专利名称：：中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法
技术领域：
：本发明涉及一种成分极其复杂的混合物的红外光谱非分离提取多级宏观指纹分析鉴定、鉴别方法，尤其是涉及一种中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，属于中药检测
技术领域：
。中药配方颗粒是极其复杂的混合物体系。目前主要是采用薄层色谱(TLC)法来鉴定、鉴别。它根据试样的浸泡液，点在薄层色谱板上后出现的色谱斑点位置与已知中药对照品的位置相比较，可以比较快速、简便地、准确地判断。然而，由于它易受实验条件与环境等多因素的影响而实验技术要求很高，以致方法的再现性较差。此外，有人提出用不同极性的一组溶剂浸取或萃取后，利用光谱法(紫外、红外)所测得的谱图的特征性来判断。《中药鉴别紫外谱线组法及应用>(袁久荣著，人民卫生出版社，1999年，北京)中，曾提出“紫外谱线组法”来鉴别中药(四种溶剂的浸取液的UV谱，导数UV谱)。近来，田进国(中国药科大学学报，1997，20(1)23-28)对数十种中药材进行红外谱线组的鉴别。他们都是在对中药预先作多溶剂的浸取分离后进行鉴别、鉴定的。也已有人经溶剂浸取或萃取后，或用光谱法，或用气相色谱，液相色谱来分离，随后可用各种仪器分析手段联用获取有效成分来判断。然而，这些方法丧失了整体分析性，丧失体系的原本性和配伍性。虽然气相色谱，液相色谱有非常强的分离能力，但是由于药材本身因随生长等条件的差异，即中药药材往往从源头便不能严格控制，将造成其“有效成分”或“控制成分”的不稳定性或本身可靠性不足，又加上分析时标准化合物不容易获得从而导致难以实现鉴别。本发明提出的一种中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)在中药配方颗粒粉末中加入溴化钾进行压片制样；(2)测定压片试样的中红外光谱，近红外光谱，漫反射近红外光谱、漫反射光谱，衰减全反射光谱；(3)求出并绘出上述相应红外光谱图的二阶导数谱；(4)测定压片试样的二维相关红外谱，产生它的是任何形式的扰动；(5)依次分级对比相应图谱，即可直接进行中药配方颗粒的非分离提取鉴定、鉴别；(6)测定中药配方颗粒中主料和辅料的相对含量。在上述鉴定方法中，步骤(4)所述的二维相关红外谱可以是同步谱，或异步谱或两者兼用；所述的二维相关红外谱可以是各种形式的图象，优选为等强度图、鱼网图，多维立体图，彩色图中的任何一种或两种；所述的扰动形式为热、光、电、磁、机械力的扰动的其中之一。在上述鉴定方法中，步骤(5)所述的分级对比可以是红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外谱三种谱图单个进行对比，或者将其中任意两者结合在一起进行对比，或者将三者结合在一起相互进行对比。在上述鉴定方法中，所述分级对比以步骤(2)所获得的红外光谱为一级对比、以步骤(3)所获得的二阶导数谱为二级对比、以步骤(4)所获得的二维相关红外谱为三级对比。在上述鉴定方法中，所述分级对比中的一级红外光谱对比为(1)观察图谱总体形状或形貌，即峰位、峰强度、峰形的相似性来初步鉴别；(2)在1800～400cm-1区间内选取3～5个强谱峰簇，其峰位波动在±2cm-1之内，视为相同或相近，将谱峰簇中最强峰的强度大小依次排序，根据它们的排序和相对强度比来鉴别鉴定；(3)在1800～400cm-1区间内选取上述峰簇中3～5个次强谱峰，其峰位波动在±2cm-1之内，视为相同或相近为辅来鉴别。在上述鉴定方法中，所述分级对比中的二级二阶导数谱对比为(1)观察图谱总体形状或形貌，即峰位、峰强度、峰形的相似性来初步鉴别；(2)在1800～400cm-1区间内选取红外图谱中最强谱峰峰位就近的导数峰视为相同或相近，其峰位波动在±2cm-1之内，并且比较各强峰之间的相对强度的大小和次序；(3)在1800～400cm-1区间内选取红外图谱中最强谱峰中两侧是否出现相应的肩峰峰位来鉴别，其峰位波动在±2cm-1之内。在上述鉴定方法中，所述分级对比中的三级二维相关红外谱对比是用二维相关谱进行对比来判断选取同步相关谱中的强峰或强峰簇的自动峰，对比它们的峰位及其强度，以及对比所选取的自动峰与其它自动峰之间的交叉峰的正负号的异同来鉴别它们的异同。