专利名称：一种非标记型电流型免疫传感器及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以铁氰化钾作为氧化还原探针物质，以壳聚糖作为固定基质的电流型免疫传感器，属于电化学传感器领域。
背景技术：
电化学免疫传感器与传统的放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析相比，具有相对较为简单的预处理过程、较短的分析时间、低检出限以及对仪器要求较低等优点，因而受到了广泛的关注(临床检验杂志，2003，03，181.中国医学物理学杂志，2006，2， 132.)。人们开发出了多种类型的电化学免疫传感器，如电流型、电压型、电容型以及阻抗型的传感器(Anal. Chem. 2001，73，3219. Electrochem. Commun. 2004，6，1222. Sens. Actuators B 1999，57，201. Anal. Chem. 2002, 74，4814.)，这些传感器都是通过抗体抗原反应后导致传感器的电化学信号发生改变来实现免疫检测的。利用纳米材料增强检测灵敏度的电流型免疫传感器，主要分为标记型和非标记型两种。标记型电流型免疫传感器是将抗体或者抗原分子固定在电极表面上，当传感器在含有待测抗原和酶标抗体的溶液中孵育后，通过测定标记在抗体上的酶与底物作用产生的电化学活性物质的电化学信号，间接测定待测抗原含量。辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等经常被用作抗体的标记酶(即酶标抗体)。现有的标记型电流型免疫传感器需要在待测溶液中加入具有氧化还原能力的电活性物质作为媒介体或者上述酶标抗体的酶促底物等非免疫试剂，这些试剂将影响测定结果的稳定性。非标记型电流型免疫传感器是通过在电极表面先形成一层具有电化学活性的氧化还原探针物质膜，然后在氧化还原探针物质膜的表面连接抗体分子，接着对待测抗原进行免疫识别并进行电化学免疫检测。非标记型的电化学免疫传感器不需要具有氧化还原能力的电活性物质作为媒介体，也不需要标记型电流型免疫传感器中的酶标抗体的酶促底物的介入，因此非标记型的电化学免疫传感器具有简单和快速等优点，同时也避免了标记型电流型免疫传感器存在的媒介体对电极表面污染的问题。尽管如此，非标记型电流型免疫传感器主要通过静电作用连接抗体，难以确保每次抗体固定量一致，因而影响传感器的重现性。为了克服现有的非标记型电流型免疫传感器存在的缺点，本发明首次利用壳聚糖将氧化还原探针物质直接固定到电极表面，在电极上形成氧化还原探针物质膜，并将抗体通过化学修饰固定到氧化还原探针物质膜上，制备出新型非标记型电流型免疫传感器。

发明内容
本发明的目的在于提供一种非标记型电流型免疫传感器，从而解决现有技术免疫传感器重现性差的缺陷。本发明是通过以下技术方案来实现的一种非标记型电流型免疫传感器，其特征在于，工作电极表面覆盖有4层膜第一层为壳聚糖、铁氰化钾和金属纳米材料的混合物在电极表面形成的氧化还原层；第二层为全氟化质子交换树脂与金属纳米材料的混合物在所述氧化还原层表面形成的保护层；第三层为在所述保护层表面形成的聚乙烯亚胺层；第四层为将所述第三层用戊二醛处理后再化学吸附抗体的聚乙烯亚胺层。所述抗体可以是本领域常用的免疫抗体，如免疫球蛋白及其家族、癌胚抗体以及其他癌症标志物抗体等。其中，所述第一层中，所述金属纳米材料为金纳米颗粒或银纳米颗粒。所述金属纳米材料的粒径为10-60nm。所述全氟化质子交换树脂为全氟磺酸交换树脂(naf ion)。将所述工作电极与对电极和参比电极组成免疫传感器来检测抗原。所述抗原可以是本领域常用的免疫抗原，如免疫球蛋白及其家族、癌胚抗原以及其他癌症标志物抗原等。在本发明的实施例中，对电极为大面积钼片电极。参比电极为饱和氯化钾Ag/AgCl电极或饱和甘汞电极。本发明的另一目的在于提供一种制备所述非标记型电流型免疫传感器的方法，其中，所述工作电极的制备包括以下步骤1)将壳聚糖水溶液与铁氰化钾水溶液混合，并加入金属纳米材料水溶液，将所得混合物涂刷到工作电极表面，并在常温晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；2)将全氟磺酸交换树脂的乙醇溶液与金属纳米材料的乙醇溶液混合，将所得混合物涂刷到经步骤1)处理后的工作电极上，并在常温晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；3)将经步骤2、处理后的工作电极浸入聚乙烯亚胺水溶液中，取出后水洗并用氮气吹干，形成聚乙烯亚胺层；4)将经步骤幻处理后的工作电极浸入戊二醛水溶液中，形成富醛基表面；5)将经步骤4)处理后的工作电极浸入抗体水溶液中，取出后用牛血清白蛋白水溶液封闭。