的统称，在生物DNA合成以及PCR聚 合酶链反应中起原料作用。步骤(1)中使用的dNTP浓度为25 50μΜ，其浓度之低显而易见，只占行业内技 术人员通常使用量(200 μ Μ)的12. 5% 25%，大幅降低了反应原料成本；并且可显著提高 荧光信号的强度。基因组DNA不限。前向引物和后向引物取决于SSR标记对应的DNA片段，按常规 分子学方法制备。步骤(2)中，降落PCR (touchdown PCR)是指随着循环的增多，退火温度每个循环 依次降低的一种PCR技术，基本原理就是在退火温度较高的时候能够保证引物结合反应的 特异性，而随着退火温度的降低，扩增效率可以适当增加。其程序中退火温度的选择(70 60°C或者66°C 56°C，以及60或者56°C )取决于DNA序列的Tm值(DNA的解链温度)。步骤(3)利用测序仪是为了进行自动化的电泳检测，具体步骤参考仪器使用指 南。优选地，步骤(1)中使用的dNTP浓度为25 μ M，做到在保障PCR产物量足够，提高 荧光信号强度的情况下，使用最低的dNTP浓度，将原料成本降至最低。本发明显著提高了目的片段的荧光信号强度，大大增强了在测序仪上自动检测的 准确性，也有利于1个样品的多个SSR标记混合后多重检测、降低测序仪检测的实验成本。 其可能的原理是PCR反应中，荧光dUTP会与dNTP中的dTTP竞争结合到DNA链(PCR产物) 上，dNTP浓度降低、相当于降低dTTP的量，从而减弱了 dTTP的竞争力、提高了荧光dUTP结 合到PCR产物的能力，因此荧光信号强度增加。但另一方面，dNTP是DNA链合成的原料，不 能降得太低，否则其他三种dNTP (dATP、dCTP和dGTP)浓度太低、DNA链合成的原料不够，导 致总的PCR产物偏少，进而荧光信号也会偏弱，不利于荧光检测。因此，本发明提供了在保 障PCR产物量足够的情况下使用的dNTP最低浓度，能够保证最大的荧光信号强度。综上，本发明满足了社会需要，其广泛的推广将会带来巨大的社会效益和经济效益。


图1为不同dNTP浓度和PCR程序对桉树(Eucalyptus) SSR标记Embral89的PCR 产物的荧光信号强度的影响。
图2为不同dNTP浓度和PCR程序对桉树SSR标记Embral47的PCR产物的荧光信 号强度的影响。图3为利用本发明对药用植物-五味子(Schisandra chinesis) SSR标记 WWZ-AC25的检测结果。图4为利用本发明对经济林树种_锥栗(Castanea henryi)的SSR标记GsCAT3 的检测结果。
具体实施例方式以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。实施例一一种基于荧光dUTP的检测桉树SSR标记Embral89的方法，包括以下步骤(1)配制 PCR 反应体系取 LOyL 10 X buffer、dNTP 25 μ Μ、MgCl22. OmM、前向引 物(5，-CGTGCTTTTGAGGCTCT-3，)0· 5 μ Μ、后向引物(5，-GATTGAGGATGAGTGGTC-3，)0· 5 μ Μ、 Taq酶1个单位(上海申能博彩公司)、荧光dUTP IOpmol (加拿大Fermentas公司)和1 株尾叶桉(E. urophylla)个体的基因组DNA 5ng混合，加超纯水补至10 μ L ；(2)进行降落PCR :94°C 4min ；20个循环94°C 30s,70 60°C 30s且每个循环降 低 0. 5°C、72°C Imin ；再 26 个循环94°C 30s、60°C 30s、72°C Imin ；最后 72°C lOmin，得 PCR 产物；(3)取PCR产物1. 0μ L加入9. 34 μ L超纯甲酰胺、0. 16 μ L分子量内标GeneScan 500LIZ (美国AB公司)，95°C 5min后放置冰上快速冷却，在测序仪(美国AB 3130x1)上进 行标记检测，检测结果如附图1的H所标识。附图1中，I峰为分子量内标，II (a)和II (b) 峰为目的片段，峰的高低代表了荧光信号的强弱。桉树为2倍体，II (a)和II (b)峰表示该 个体在该SSR标记上的2个等位基因的长度不同，分别为IlObp和118bp。实施例二一种基于荧光dUTP的检测桉树SSR标记Embral47的方法。具体步骤基 本同上“实施例一”，只是前向引物(5’ -GCACGGTACTCGATCATAGA-3’)和后向引物 (5，-TGAGATAGGATTGCGCGT-3，)不同，且降落 PCR 中 70 60°C改为 66 56"C、26 个循环 中60。