在上述鉴定方法中，步骤(6)所述的测定中药配方颗粒中主料和辅料的相对含量的方法为先将颗粒料与辅料按重量比配成系列试样；按上述步骤(1)和(2)作出红外谱图；取配方颗粒与辅料各自的特征峰的强度比为纵坐标，以颗粒料与辅料的重量比为横坐标作图；以指数函数或线形函数关系拟合成单值工作曲线，配方颗粒的含量由此工作曲线直接读出。在上述鉴定方法中，所述的辅料为一种或配比固定的两种以上成份。在上述鉴定方法中，粉末试样可直接测定近红外光谱，漫反射近红外光谱、漫反射光谱，衰减全反射光谱。基于红外本身的丰富的指纹性及利用部分特征峰的峰位、峰形及其变化，峰强度或/及相对峰强度的变化，本发明提出用无损的红外光谱法直接进行中药配方颗粒的鉴定鉴别。包括与标准样的图谱比对法，借助于计算机辅助解析的多种技术进行鉴定与识别，以及二维红外相关分析技术来监控药物的稳定性等方法。从而可以不失源本性、无损地、简便、快捷，无需进行分离过程便直接测试，不破坏中药的配伍性，即可获取中药的整体信息，并以此来鉴定、鉴别中药。这被称作为宏观指纹法。为了整体地、无损地、不经过分离提取、试样仅作简单处理、经快速测定便能简便地、正确地鉴定、鉴别中药配方颗粒并使之规范化，本发明提出采用的红外光谱法，包括测定试样的常规红外光谱图、导数光谱图、二维相关红外谱为一体的多级宏观指纹鉴定法。通过此法获得不失试样原本性，配伍性的宏观的指纹信息，因此更具有直观性。它符合中医药辩证施治原则。此外还可以同时获取药品稳定性和变质机理的信息，并且便于推广。本发明基于这样的原理，即物质的红外光谱图具有指纹性可作为一级谱图进行对比鉴定，当极其相似的物质可能其差异性仍然不够明显时，可借助其导数光谱作为二级谱图进行对比，进一步检验出较为微小的差异，当上述两级谱图的差异仍不足以区别与鉴定时，可以进一步用分辨率更高的二维红外相关谱图进行对比鉴定。从而可非常直观地进行鉴定、鉴别与质量控制。采用本发明提出的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法无需对试样进行分离，就可无损地、非破坏性地、快速地、简便地、不失原本性、不失配伍性地、直观地鉴定中药配方颗粒及其质量。这是一个符合中医中药学的辩证施治原则的根本方法。它的建立与推广将大大加速中药质控进程，大大加速中药现代化和国际化的速度。图2a、2b为实施例1鱼腥草的导数谱图。图3a、3b为实施例1鱼腥草的二维相关等位线谱图。图4a、4b为实施例1鱼腥草的二维相关鱼网图。图5为实施例1栀子的中红外谱图。图6a、6b为实施例1栀子的导数谱图。图7a、7b为实施例1栀子的二维相关等位线谱图。图8a、8b为实施例1栀子的二维相关鱼网图。图9为实施例1不同厂家的鱼腥草的配方颗粒红外谱图比较。图10为实施例1不同厂家的栀子的配方颗粒红外谱图比较。图11为实施例2紫草的中红外谱图。图12a、12b为实施例2紫草的导数谱图。图13a、13b为实施例2紫草的二维相关等位线谱图。图14a、14b为实施例2紫草的二维相关鱼网图。图15为不同厂家的实施例2紫草的配方颗粒红外谱图比较。图16为实施例2茜草(主料)和糊精(辅料)配比样品的系列红外图谱。图17为实施例2茜草(主料)含量的工作曲线。(2)鱼腥草和栀子及其各自的配方颗粒样品分别研磨后加入KBr，压片，制成试样，置于仪器变温池内，温度程控从室温到150℃，原位实时间隔采样，每升温10℃，采集红外光谱，连续获取系列谱图—变温动态谱。(3)对于室温(～20℃)的红外光谱图，进行谱图的求导处理，获得导数图谱。(4)对于系列变温动态谱，利用2D-相关分析软件处理，获得2DIR相关谱图同步相关谱、异步相关谱。(5)生产厂家(首创大地药业有限公司)的鱼腥草的中红外谱图及其导数谱图和热微扰的同步二维相关谱图(等强度图和立体鱼网图，如图1-图3所示)及其特征的描述及三个厂家的产品的中红外谱图对比图，如图4所示。生产厂家(首创大地药业有限公司)的栀子的中红外谱图及其导数谱图和热微扰的同步二维相关谱图(等强度图和立体鱼网图)及其特征的描述及三个厂家的产品的中红外谱图对比图。显然，通过各级谱图主要谱峰的峰位、峰形、峰宽作简单的对比已足以区别不同种类配方颗粒，同种类不同生产厂家配方颗粒以及同厂家生产的同种类却不同批次配方颗粒。比如，首先以红外谱图的相似性为依据，借助于谱图中的三组主峰簇(最强峰簇记以①；亚强峰记以②；次强峰记以③)进行对比，便可对本配方颗粒加以鉴定、鉴别，见下表。导数谱和二维相关谱可同样进行比对。显然，通过各级谱图主要谱峰簇的峰位、峰形、峰宽作简单的对比已足以区别和认定有关配方颗粒的种类以及不同厂家的产品的特点，以及鉴定配方颗粒所含添加剂辅料的多少。