专利名称：调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效液相色谱分析法，具体地说，涉及用高效液相色谱法分析调吡脲及其杂质的含量。
背景技术：
N-(2-氯-4-吡啶)-N’-苯基脲(简称调吡脲，N-(2-chloro-4-pyridyl)-N’-phenylurea，CPPU)是一种细胞分裂素类的植物生长调节剂，能够诱导某些植物如萝卜、番茄、苹果、浆果和葡萄中花色素苷及碳水化合物的积累。其生理活性高于一般嘌呤型细胞分裂素，而且合成简便，成本低廉，被认为是玉米素的廉价代替品。目前关于CPPU的研究主要集中于其作用机理和应用方面[参见候勇，马国瑞，夏中梅，曾显斌，植物营养与肥料学报，1999，5(2)，106-114]。关于CPPU的测定方法，目前国内已有气相色谱法[参见姜欣，周宁，农药，1996，35(9)，21-22；雷绍荣，罗玲，土壤农化通报，1997，12(4)，55-56]、高效液相色谱法[参见徐德锋，吴苏江，江苏农药，1999，4，18-19；朱培芳，刘玉林，第十四次全国色谱学术报告会论文集，2003，LC-094，287-289]。
调吡脲通过以下反应制得[参见DE 2843722(1979)；US4193788(1980)] 因而在产品中可能存在原料4-氨基-2-氯吡啶(4-Amino-2-chloropyridine，ACP)和副产物N，N’-二苯脲(N，N’-Diphenylurea，DPU)等，生产中必须进行控制。但同时测定产品中共存杂质含量的方法尚未见报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种能测定调吡脲含量及其杂质含量的高效液相色谱法。
本发明的技术方案如下一种调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法，其特征是采用反相高效液相色谱法，高效液相色谱条件为色谱柱C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，流动相组成体积比甲醇∶水＝60∶40，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长UV 254nm。
进样量5-10μL上述的调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法，是将测定杂质含量的进样浓度稀释50倍后测定调吡脲的含量。
采用本发明的调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法可以同时准确测定CPPU样品中CPPU及其中杂质ACP及DPU的含量。为生产进程中的质量控制分析提供了简单可靠的方法。


图1为不同流动相组成的色谱图，其中(a)60％甲醇-40％水；(b)70％甲醇-30％水；(c)80％甲醇-20％水。图中(1)ACP；(2)DPU；(3)CPPU。
图2为CPPU的标准曲线。
图3为ACP的标准曲线。
图4为DPU的标准曲线。
图5为样品中主成分CPPU含量测定的色谱图。
图6为样品中杂质ACP、DPU含量测定的色谱图。
具体实施例方式
实验仪器及色谱条件Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪，配备真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，996型二极管阵列(PDA)检测器(美国Waters公司，Milford，MA，USA)。色谱分离系统的控制和记录由Waters Millinium32色谱工作站完成。
色谱柱选用的是Kromasil C18(江苏汉邦科技股份有限公司)，5μm，150×4.6mm(I.D.)。流动相甲醇∶水＝60∶40(体积比)；流速1.0mL/min；柱温30℃，检测器UV 254nm。
试剂与药品N-(2-氯-4-吡啶)-N’-苯基脲(CPPU)，4-氨基-2-氯吡啶(ACP)和N，N’-二苯脲(DPU)对照品由江苏省金坛市茂盛助剂厂提供。所有的对照品均经过红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(1H NMR)表征，并与标准谱图比较，结构得到确认。甲醇(HPLC级)购自江苏汉邦科技股份有限公司。实验中流动相和溶液用水均为二次石英蒸馏水。
实施例1.色谱条件的选择1.1流动相我们对不同的流动相组成进行了比较，按甲醇比例由高往低进行试验，在甲醇-水比例为60∶40(体积比)的条件下，各成分能够达到基线分离，见图1。
