专利名称：一种在微通道中固定细胞的方法
技术领域：
本发明涉及固定细胞的方法，具体地，涉及一种在微通道中固定细胞的方法。
背景技术：
细胞是生命体结构和生命活动的基本单元，利用活细胞在分子水平上进行复杂生命现 象的研究已成为当代生命分析化学、药物筛选、药物代谢及药物动力学等领域的一项不可 或缺的课题。另外，以微通道为基本结构的微分析体系具有集成化和功能化的潜在优势， 将细胞固定在微通道中进行分析检测是对细胞水平研究的一项革新，具有试剂用量少、分 析速度快、可重复使用、易于与反应产物分离等特点。
目前已有文献报道 (Won—Gun Koh, Alexander Revzin, Michael V. Pisshko, Poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures encapsulating living cells, 丄朋g腦k 2002, 18， 2459-2462.)，利用水凝胶包埋法可将细胞固定在微通道。该方法步 骤包括，首先形成不可逆密封及密闭微通道；再形成含细胞的水凝胶前体；然后在微通道 内形成凝胶；最后用缓冲溶液冲洗通道，在微通道内可得到含有细胞的水凝胶微结构。该 方法的缺点是，微通道中的水凝胶极大增加了微流体控制难度，不利于后续细胞分析研 究。因此，本发明所要解决的技术问题，是设计一种新的在微通道中固定细胞的方法，不 仅要工艺简单、操作方便、可有效保持细胞的活性，而且易于实现微流体的操控，从而为 微通道细胞分析研究奠定基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、操作方便、易于实现微流体操控、可有效保持 细胞活性的在微通道中固定细胞的方法。
本发明的技术方案如下 一种在微通道中固定细胞的方法，它包括以下步骤处理 该微通道的内壁，使其带有正、负电荷中的一种电荷；将一种与该内壁电荷极性相反
的聚电解质组装于该微通道内壁，以形成一界面；将荷电的生物聚电解质修饰在该界面 上；最后，将含细胞的培养液引入该微通道内，利用细胞表面的荷电性将细胞固定在微 通道中。
对于微通道系由内径为100-500Mm的石英毛细管构成的实例，处理该微通道的内壁 是用碱溶液润洗该内壁，使其带负电。对该内壁润洗的时间为0.2-2小时。所述的将 聚电解质组装于该微通道内壁，包括将多种荷电相反的聚电解质依次层层组装于该微通 道内壁，形成一界面。所述的将聚电解质组装于该微通道内壁，包括将聚电解质溶液以 100-500WVh引入该微通道内并停留5-60分钟。所述的将生物聚电解质修饰在该界面， 包括将生物聚电解质溶液以100-500叱/h引入该微通道内并停留5-60分钟。所述的将 含细胞的培养液引入该微通道内，利用细胞表面的荷电性将细胞固定在微通道中，包括 将培养液置入培养箱中12-24小时，再以30-200 u L/h的流速更换培养液。
本发明的优点是
1. 工艺简单，操作方便，原料易得；
2. 因微通道的容积小，所以样品和试剂消耗量小；
3. 因固定细胞的表面生物兼容性好，所以可保持细胞活性；
4. 因细胞固定于微通道内表面，易于实现微流体操控，所以有利于进行后续细 胞分析研究；
具体实施例方式
以下结合实例对本发明的具体步骤作进一步的详述。
在本实例中，采用100-500刚内径长为10-100 cm的石英毛细管作为本发明微通道的 具体实例，因为目前絕大部分微通道均由石英构成，并且，该微通道的外端可与一蠕动泵 相连，以实现自动操作。
首先，处理该微通道的内壁，使其带有正、负电荷中的一种电荷，可利用蠕动泵以 0. l-lmol/L浓度的如NaOH碱溶液润洗石英毛细管内壁约0. 2-2小时，使其内壁带有负电 荷。
为提高下面组装步骤的效果，在此还可用例如5倍于石英毛细管容积的水进行冲洗， 以清除残余的碱溶液。
其次，将聚电解质溶液如聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液，以100-500化/h
流速引入石英毛细管中，以对该石英毛细管内壁进行组装，时间约5-60分钟。
进一步，为提高组装界面的稳定和均匀，有利于以下生物聚电解质在其上的修饰，本 步骤还可利用静电作用将多种荷电相反的聚电解质依次层层组装于该微通道内壁。也就是 说，在上述引入PDDA溶液后再引入如聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液，以此类推，完成多层 组装，以形成更为稳定均一的界面。
重要的是，为构建一个生物兼容的微环境，在上述组装步骤后，还需用荷电的生物电 解质对上述组装的界面进行修饰，具体地，可用例如聚-L-赖氨酸(PLL)溶液，以 100-500WVh流速引入石英毛细管中，修饰时间约5-60分钟。