配方颗粒IR～1600cm-1簇峰IR～1410cm-1簇峰IR～1100cm-1簇峰鱼腥草①1610③1412②1144、1100、1076、(A厂)1047、1014鱼腥草①1610③1405②1141、1100、1077、(B厂)1014鱼腥草①1611③1411②1144、1100、1076、(C厂)1047、1014栀子(A厂)②1716，1615，1516③1413，1282①1077、1044栀子(B厂)②1716，1615，1516③1411，1283①1076、1047栀子(C厂)②1716，1615，1516③1412，1284①1077、1047鱼腥草与栀子配方颗粒从IR图形总体，各主簇峰位，及它们的相对强度，容易看到不同种配方颗粒有相当大的区别，由此可鉴别。不同厂家同种药品有微小的差别。本例中所加辅料(糊精)不明显。附鱼腥草配方颗粒谱图说明图1为鱼腥草配方颗粒的KBr压片红外谱图，主要吸收峰如图所示。图2a和2b为860~1170cm-1和1170~1500cm-1范围内的二阶导数图，谱峰如图所示。图3a和图3b为860~1160cm-1和1160~1500cm-1波数范围的二维红外相关图。图3a中，明显的自动峰有9个，分别在885cm-1，904cm-1，952cm-1，974cm-1，1018cm-1，1050cm-1，1078cm-1，1107cm-1和1134cm-1。其中1018cm-1的自动峰强度最大，904cm-1和1107cm-1的自动峰强度较大，其它自动峰强度中等或较小。1018cm-1，1050cm-1，1078cm-1和1107cm-1的自动峰同其它自动峰交叉峰为负，其它自动峰之间交叉峰为正。图3b中，明显的自动峰有6个，分别在1196cm-1，1210cm-1，1413cm-1，1429，1452cm-1和1467cm-1。其中1196cm-1和1210cm-1的自动峰强度最大，其它自动峰强度较大。1196cm-1和1210cm-1的自动峰同其它自动峰交叉峰为负，其它自动峰之间交叉峰为正。附栀子配方颗粒谱图说明图5为栀子配方颗粒的KBr压片红外谱图，主要吸收峰如图所示。图6a和6b为850~1180cm-1和1180~1500cm-1范围内的二阶导数图，谱峰如图所示。图7a和图7b为860~1160cm-1和1160~1500cm-1波数范围的二维红外相关图。图7a中，明显的自动峰有8个，分别在882cm-1，908cm-1，939cm-1，972cm-1，998cm-1，1065cm-1，1092cm-1和1141cm-1。其中972cm-1和998cm-1的自动峰强度最大，1065cm-1和1141cm-1的自动峰强度较大，其它自动峰强度中等或较小。它们之间的交叉峰均为正。图7b中，明显的自动峰有5个，分别在1184cm-1，1196cm-1，1215cm-1，1452cm-1和1466cm-1。其中1184cm-1，1196cm-1和1215cm-1的自动峰强度最大，其它自动峰强度较大。1184cm-1，1196cm-1和1215cm-1的自动峰同其它自动峰交叉峰为负，其它自动峰之间交叉峰为正。附不同厂家生产的鱼腥草配方颗粒谱图比较的说明图9所示为不同厂家生产的鱼腥草配方颗粒，其特征峰为1610±1cm-1，1412±1cm-1，1100cm-1，1077和1047cm-1。A、B、C都含有共有的特征峰，可以认定这三个谱图都是鱼腥草。糊精的主强峰在1079和1019cm-1，而鱼腥草配方颗粒的主强峰在1610cm-1，为此A、B、C三个厂家所添加辅料的特征峰不明显。附不同厂家生产的栀子配方颗粒谱图比较的说明图10所示为不同厂家生产的栀子配方颗粒，其特征峰为1615cm-1，1516±1cm-1，1413cm-1，1282cm-1，1077cm-1和1044cm-1。A、B、C都含有共有的特征峰，可以认定这三个谱图都是栀子配方颗粒。糊精的主强峰在1079和1019cm-1，而栀子配方颗粒的主强峰在1615和1077±1cm-1，为此A、B、C三个厂家所添加辅料的特征峰不明显。实施例2紫草配方颗粒的鉴定(1)实验采用SpectrumGXFTIR光谱仪(PerkinElmer，USA)，DTGS检测器，分辨率为4cm-1，测量范围4000～400cm-1，扫描32累加获谱。采用50-886型PortableController可编程温度控制单元(LoveControl公司)。