其中，步骤1)中，所述壳聚糖水溶液的浓度为0.5-2wt%，铁氰化钾水溶液的浓度为 Ι-lOmM，金属纳米材料水溶液在最大可见吸收峰波长下的吸光度为1-5 ；壳聚糖水溶液 铁氰化钾水溶液金属纳米材料水溶液的体积比为0. 05-0. 2 0. 01-0. 1 0. 02-0. 1 ；步骤幻中，所述全氟化质子交换树脂的乙醇溶液的浓度为l-5wt%，金属纳米材料的乙醇溶液在最大可见吸收峰波长下的吸光度为1-5，全氟化质子交换树脂的乙醇溶液金属纳米材料的乙醇溶液的体积比为0. 05-0. 2 0. 02-0. 1 ；步骤3)中，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为10-50mg/mL ；工作电极浸入聚乙烯亚胺水溶液的时间为5-30min ；步骤4)中，戊二醛水溶液的浓度为1. 0-5. Omg/mL ；工作电极浸入戊二醛水溶液的时间为5-30min ；步骤幻中，所述抗体水溶液的浓度为100-300ug/mL ；工作电极浸入所述抗体水溶液的时间为2-4小时；所述牛血清白蛋白水溶液的浓度为5-20mg/mL ；工作电极浸入所述牛血清白蛋白水溶液的时间为20-40min。本发明的又一目的在于提供一种所述非标记型电流型免疫传感器的使用方法，具体为1)测定抗原的工作曲线。配置浓度范围在0 lOOOng/mL的抗原标准水溶液，所用抗原需与工作电极中所吸附的抗体相对应。在30 40°C下，将本发明的工作电极在抗原标准水溶液中孵育30 70min后，取出，使用二次蒸馏水洗涤，以孵育后的工作电极作为传感器的工作电极、以大面积钼片电极作为对电极，以饱和甘汞电极或者饱和氯化钾Ag/AgCl电极作为参比电极，在 pH为6. 5 7. 3的磷酸缓冲溶液或者Tris-HCl缓冲溶液中采用循环伏安法、方波伏安法、 差示脉冲伏安法进行检测，得到该待测抗原的测定工作曲线；2)测定待测抗原。将免疫传感器在30 40°C下，在含待测抗原的水溶液中孵育30 70min，取出， 使用二次蒸馏水洗涤，以孵育后的非标记型电流型免疫传感器作为工作电极、以大面积钼片电极作为对电极，以饱和甘汞电极或者饱和氯化钾Ag/AgCl电极作为参比电极，在pH为 6. 5 7. 3的磷酸缓冲溶液或者Tris-HCl缓冲溶液中采用循环伏安法、方波伏安法或差示脉冲伏安法进行检测，将检测结果与该抗原的测定工作曲线对照，查出其相应的浓度。本发明的免疫传感器具有制备过程简便、成本低廉、重现性优良、检测灵敏度高等优点，可广泛用于各种免疫分析和检测。


图1为癌胚抗原(CEA)测定标准曲线；图2为人IgG的测定标准曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1一、制备用于CEA检测的非标记型电流型免疫传感器选择盘状平面玻碳电极，以CEA为检测抗原，以CEA抗体为固定抗体1)将0. ImL的1 %的壳聚糖水溶液与0. 05mL的5mM的铁氰化钾水溶液混合，并加入0. 05mL的粒径为25nm且在最大可见吸收峰波长下吸光度为5的金纳米颗粒水溶液，混合均勻后涂刷到电极表面，在烘箱中以50°C烘干；2)将0. ImL的1. 25% nafion的乙醇溶液与0. 05mL的粒径为25nm且在最大可见吸收峰波长下吸光度为5的金纳米颗粒的乙醇溶液混合，将所得混合物涂刷到步骤1)处理后的电极表面，在烘箱中以50°C烘干；3)将步骤2)中所得修饰电极浸入聚乙烯亚胺水溶液(50mg/mL)中15min，取出后水洗并用氮气吹干，形成聚乙烯亚胺层；4)将步骤幻中所得修饰电极浸入2. 5mg/mL戊二醛水溶液15min，形成富醛基的表面；
