专利名称：新霉素elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及新霉素残留量的酶联免疫试剂盒，特别 是检测鸡肉中新霉素残留量的酶联免疫检测(ELISA)试剂盒，ELISA(EnzymeLinked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之 后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术新霉素是氨基糖甙类抗生素，被广范应用于动物疾病的治疗，由 于其具有神经毒性和肾脏毒性，在动物食品中的残留会影响人类健康，欧美国家及我国均 要求其限量使用。新霉素残留量的常规检测方法主要有薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、毛 细管电泳(CE)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适 合现场监控和大量样本的筛查。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的新霉素 残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术 含量不高，可进行一次连续多个样品中新霉素残留量的测定，减少了检测样本所需要的时 间。本实用新型的技术方案是一种新霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一 块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和 一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预 包被新霉素偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗工作液、抗体 工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大 小、不同颜色的塑料瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质控报 告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml标准品溶液、Iml酶 标二抗工作液、7ml新霉素抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、7ml终止液、40ml 浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析 孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将剩下的放回铝箔 袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本中的新霉素将和 酶标板微孔条上预包被的新霉素偶联抗原竞争抗新霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底 物显色，样本吸光度值与样本中所含新霉素的残留量成负相关，与标准曲线比较再乘以其 对应的稀释倍数，即可得出样品中新霉素残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度鸡肉样本的最低检测限为10yg/kg，回 收率范围均在65% 95%之间；相对于其他新霉素检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只 需要酶标仪、离心机、振荡机、涡旋仪和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本 较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于新霉素残留量的检测。

图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被新霉素偶联抗原(3)固定于酶标板的外框 支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温箱 内反应时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透 明PE塑料试剂瓶(5)用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料试剂瓶(5)用于 封装50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红 色帽(6)的黑色PE塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料 试剂瓶(7)用于封装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装7ml酶标二抗 工作液，绿色帽的白色PE塑料试剂瓶(8)用于封装IOml新霉素抗体工作液，黑色帽的半透 明PE塑料试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个下凹瓶 位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)，50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶 位(14)，7ml显色液B液瓶位(13)，7ml终止液瓶位(12)，7ml新霉素抗体工作液瓶位(16)， 7ml酶标二抗工作液瓶位(15)，7瓶Iml/瓶各种浓度的标准品溶液，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理配液1:2M盐酸溶液量取80ml浓盐酸入到400ml去离子水混勻。配液2 提取缓冲液称取17. Og十二水合磷酸氢二钠、0. 34g磷酸二氢钾加去离子水溶解定溶至 500ml。配液3 IM氢氧化钠溶液称取4. Og氢氧化钠加去离子水混勻溶解定容至IOOml。配液4:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液5 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2.鸡肉样本处理步骤称取2. 0士0. 05g去除脂肪的粉碎样本置于50ml聚苯乙烯离心管中；加入7ml提取液振荡5min，放入60°C水浴环境中60min，取出冷却至室温并摇勻；加入Iml 2M盐酸溶 液混勻3min ；3000g以上，室温离心IOmin ；取上清液200 μ 1加入到765 μ 1的复溶工作液 中，再加入35 μ 1 IMNaOH充分混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种液 体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。4、加标准品/样本加标准品/样本50 μ 1/孔，加酶标二抗50 μ 1/孔，再加入抗 体工作液50 μ 1/孔，用盖板膜封板，25°C避光环境中反应30min。5、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液工作液(配液5)每孔 250 μ 1充分洗涤4-5次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净 的枪头刺破)。6、显色每孔加入显色剂A液50 μ 1，再加B液50 μ 1，轻轻振荡混勻，25°C环境中 避光显色15min。7、测定每孔加入终止液50 μ 1，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与新霉素残留量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 600，样本2的吸光度值为1. 500，标准液吸光度值分别是 1 μ g/L 为 2. 059 ；0. 5 μ g/L 为 1. 761 ； 1. 5 μ g/L 为 1. 176 ；4. 5 μ g/L 为 0. 578 ； 13. 5 μ g/L 为 0. 346 ；40. 5 μ g/L为0. 157。则样本1的浓度范围是1. 5 μ g/L-4. 5 μ g/L再乘以其对应的稀 释倍数即可得出样本中新霉素残留量的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 5 μ g/L-1. 5 μ g/ L再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中新霉素残留量的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以新霉素标准品浓度(μ g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应 的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中新霉素实际残留量。[0049]四、测 定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性， 重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、试剂混合要均勻，否则会出现重复性不好的现象。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不 要交换使用不同批号的盒中试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0. 5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、加A、B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过 30mino
权利要求1.一种新霉素ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、 14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶 标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被新霉素偶联抗原制成的 检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗工作液、抗体工作液、显色液A液、显色液 B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液均用黑色帽的半透明PE塑料瓶，酶 标二抗工作液用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A 液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白 色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE 塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗工作液1瓶，7ml ；抗体工作 液1瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1 瓶，40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种新霉素残留量检测的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗工作液、新霉素抗体工作液、新霉素7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的新霉素将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗新霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中新霉素的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在新霉素的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201852834SQ201020586588
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何丽霞, 何方洋, 余厚美, 刘福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申请人:北京勤邦生物技术有限公司