(2)紫草配方颗粒样品分别研磨后加入KBr，压片，制成试样，置于仪器变温池内，温度程控从室温到150℃，原位实时间隔采样，每升温10℃，采集红外光谱，连续获取系列谱图—变温动态谱。(3)对于室温(～20℃)的红外光谱图，进行谱图的求导处理，获得导数图谱。(4)对于系列变温动态谱，利用2D-相关分析软件处理，获得2DIR相关谱图同步相关谱、异步相关谱。(5)生产厂家(首创大地药业有限公司)紫草配方颗粒的中红外谱图及其导数谱图和热微扰的同步二维相关谱图(等强度图和立体鱼网图)及其特征的描述及三个厂家的产品的中红外谱图对比图。显然，通过各级谱图它们的主要谱峰和特征峰的峰位、峰形、峰宽及其相对强度作简单的对比已足以认定和区别有关配方颗粒不同厂家的或同厂家不同批次产品的特点，以及鉴定配方颗粒所含添加剂辅料的多少。分析三个厂家的产品的中红外谱图见下表。配方颗粒IR～1600cmIR～1410IR～1250IR～1100cm-1簇峰-1簇峰cm-1簇峰cm-1簇峰紫草(A厂)①1603③1420④1265①1030紫草(B厂)①1603③1404④1262②1056紫草(C厂)②1603③1416④1245①1152、1079、1026可以看到三厂家在1603cm-1处有相同的峰位，厂家A和厂家B则相近，而与厂家C有较大的差别，因为后者含有一定量的糊精。附紫草配方颗粒谱图的说明图11为紫草配方颗粒的KBr压片红外谱图，主要吸收峰如图所示。图12a和12b为850～1180cm-1和1180～1500cm-1范围内的二阶导数图，谱峰如图所示。图13a和图13b为860～1160cm-1和1160～1500cm-1波数范围的二维红外相关图。图13a中，明显的自动峰有8个，分别在897cm-1，941cm-1，970cm-1，1005cm-1，1042cm-1，1066cm-1，1097cm-1和1139cm-1。其中970cm-1的自动峰强度最大，897cm-1的自动峰强度较大，其它自动峰强度中等或较小。它们之间的交叉峰均为正。图13b中，明显的自动峰有5个，分别在1199cm-1，1385cm-1，1412cm-1，1452cm-1和1467cm-1。其中1199cm-1的自动峰强度最大，其它自动峰强度较大。1199cm-1和1385cm-1的自动峰同其它自动峰交叉峰为负，其它自动峰之间交叉峰为正。附不同厂家生产的紫草配方颗粒谱图比较的说明图15所示为不同厂家生产的紫草配方颗粒，其特征峰为1603cm-1，1420cm-1，1265cm-1和1030cm-1。A、B、C三个厂家共有的特征峰较少，只有1603cm-1一个峰。糊精的主强峰在1079和1019cm-1，而紫草配方颗粒的主强峰分别在1603、1056和1026cm-1，这是因为厂家C添加了大量的糊精辅料而造成主强峰向低波数位移。为了说明这一点，进一步用含有不同比例的茜草和糊精(辅料)配比样品的系列红外图谱加以阐述。典型的茜草的主峰为1599cm-1，1384cm-1，而糊精的主峰为1018cm-1。由图12b可以看出，随着辅料添加量的增加，茜草的主峰逐渐下降而糊精的主峰逐渐升高的规律。利用此便可容易得知配方颗粒中所加添加剂辅料糊精的含量。当选用茜草的主峰为1598cm-1与糊精的主峰为1018cm-1的强度相对比为纵坐标对于不同茜草与糊精重量比为横坐标作图，用指数函数拟合出工作曲线，见图17，数据见下表。借助于该曲线便可判断颗粒配方中主辅料的含量。茜草百分含量与相对峰强度值权利要求1.中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)在中药配方颗粒粉末中加入溴化钾进行压片制样；(2)测定压片试样的中红外光谱，近红外光谱，漫反射近红外光谱、漫反射光谱，衰减全反射光谱；(3)求出并绘出上述相应红外光谱图的二阶导数谱；(4)测定压片试样的二维相关红外谱，产生它的是任何形式的扰动；(5)依次分级对比相应图谱，即可直接进行中药配方颗粒的非分离提取鉴定、鉴别；(6)测定中药配方颗粒中主料和辅料的相对含量。2.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于步骤(4)所述的二维相关红外谱可以是同步谱，或异步谱或两者兼用。3.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于步骤(4)所述的二维相关红外谱可以是各种形式的图象，优选为等强度图、鱼网图，多维立体图，彩色图中的任何一种或两种。