C改为56°C。检测结果如附图2的H所标识。I峰为分子量内标，II (a)和II (b)为 目的片段，峰的高低代表了荧光信号的强弱。桉树为2倍体，II (a)和II (b)峰表示该个体 在该SSR标记上的2个等位基因的长度不同，分另为178bp和184bp。实施例三一种基于荧光dUTP的检测药用植物-五味子SSR标记WWZ-AC25的方法。具体 步骤基本同上“实施例一”，只是前向引物(5 ’ -CATCGGAAAAATCAGAGAAG-3 ’)和后向引物 (5，-CCTATCAAAACTCCCCTCTT-3，)不同，降落 PCR 中 70 60°C改为 66 56"C、26 个循环 中60°C改为56°C，且尾叶桉改为五味子。检测结果如附图3。I (a)和I (b)峰为分子量 内标，II峰为目的片段。五味子为2倍体，II峰表示该个体在该SSR标记上的2个等位基因 的长度相同，为20Ibp。
实施例四一种基于荧光dUTP的检测经济林树种-锥栗的SSR标记GsCAT3的方法。具体步 骤基本同上“实施例一”，只是前向引物和后向引物不同(因引物尚未发表，暂略)，降落PCR 中70 60°C改为66 56°C、26个循环中60°C改为56°C，且尾叶桉改为锥栗。检测结果如 附图4。I (a)和I (b)峰为分子量内标，II (a)和II (b)峰为目的片段。锥栗为2倍体， II (a)和II (b)峰表示该个体在该SSR标记上的2个等位基因的长度不同，分别为164bp 和 166bp。效果实施例不同dNTP浓度和PCR程序对桉树SSR标记(Embral89和Embral47) PCR产物的荧 光信号强度的影响实验材料植物材料为1株尾叶桉，采嫩叶进行DNA提取。SSR标记选取Embral89 和Embral47，引物序列见上“实施例一”和“实施例二”。实验过程针对各SSR标记，实验过程见上“实施例一”和“实施例二”。试验结果及分析结果如附图1和附图2所示，dNTP 25 50mM和降落PCR程序 下，检测的信号峰值明显高于其他条件，具有良好的检测效果，其中尤以dNTP 25mM和降落 PCR程序下，具有最佳的检测效果。
权利要求
一种基于荧光dUTP的自动检测SSR分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制PCR反应体系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1个单位、荧光dUTP 10pmol和基因组DNA 5ng混合，加超纯水补至10μL；(2)进行降落PCR94℃4min；20个循环94℃30s、70～60℃或者66℃～56℃30s且每个循环降低0.5℃、72℃1min；再26个循环94℃30s、60℃或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR产物；(3)取所述PCR产物1.0μL加入9.34μL超纯甲酰胺、0.16μL分子量内标，95℃5min后放置冰上快速冷却，在测序仪上进行标记检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dNTP为25μ M。
全文摘要
本发明提供了一种基于荧光dUTP的自动检测SSR分子标记的方法，包括以下步骤(1)配制PCR反应体系取1.0μL 10×buffer、dNTP 25～50μM、MgCl22.0mM、前向引物0.5μM、后向引物0.5μM、Taq酶1个单位、荧光dUTP10pmol和基因组DNA 5ng混合，加超纯水补至10μL；(2)进行降落PCR94℃4min；20个循环94℃30s、70～60℃或者66～56℃30s且每个循环降低0.5℃、72℃1min；再26个循环94℃30s、60或者56℃30s、72℃1min；最后72℃10min，得PCR产物；(3)取PCR产物1.0μL加入9.34μL超纯甲酰胺、0.16μL分子量内标，95℃5min后放置冰上快速冷却，在测序仪上进行标记检测。
文档编号G01N21/64GK101899520SQ201010239919
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者于晓丽, 周长品, 李发根, 李梅, 甘四明, 翁启杰 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所