专利名称：一种检测菜豆荚斑驳病毒的方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测菜豆荚斑驳病毒的方法及专用试剂盒。
背景技术：
菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)是我国进境植物检疫性有害生 物，分布于美国、加拿大、巴西、秘鲁、厄瓜多尔、伊朗等国。该病毒主要危害大豆、菜豆和豇 豆等植物，可造成产量损失和品质下降。对该病毒的检测主要有双抗体夹心ELISA，胶体金 免疫层析(GICA)，RT-PCR，实时荧光PCR(RTF-PCR)和生物芯片等方法。前两种方法的基本 原理是抗原和抗体的特异性反应，是用植物病毒的抗体来检测植物病毒外壳蛋白抗原。当 植株体内病毒浓度低到一定程度，超出血清学方法的检测灵敏度时，或者无某种病毒的抗 体，或病毒的抗体难以制备时，则无法建立这种检测。聚合酶链式反应技术(PCR)或RT-PCR方法，是对植物病毒目标核酸片段进行扩增 放大。普通PCR扩增后，需要进行电泳和溴化乙锭染色后，才能判断PCR产物的有无和片段 的大小，实验人员要接触致癌性物质溴化乙锭，处理不当易造成环境污染。RTF-PCR和生物芯片检测方法因对仪器和软件的要求高，检测试剂贵，检测费用 高，普通实验室难以承受，客观上也限制了这种方法的广泛使用。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测样品中是否含有待测物质的试剂盒。本发明所提供的用于检测样品中是否含有待测物质的试剂盒，包括胶体金层析 试纸、胶体金标记的抗体和扩增待测物质的特异引物；所述扩增待测物质的特异引物由两条引物组成，物质A修饰一条引物，物质B修饰 另一条引物；所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗所述物质A的抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有抗所述物质B的抗体；所述胶体金层析试 纸的质控位置包被有与所述抗物质A的抗体具有相互作用的抗体；所述物质A和物质B为如下3种中的一种且不相同生物素、荧光素和地高辛。上述试剂盒中，所述物质A为生物素，所述物质B为荧光素或地高辛；所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗生物素多克隆抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有抗荧光素的单克隆抗体或抗地高辛的单 克隆抗体。上述任一所述试剂盒中，所述物质A为生物素，所述物质B为荧光素或地高辛；所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有小鼠抗荧光素的单克隆抗体(Anti-FI单 克隆抗体)或小鼠抗地高辛的单克隆抗体(Anti-DI单克隆抗体)；所述胶体金层析试纸的质控位置包被有羊抗兔抗体。
上述任一所述试剂盒中，所述胶体金层析试纸由样品吸收垫、反应膜和吸水垫依 次连接而成；所述检测线位置或检测点位置位于所述反应膜上，所述质控线位置或质控点 位置位于所述反应膜上；所述检测线位置或检测点位置在所述质控线位置或质控点位置与 所述样品吸收垫之间。上述任一所述试剂盒中，所述样品吸收垫的材质是玻璃纤维素膜；所述反应膜的 材质是硝酸纤维素膜；所述吸水垫的材质是吸水纸。上述任一所述试剂盒中，所述待测物质为病毒；所述病毒为菜豆荚斑驳病毒 (Beanpod mottle virus)； 所述扩增菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)的特异引物中一条引物序 列为 5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，另一条引物序列为；5，-AGT GGA CCATGT GAG AAA C-3，。上述任一所述试剂盒中，所述扩增菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)的 特异引物为如下1)或2)所示1) 一条引物序列为 5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，在 5，端标记生物素； 另一条引物序列为；5’ -AGT GGA CCA TGT GAG AAA C_3’，在5’端标记荧光素；2) 一条引物序列为 5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，在 5，端标记生物素； 另一条引物序列为；5’ -AGT GGA CCA TGT GAG AAA C_3’，在5’端标记地高辛。本发明的另一个目的是提供一种检测样品中是否含有待测物质的方法。本发明所提供的检测样品中是否含有待测物质的方法，是用上述任一所述试剂盒 进行检测，根据检测结果判断待测样品中是否含有待测物质；所述根据检测结果判断待测样品中是否含有待测物质的方法为若所述胶体金层 析试纸的质控位置和检测位置均显色，则判定所述待测样品中含有待测物质；若所述胶体 金层析试纸的质控位置显色、但检测位置不显色，则判定所述待测样品中不含有待测物质。