最后，以30-200叱/h的流速将含有lxl(f-5xl(T个/niL乳腺癌细胞MCF--7 (或其它待 研究的细胞)的培养液引入石英毛细管中，置入细胞培养箱中。12-24小时后，以 30-200叱/h的流速更换毛细管中的培养液，处于未固定状态的细胞由毛细管中洗脱出来， 大多数细胞因处于固定状态而留于毛细管中。
通过比较毛细管中最初接种的细胞和接种24小时后毛细管中处于固定状态的细胞， 可以检测毛细管中固定化细胞的活性，为此，采用600-1200W7h流速的新鲜培养液将经 过本发明方法固定化细胞洗脱下来，收集，并进行台盼蓝排斥试验，检测结果证明固定化 的细胞至少可在微通道中存活48小时。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者， 在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视 所附之权利要求范围所界定。
权利要求
1、一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，它包括以下步骤处理该微通道的内壁，使其带有正、负电荷中的一种电荷；将一种与该内壁电荷极性相反的聚电解质组装于该微通道内壁，以形成一界面；将荷电的生物聚电解质修饰在该界面上；最后，将含细胞的培养液引入该微通道内，利用细胞表面的荷电性将细胞固定在微通道中。
2、 根据权利要求l所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的微通道系 由内径为100-500m的石英毛细管构成。
3、 根据权利要求2所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的处理该微 通道的内壁是用碱溶液润洗该内壁，使其带负电。
4、 根据权利要求3所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，对该内壁润洗的 时间为O. 2-2小时。
5、 根据权利要求l所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的将聚电解 质组装于该微通道内壁，包括将多种荷电相反的聚电解质依次层层组装于该微通道内壁，形 成一界面。
6、 根据权利要求1或5所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的聚电解 质为聚二烯丙基二甲基胺盐酸盐(PDDA)溶液和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液。
7、 根据权利要求1或5所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的将聚 电解质组装于该微通道内壁，包括将聚电解质溶液以100-500WVh流速引入该微通道内并停 留5-60分钟。
8、 根据权利耍求1所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的生物聚电 解质为聚-L-赖氨酸(PLL)溶液。
9、 根据权利要求1或8所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的将生 物聚电解质修饰在该界面，包括将生物聚电解质溶液以100-500ML/h流速引入该微通道内并 停留5-6。分钟。
10、 根据权利要求1所述的一种在微通道中固定细胞的方法，其特征是，所述的将含细 胞的培养液引入该微通道内，利用细胞表面的荷电性将细胞固定在微通道中，包括将培养液 置入培养箱中12-24小时，再以30-200 u L/h的流速更换培养液。
全文摘要
本发明公开一种在微通道中固定细胞的方法，该方法采用层层组装技术将多种聚电解质分层、均匀地组装于微通道的内壁，形成稳定、均一界面；然后将生物聚电解质修饰在界面上，构成一个生物兼容性的微环境；最后利用细胞表面的荷电性，将细胞固定在微通道中，在体外营建一种适合细胞生存的微环境。该方法工艺简单，操作方便，易于实现微流体操控、可有效保持细胞活性。
文档编号G01N33/48GK101196514SQ20071017352
公开日2008年6月11日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者刘宝红, 吴会灵, 姜远英, 曹永兵, 杨芃原, 季 纪, 范国荣, 陈礼潮 申请人:中国人民解放军第二军医大学