4.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于步骤(4)所述的扰动形式为热、光、电、磁、机械力的扰动的其中之一。5.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于步骤(5)所述的分级对比可以是红外光谱、二阶导数谱和二维相关红外谱三种谱图单个进行对比，或者将其中任意两者结合在一起进行对比，或者将三者结合在一起相互进行对比。6.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于所述分级对比以步骤(2)所获得的红外光谱为一级对比、以步骤(3)所获得的二阶导数谱为二级对比、以步骤(4)所获得的二维相关红外谱为三级对比。7.根据权利要求1或5或6所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，所述分级对比中的一级红外光谱对比为(1)观察红外图谱总体形状或形貌，即峰位、峰强度、峰形的相似性来初步鉴别；(2)在1800～400cm-1区间内选取3～5个强谱峰簇，其峰位波动在±2cm-1之内，视为相同或相近，将谱峰簇中最强峰的强度大小依次排序，根据它们的排序和相对强度比来鉴别鉴定；(3)在1800～400cm-1区间内选取上述峰簇中3～5个次强谱峰，其峰位波动在±2cm-1之内，视为相同或相近为辅来鉴别。8.根据权利要求1或5或6所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，所述分级对比中的二级二阶导数谱对比为(1)观察导数谱总体形状或形貌，即峰位、峰强度、峰形的相似性来初步鉴别；(2)在1800～400cm-1区间内选取红外图谱中最强谱峰峰位就近处出现的导数峰视为相同或相近，其峰位波动在±2cm-1之内，并且比较各强峰之间的相对强度的大小和次序；(3)在1800～400cm-1区间内选取红外图谱中最强谱峰两侧是否出现相应的肩峰峰位来鉴别，该肩峰峰位波动在±2cm-1之内。9.根据权利要求1或5或6所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，所述分级对比中的三级二维相关红外谱对比是用二维相关谱进行对比来判断选取同步相关谱中的强峰或强峰簇的自动峰，对比它们的峰位及其强度，以及对比所选取的自动峰与其它自动峰之间的交叉峰的正负号的异同来鉴别它们的异同。10.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，步骤(6)所述的测定中药配方颗粒中主料和辅料的相对含量的方法为先将颗粒料与辅料按重量比配成系列试样；按上述步骤(1)和(2)作出红外谱图；取配方颗粒与辅料各自的特征峰的强度比为纵坐标，以颗粒料与辅料的重量比为横坐标作图；以指数函数或线形函数关系拟合成单值工作曲线，配方颗粒的含量由此工作曲线直接读出。11.根据权利要求1或10所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，所述的辅料具有一种或配比固定的两种以上成份的辅料。12.根据权利要求1所述的中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，其特征在于，粉末试样可直接测定近红外光谱，漫反射近红外光谱、漫反射光谱，衰减全反射光谱。全文摘要本发明涉及一种中药配方颗粒红外光谱非分离提取多级宏观指纹鉴定方法，属于中药检测
技术领域：
。该方法的步骤是在中药配方颗粒粉末中加入溴化钾进行压片制样；测定压片试样的中红外光谱、漫反射近红外、漫反射中红外光谱、反射光谱及衰减全反射光谱；求出并绘出相应光谱图的二阶导数光谱图；测定试样的二维相关红外谱；分级对比相应图谱；测定中药配方颗粒中主料和辅料的相对含量。本发明的方法无需对试样进行分离，即可无损地、快速地、不失原本性和配伍性地直接鉴定中药配方颗粒及其质量。此外该方法还可以同时获取药品稳定性和变质机理的信息，便于推广应用，从而可加速中药质量控制进程，大大加速中药现代化。文档编号G01N21/35GK1447109SQ0312293公开日2003年10月8日申请日期2003年4月26日优先权日2003年4月26日发明者孙素琴,周群,秦竹,陶家洵申请人:清华大学