上述任一所述方法中，所述用上述任一所述试剂盒进行检测的方法包括如下步 骤1)用上述任一所述试剂盒中的引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产 物；2)将所述PCR扩增产物与上述任一所述试剂盒中的胶体金标记的抗体混合，记作 检测液；3)用上述任一所述试剂盒中的胶体金层析试纸对所述检测液进行检测。本发明将核酸扩增的高灵敏度和胶体金层析方法快速简便、直观的优点结合起 来，通过对PCR特异性引物进行修饰，再用胶体金标记特异性修饰物的抗体，最终实现对所 扩增的目标核酸片段的特异性检测，具有广泛的实用性。实验结果证明，本发明方法检测结 果准确可靠。本发明方法省时省力，操作简单。


图1为胶体金层析检测双链单扩增子(dsDNA)的原理示意图。图2为BPMV的RT-PCR电泳图。图3为BPMV的RT-PCR产物试纸条检测(层析膜为RP膜)。
图4为SP膜检测结果。图5为FP膜检测结果。图6为RP膜检测结果。
具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、试剂盒的组成及制备小鼠抗荧光素的单克隆抗体(Antti-FI单克隆抗体)购自Sigma-Aldrich公 司，产品目录号为F5636;小鼠抗地高辛的单克隆抗体(Anti-DI单克隆抗体)购自 Sigma-Aldrich公司，产品目录号为D8156 ；羊抗兔抗体购自北京欣经科生物技术有限公 司，产品目录号为A30608 ；兔抗生物素多克隆抗体购自北京欣经科生物技术有限公司，产品目录号为 A30622 ；一、试剂盒的组成(1)胶体金层析试纸；胶体金层析试纸由样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次连接而成；样品吸收垫与反 应膜重叠2mm，反应膜和吸水垫重叠2mm。所述反应膜上具有检测点和质控点；所述检测点距离样品吸收垫近，所述质控点 距离样品吸收垫远，即检测点位于质控点和样品吸收垫之间。检测点位置包被有Anti-FI单克隆抗体(或Anti-DI单克隆抗体)；质控点位置 包被有羊抗兔抗体；样品吸收垫的材质是玻璃纤维素膜；反应膜的材质是硝酸纤维素膜(NC膜)(NC膜 均是Whatman公司的，按流速不同分为RP层析膜，FP层析膜或SP层析膜)；吸水垫的材质 是吸水纸。(2)胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体；(3)特异扩增菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)的引物对BPMVf-BI 5，-BI-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，(5，端由生物素标记)；BPMVr-FI :5，-FI-AGTGGA CCA TGT GAG AAA C-3，(5，端由荧光素标记)；试剂盒中的引物对也可为如下引物对BPMVf-BI 5，-BI-ATA GTT CCA TTA GAGGGC GTG-3，(5，端由生物素标记)；BPMVr-DI :5，-DI_AGT GGA CCA TGT GAG AAAC-3，(5， 端由地高辛标记)。二、试剂盒的制备(一 )胶体金层析试纸的制备空白试纸条的制作在80X300mm (宽X长)双面胶塑料板25mm端内侧粘附25X300mm Whatman公司的 RP, FP或SP膜。在双面胶塑料板25mm端粘附20X300mm玻璃纤维素膜条带，并与RP，FP或 SP膜重叠2mm。在双面胶塑料板30mm端粘附25x300mm宽的吸水纸与RP，FP或SP膜重叠 2mm。用BioDot CM4000切条机切成4mm宽的空白试纸条。
T检测点(线)和C质控线点(线)的点样用切好的空白试纸条，针对不同的引 物修饰可在空白试纸条层析膜上靠近玻璃纤维素端点上1 μ L的Anti-FI (或Anti-DI)单 克隆抗体作为T检测点。在空白试纸条层析膜靠近吸水纸端点上1 μ L羊抗兔抗体作为C质控点。
( 二)胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体；20 30nm胶体金颗粒的制备取10g/L氯金酸水溶液0. 6mL,加30mL超纯水加 热煮沸。一次性快速加入10g/L柠檬酸钠水溶液0.9mL(37°C预温)，溶液由蓝逐渐变为紫 红色，煮沸3 5min，补水至原体积。冷却后，用0. 2mol/L碳酸钾调pH至7. 2 7. 5。用 0.22 um滤膜无菌注射器压滤。胶体金-抗体结合物的制备取兔抗生物素多克隆抗体400 μ g，在磁力搅拌下 缓慢加入上述制备的20 30nm颗粒的胶体金液20mL(抗体浓度为20 μ g/mL)，室温搅拌 30min。加入100g/L牛血清白蛋白(BSA)水溶液0. 8mL(终浓度为0. 4% )，室温搅拌5min。 加入100g/L的聚乙二醇(PEG20000)水溶液0. 4mL(终浓度为0. 2% )，室温搅拌5min，即得
