专利名称：使用激光粒度仪实测微囊藻密度及群体大小的方法
技术领域：
本发明涉及一种使用激光粒度仪实测微囊藻密度及群体大小的方法。通过这种方法的使用，能够通快速并同时测定微囊藻密度及群体粒径分布。与以往一些测定微囊藻密度及群体大小的方法不同的是，此方法能够同时测定微囊藻密度及群体大小，不需要破碎微囊藻群体，也不需要花费大量时间用显微镜测量微囊藻群体大小，此方法不仅能够迅速得出微囊藻密度及群体大小，而且可以获得微囊藻群体的粒径分布。本发明属于资源环境领域。
背景技术：
蓝藻水华一般以微囊藻的大量繁殖、富集较为普遍。湖泊中微囊藻细胞密度是水华研究、预测、防治的基础性数据。一般对微囊藻的生物量的研究多基于细胞密度的测定，如显微镜计数、分光光度法、叶绿素含量，都常用来评价微囊藻的生物量。在研究群体数目、群体大小、群体细胞数时显微镜观察会出现一定的局限性，虽然群体的数量通过计数易于 获取，但是每个群体构成的细胞数则由于群体细胞的立体结构和相互遮挡难以计数。在用显微镜观测微囊藻群体时，由于取样量(O. μ -0. ImL)较小，并且常要进行I倍 10倍稀释，视野中出现的群体数量和大小存在较大的偶然性，这会造成评价结果的代表性变差。同时，在进行群体评价时每个样品都要数到40(Γ600个藻单元，工作量也非常巨大。显微镜观测对于浮游植物分类以及单细胞藻类的生物量实测方面发挥重要作用，但在以群体形态出现的微囊藻的群体特征评价时存在操作性和准确性方面的问题。因此，寻求一种简易的、对野外及室内样品都适用的、既能评价微囊藻总细胞密度又能对群体大小以及群体粒径分布进行评价的方法是十分必要的。

发明内容
本发明的目的是建立一种能够通快速并同时测定微囊藻密度及群体大小和粒径分布的方法。通过采用本发明专利的测定方法，能够快速测定微囊藻密度及群体大小相关数据。本发明的技术方案，其特征是对实际湖泊中获得的微囊藻样品进行简单预处理，直接通过激光粒度仪测定，便可以计算获得微囊藻密度及群体大小和粒径分布的数据。在微囊藻漂浮较为明显的水面用65Mffl浮游动物网进行捞取，通过福尔马林固定后带回实验室保存。野外采取的样品因为悬浮泥沙较多，需先进行预处理。利用悬浮泥沙等杂物比重大沉降快的特点，将样品在500mL水样瓶内进行12小时静置。待泥沙、杂物沉降到水样瓶下部后，提取上部干净藻液。同时补充与底部杂液相同量的蒸馏水以保证藻液的原始密度。室内纯培养的藻样可以直接进行测试。激光粒度仪分析采用英国马尔文公司MastersizdOOO激光粒度仪。通过显微镜观察与参考吸收率图集比对，设定激光粒度仪吸收率为O. 1，通过尝试设定折射率为I. 40，循环泵转速为1500rad/min保证充分混合又没有明显气泡。首先，加入V1 (600-700mL)体积的清水扫描背景值，再逐步加入被测样品，同时观测遮光度的变化，当遮光度达到10 20%时记录加入样品的量V2和对应的遮光度Ov，然后通过测定可以获得样品的粒径分布，通过V1;V2和Ov可以计算微囊藻密度，激光粒度仪除获得液体中悬浮颗粒的总遮光度的同时获得微囊藻群体大小和粒径分布。


图I为细胞密度与遮光度的关系；
图2为细胞密度与显微镜计数结果对比； 图3为4种试验样品中不同粒径所占总体积百分比的实测结果(a，11个；b，5个；C，4个；d，4个)。
具体实施例方式实施案例
(I)仪器及样品
测试采用英国马尔文公司Mastersize2000激光粒度仪。微囊藻藻种取于中科院水生所，使用BG-Il培养基培养于250ml锥形瓶中，光照强度5 50μΕ · m_2 · s_l，培养温度25°C，光暗比12 :12小时。在不同光强、扰动条件下进行培养，得到了群体特征各不相同的3种样品肉眼以及显微镜观测都能明确判别a类样品以单细胞为主，共计24个，b样品以群体为主，共计13个，c样品单细胞、小群体与较大群体混合共计9个。2010年6月，取样位置是太湖贡湖湾，在微囊藻漂浮较为明显的水面用63Mm浮游动物网进行捞取，通过福尔马林固定后带回实验室保存。肉眼以及显微镜观测都能明确判别微囊藻以大群体形态存在，偶见单细胞及小群体(d，样品共计13个)。(2)标准曲线绘制