1.2检测波长用二极管阵列检测器在200-400nm进行连续扫描，可知ACP在244nm处有最大吸收，而DPU及CPPU在254nm处有较强的吸收。兼顾二者测定的灵敏度，选择检测波长为254nm。
1.3样品浓度为了兼顾主成分含量与杂质含量的测定，在测定杂质时，样品的浓度必须较大，足以使杂质能够出峰；测定主成分含量时，溶液浓度太大会导致主峰超线性而使定量不准，故将样品稀释50倍后测定，试验准确度(见表1)令人满意。
实施例2.标准曲线标准溶液的配制准确称取100.00mg CPPU对照品，置于100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为1.0mg/mL的标准储备液，分别精密移取适量储备液用流动相配制成系列标准溶液。
准确称取50.00mg ACP对照品和50.00mg DPU对照品，分别置于100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀至刻度，摇匀，得浓度为0.50mg/mL的储备液。精密移取10.00ml ACP和5.00ml DPU储备液加入同一100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀至刻度，摇匀，得浓度为ACP与DPU浓度分别为0.05mg/mL、0.025mg/mL的混合标准储备液。再逐级稀释得系列标准溶液。
在ACP与DPU标准溶液浓度范围分别为0.0001～0.06mg/mL及0.00005～0.03mg/mL，取混合对照品溶液5μL进样量，以峰面积对浓度作图(见图3和4)，回归方程分别为AACP(area)＝-445.90292+1.39318E7 CACP，r＝0.99911；ADPU(area)＝75.39214+4.32183E7CDPU，r＝0.99970在CPPU标准溶液浓度范围为0.0001～0.4mg/mL时，取10μL溶液进样量，以峰面积对浓度作图(见图2)，回归方程为ACPPU(area)＝-13313.94609+6.88958E7 CCPPU，r＝0.99944当信噪比S/N＝3时，测得ACP，DPU，CPPU的最低检测限分别为0.00001mg/mL、0.000005mg/mL、0.00001mg/mL。
实施例3.样品测定3.1主含量的测定样品溶液的制备准确称取约100mg CPPU试样，置于100mL容量瓶中，加10mL甲醇溶解，再加流动相至刻度，摇匀备用。移取2.0mL上述溶液置于100mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀备用。
选择任意5个批号的样品，按上述方法配制样品溶液，在最佳试验条件下进行HPLC分析，进样量为10μL(见图5)。
3.2杂质测定样品溶液的制备准确称取约100mg CPPU试样，置于100-mL容量瓶中，加10mL甲醇溶解，再加流动相至刻度，摇匀备用。
选择任意5个批号的样品，按上述方法配制样品溶液，在最佳试验条件下进行HPLC分析，进样量为5μL(见图6)。
样品中主成分CPPU及杂质的检测结果见表1
表1.检测结果批号CPPU ACP DPU含量 含量 R.S.D 含量R.S.D(％) R.S.D(％)(％) (％) (％) (％)1 99.71 0.68 0.274 1.05 0.008233.962 99.59 0.22 0.274 1.02 0.008762.103 99.66 0.27 0.278 1.10 0.008892.224 99.72 0.57 0.274 0.58 0.008931.075 99.68 0.21 0.274 0.64 0.008731.3权利要求
1.一种调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法，其特征是采用反相高效液相色谱法，高效液相色谱条件为色谱柱C18，5μm，150×4.6mm(I.D.)，流动相组成体积比甲醇∶水＝60∶40，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长UV 254nm，进样量5-10μL。
2.根据权利要求1所述的调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法，其特征是将测定杂质含量的进样样品浓度稀释50倍测定调吡脲的含量。
全文摘要
一种调吡脲及其杂质的高效液相色谱分析法，高效液相色谱条件为色谱柱C
文档编号G01N30/88GK1560628SQ200410014128
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月23日 优先权日2004年2月23日
发明者练鸿振, 李丹妮, 朱卫 申请人:南京大学