5)将步骤4)中所得修饰电极浸入200 μ g/mL的CEA抗体水溶液中孵育3小时，取出后放入lOmg/mL的牛血清白蛋白水溶液中30min，得到可检测CEA的非标记型电流型免疫传感器。二、CEA 的检测1)测定CEA的工作曲线配置浓度范围在O lOOOng/mL的CEA标准水溶液，在30°C下，将制备的CEA抗体修饰的非标记型电流型免疫传感器分别在不同浓度的CEA标准水溶液中孵育30min后，取出，使用二次蒸馏水洗涤，以其作为工作电极，以大面积钼片电极作为对电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl电极作为参比电极，在pH为7.0的磷酸缓冲溶液中采用方波伏安法进行检测， 得到CEA的测定工作曲线，如图1所示。2)测定 CEA将CEA抗体修饰的非标记型电流型免疫传感器在35°C下，在含待测抗原的水溶液中孵育30min，取出，使用二次蒸馏水洗涤，以其作为工作电极，以大面积钼片电极作为对电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl电极作为参比电极，在pH为7. O的磷酸缓冲溶液中采用方波伏安法进行检测，将检测结果与步骤1)的CEA的测定工作曲线相对照，查出相应浓度。结果显示，对CEA的检测限为3pg/mL。实施例2一、制备用于人IgG检测的非标记型电流型免疫传感器选择盘状平面金电极，以人IgG为检测对象，以抗人IgG作为固定抗体1)将0. 2mL的2 %的壳聚糖水溶液与0. ImL的IOmM的铁氰化钾水溶液混合，并加入0. ImL的粒径为20nm在最大可见吸收峰波长下吸光度为1的银纳米颗粒的水溶液，混合均勻后将所得混合物涂刷到电极表面，在烘箱中以80°C烘干；2)将0. 2mL的1 % nafion水溶液与0. ImL的粒径为20nm且在最大可见吸收峰波长下吸光度为1的银纳米颗粒的乙醇溶液混合，并将所得混合物涂刷到步骤1)处理后的电极表面，在烘箱中以80°C烘干；3)将步骤2)中所得修饰电极浸入聚乙烯亚胺水溶液(浓度为20mg/mL)中30min， 取出后水洗并用氮气吹干，形成聚乙烯亚胺层；4)将步骤幻中所得修饰电极浸入5mg/mL戊二醛水溶液30min，形成富醛基的表5)将步骤4)中所得修饰电极浸入300 μ g/mL的人IgG抗体水溶液中孵育3小时， 取出后放入20mg/mL的牛血清白蛋白水溶液中30min，得到可以检测人IgG的非标记型电流型免疫传感器。二、人IgG的检测1)测定人IgG的工作曲线配置浓度范围在0 lOOOng/mL的人IgG标准水溶液，在40°C下，将制备的可以检测人IgG的非标记型电流型免疫传感器，分别在不同浓度的人IgG标准水溶液中孵育35min 后，取出，使用二次蒸馏水洗涤，以其作为工作电极，以大面积钼片电极作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，在PH为7.0的磷酸缓冲溶液中采用循环伏安法进行检测，得到人 IgG的测定工作曲线，如图2所示；
2)测定人 IgG在35°C下，将可以检测人IgG的非标记型电流型免疫传感器在含待测抗原的水溶液中孵育30min，取出，使用二次蒸馏水洗涤，以其作为工作电极，以大面积钼片电极作为对电极，以饱和甘汞电极作为参比电极，在PH为7. 0的磷酸缓冲溶液中采用循环伏安法进行检测，将检测结果与步骤1)的人IgG的测定工作曲线相对照，查出相应浓度。结果显示，对人IgG的检测限为10pg/mL。本发明利用壳聚糖将氧化还原探针物质直接固定到电极表面，在电极上形成氧化还原探针物质膜，并将抗体修饰于氧化还原探针物质膜上，得到了本发明的非标记型电流型免疫传感器，克服了现有的非标记型电流型免疫传感器制备过程繁琐耗时、重现性不够好、制备传感器成本较高等缺陷。本发明的优点主要表现在1)本发明非标记型免疫传感器中的氧化还原探针物质膜制备过程简单；2)固定抗体时采用化学键固定，使每次固定的抗体量趋于一致，解决了通常固定抗体中使用的物理吸附导致的重现性差等问题；3)本发明的非标记型电流型免疫传感器对相应抗原具有极高的检测灵敏度。本发明的非标记型电流型免疫传感器制备过程更为简便、成本更加低廉、重现性更加优良、检测更为灵敏，可广泛用于各种免疫分析和检测。以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变， 修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.一种非标记型电流型免疫传感器，其特征在于，工作电极表面覆盖有4层膜第一层为壳聚糖、铁氰化钾和金属纳米材料混合物在电极表面形成的氧化还原层；第二层为全氟化质子交换树脂与金属纳米材料混合物在所述氧化还原层表面形成的保护层；第三层为在所述保护层表面形成的聚乙烯亚胺层；第四层为将所述第三层用戊二醛处理后再化学吸附抗体的聚乙烯亚胺层。