对4种样品分别进行了显微镜观察和激光粒度仪分析。显微镜观察样品a直接通过显微镜计数得到藻密度Dm，b、C、d样品通过加碱煮沸的方法将微囊藻群体分散后进行细胞计数得到藻密度Dm。激光粒度仪分析采用英国马尔文公司Mastersize2000激光粒度仪。通过显微镜观察与参考吸收率图集比对，设定激光粒度仪吸收率为0.01，通过尝试设定折射率为
I.50，循环泵转速为1500rad/min保证充分混合又没有明显气泡。首先，加入V1^OO-TOOmL)体积的清水扫描背景值，再逐步加入被测样品，同时观测遮光度的变化，当遮光度达到10 20%时记录加入样品的量V2和对应的遮光度Ov，然后测定样品的粒径分布。利用悬浮颗粒遮光度的原理，使用激光粒度仪对微囊藻细胞数进行了实测。体积为V2的样品遮光度0M，可根据稀释后测得的遮光度Ov和稀释液的体积V1,按照公式(2)计算
Om=Ov (VV2)/V2⑵
用这一方法对4种，共35个样品(a，13个；b8个；C，5个；d，9个)的遮光度进行了实测，同时通过显微镜对细胞密度进行了实测，将细胞密度与遮光度的关系绘制成图I。从实测数据可以看出两者之间存在非常明显的线性相关关系，得到细胞密度与遮光度之间的换算公式(3)
Dc=kOM(3)
式中D。为通过激光粒度仪间接测定的细胞密度，k为遮光度系数通过本次实验得到室内培养样品k=22. 98;野外样品k=9. 03。(3)测定样品的藻密度
为了证明这一方法的准确性，对4种样品中未使用的24个样品(a, 11个；b，5个；C，4个；d，4个)使用了激光粒度仪进行测定，获取的细胞密度与显微镜计数结果对比，结果见图2。由图2可见激光粒度仪获得的结果与显微镜获得的结果基本一致。(4)微囊藻群体大小和粒径分布
激光粒度仪除获得液体中悬浮颗粒的总遮光度的同时，可以获得样品的粒径大小和粒径分布曲线。4种试验样品中不同粒径所占总体积百分比的实测结果见图3。
权利要求
1.、一种使用激光粒度仪实测微囊藻密度及群体大小的方法，其特征在于按如下步骤实现 A、现场样品预处理的方法为将样品在500mL水样瓶内进行12小时静置；待泥沙、杂物沉降到水样瓶下部后，提取上部干净藻液；同时补充与底部杂液相同量的蒸馏水以保证藻液的原始密度； B、采用激光粒度仪设定激光粒度仪吸收率为O.1，设定折射率为I. 40，循环泵转速为1500rad/min ； C、激光粒度仪测定的基本步骤为加入V1体积为600-700mL的清水扫描背景值，再逐步加入被测样品，同时观测遮光度的变化，当遮光度达到10 20%时记录加入样品的量V2和对应的遮光度Ov，然后通过测定可以获得样品的粒径分布，通过V1J2和Ov可以计算微囊藻密度； D、细胞密度与遮光度之间的换算公式为De=kOM，其中，D。为通过激光粒度仪间接测定的细胞密度，k为遮光度系数，Om为体积为V2的样品遮光度；以上所述参数中，室内样品k=22. 98;野外样品 k=9. 03; 其中体积为V2的样品遮光度Om可根据稀释后测得的遮光度Ov和稀释液的体积V1通过公示计算，其特征为Om=Ov (VfV2) /V2。
全文摘要
本发明涉及一种利用激光粒度仪实测微囊藻密度及群体大小的方法，通过对现场样品预处理，利用激光粒度仪能够通快速并同时测定微囊藻密度及群体粒径分布。具体实施步骤如下步骤一，将样品静置12h，收集上清液并补充与底部杂液相同量的蒸馏水；步骤二，设定激光粒度仪吸收率为0.1，设定折射率为1.40，循环泵转速为1500rad/min；步骤三，加入V1(600-700mL)体积的清水扫描背景值，再逐步加入被测样品，当遮光度达到10～20％时记录加入样品的量V2和对应的遮光度OV，然测定微囊藻粒径分布并计算微囊藻密度。
文档编号G01N15/02GK102818755SQ20121025425
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者朱伟, 李明, 李林, 罗永刚, 代晓炫, 肖曼, 郭丽丽 申请人:河海大学