2.根据权利要求1所述的非标记型电流型免疫传感器，其特征在于， 所述金属纳米材料为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的非标记型电流型免疫传感器，其特征在于，所述金属纳米材料的粒径为10-60nm。
4.根据权利要求1或2所述的非标记型电流型免疫传感器，其特征在于，所述全氟化质子交换树脂为全氟磺酸交换树脂。
5.一种制备以上权利要求所述非标记型电流型免疫传感器的方法，其特征在于，所述工作电极的制备包括以下步骤1)将壳聚糖水溶液与铁氰化钾水溶液混合，并加入金属纳米材料水溶液，将所得混合物涂刷到工作电极表面，并在常温晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；2)将全氟化质子交换树脂的乙醇溶液与金属纳米材料的乙醇溶液混合，将所得混合物涂刷到经步骤1)处理后的工作电极上，并在常温晾干或在烘箱中以50-80°C烘干；3)将经步骤2)处理后的工作电极浸入聚乙烯亚胺水溶液中，取出后水洗并用氮气吹干，形成聚乙烯亚胺层；4)将经步骤幻处理后的工作电极浸入戊二醛水溶液中，形成富醛基表面；5)将经步骤4)处理后的工作电极浸入抗体水溶液中，取出后用牛血清白蛋白水溶液封闭。
6.根据权利要求5所述的非标记型电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于， 步骤1)中，所述壳聚糖水溶液的浓度为0. 5-2wt %，铁氰化钾水溶液的浓度为1-lOmM，金属纳米材料水溶液在最大可见吸收峰波长下的吸光度为1-5 ；壳聚糖水溶液铁氰化钾水溶液金属纳米材料水溶液的体积比为0. 05-0. 2 0. 01-0. 1 0. 02-0. 1。
7.根据权利要求5所述的非标记型电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于， 步骤2)中，所述全氟化质子交换树脂的乙醇溶液的浓度为l-5wt%，金属纳米材料的乙醇溶液在最大可见吸收峰波长下的吸光度为1-5，全氟化质子交换树脂的乙醇溶液金属纳米材料的乙醇溶液的体积比为0. 05-0. 2 0. 02-0. 1。
8.根据权利要求5所述的非标记型电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于， 步骤幻中，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为10-50mg/mL;工作电极浸入聚乙烯亚胺水溶液的时间为5-30min ；步骤4)中，戊二醛水溶液的浓度为1. 0-5. Omg/mL ；工作电极浸入戊二醛水溶液的时间为 5_30min ；步骤幻中，所述抗体水溶液的浓度为100-300ug/mL ；工作电极浸入所述抗体水溶液的时间为2-4小时；所述牛血清白蛋白水溶液的浓度为5-20mg/mL ；工作电极浸入所述牛血清白蛋白水溶液的时间为20-40min。
9.一种权利要求1-4中任一项所述非标记型电流型免疫传感器的使用方法，其特征在于，工作电极的处理在30-40°C下，将工作电极在抗原标准水溶液中孵育30-70min后取出，并用二次蒸馏水洗涤；接着将处理后的工作电极在缓冲溶液中采用电化学方法检测抗原。
10.根据权利要求9所述的非标记型电流型免疫传感器的使用方法，其特征在于，所述缓冲溶液为pH为6. 5 7. 3的磷酸缓冲溶液或者Tris-HCl缓冲溶液；所述电化学方法为方波伏安法或循环伏安法。
全文摘要
本发明涉及一种非标记型电流型免疫传感器。本发明免疫传感器的工作电极表面覆盖有4层膜第一层为壳聚糖、铁氰化钾和金属纳米材料的混合物在电极表面形成的氧化还原层；第二层为全氟化质子交换树脂与金属纳米材料混合物在所述氧化还原层表面形成的保护层；第三层为在所述保护层表面形成的聚乙烯亚胺层；第四层为将所述第三层用戊二醛处理后再化学吸附抗体的聚乙烯亚胺层。本发明的免疫传感器以铁氰化钾作为氧化还原探针物质，以壳聚糖作为固定基质，有效提高了电流型免疫传感器的重现性。
文档编号G01N27/48GK102183562SQ20111004343
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月23日 优先权日2011年2月23日
发明者石文韬, 马占芳 申请人:首都师范大学