到胶体金_抗体结合物。取小量进行检定，其余置4°C保存。实施例2、检测大豆病叶中是否含有菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)检测原理示意图如图1所示。—、从待测样品中扩增病毒的特异保守片段BI 生物素；FI 荧光素；DI 地高辛。普通引物=BPMVf:5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3'；BPMVr :5，-AGTGGA CCA TGT GAG AAA C-3，。修饰引物对1 =BPMVf-BI :5，-BI-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，；BPMVr-FI 5' -FI-AGT GGA CCA TGT GAG AAA C-3，。修饰引物对2 =BPMVf-BI :5，-BI-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，；BPMVr-DI 5’ -DI-AGT GGA CCA TGT GAG AAA C-3，。菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)(购自ATCC，编号为PV-934)摩擦接种 至大豆叶片上；大豆病叶中总RNA提取取0. Ig新鲜病叶，加液氮研细，加入ImL Trizol，混勻，倒入1.5mL离心管中。 12000r/min离心lOmin，将上清液倒入一个新的离心管中。加入0. 5mL三氯甲烷，猛烈振荡 15s, 4°C 12000r/min离心15min。小心吸取上层无色水相到新离心管中。加入等体积异丙 醇，混勻，室温静置10min，4°C 12000r/min离心lOmin，保留沉淀。加入ImL 75%冷乙醇，悬 浮沉淀，4°C 12000r/min离心lOmin。沉淀真空离心干燥。加入20 μ L DEPC水，溶解沉淀， 得到RNA溶液，存于-80°C备用。RT-PCR 反转录体系(10 μ L)DEPC 水3. 5 μ L5Xbuffer 2μ LdNTP 1 μ L
BPMVr 0. 5 μ LRNasin 0. 5 μ LRNA 2μ L反转录酶M-MLV 0. 5 μ L42°C 反转录 50min。
PCR 反应体系(25 μ L)DEPC 7jC 18. 2 μ LIOXbuffer 2. 5 μ LdNTP 1 μ L上游引物 0.5yL下游引物0.5yL反转录产物 2 μ LTaqgl 0. 3 μ L普通引物的PCR上下游引物用BPMVf，BPMVr。修饰引物的 PCR 上下游引物用BPMVf-BI，BPMVr-FI (或 BPMVr-DI)。PCR 程序94 "C 2min
94 0C 30 s
6 TC 30 s Γ" 30 cycles 72 °C 1 min -72 °C 5min取5 μ L PCR产物于1. 0%琼脂凝胶上135V电泳20min，EB染色，在凝胶成像仪上 观察并记录结果。扩增的片段预期大小为653bp。同时以未染任何病毒的大豆叶作为健康对照。用1对普通引物进行扩增、和用2对修饰引物扩增的结果如图2所示。用1对普 通引物和2对修饰的引物均能扩增出预期的653bp大小的PCR产物，健康对照则无相应的 条带。1 =Marker (TaKaRa DL2000) ；2 健康对照；3 普通PCR产物；4 =BI和FI修饰的PCR 产物；5 =BI和DI修饰的PCR产物。二、用胶体金层析试纸检测在小离心管中加入150μ L胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体，加入 50 μ L0. Olmol · IZ1pH 7. 2的PBS缓冲液，再分别加入5 μ L BI和FI修饰引物的PCR产物 (或5 μ L BI和DI修饰引物的PCR产物)，混合均勻。插入试纸条，计时15min。结果判断C点和T点都显色检测结果阳性；C点显色而T点不显色则检测结果阴 性。若C点不显色则结果不能判断。2对修饰的引物的PCR产物胶体金层析检测C和T都显色结果为阳性，而一对普 通引物PCR产物以及PBS缓冲液空白对照仅C显色而T不显色，结果为阴性(见图3)。1 PBS缓冲液对照；2 普通PCR产物；3 =FI和BI修饰的PCR产物；4 =DI和BI修饰的PCR产 物。
实施例3、不同流速的层析反应膜的检测结果采用Whatman公司不同流速的硝酸纤维素膜(SP，FP, RP膜)，对用BI和FI修饰 引物的PCR扩增产物的检测，SP膜最慢(毛细上升速度为160-220s/4cm)，FP膜(毛细上 升速度为110-150S/4cm)居中，RP膜(毛细上升速度为85-115s/4cm)流速最快。SP膜检测结果(见图4) ；FP膜检测结果(见图5) ；RP膜检测结果(见图6)。图 中，均是从左到右依次加入FI和BI修饰的PCR产物4 μ L，2 μ L，1 μ L。上端为C点；下端 为T点。使用这3种流速不同的层析膜检测，当PCR产物的量为4μ L，2y L时均可检测出 来，在 检测的PCR产物量为IyL时则没有显色。说明3种膜检测PCR产物的灵敏度无明显 差别，鉴于RP的流速较快，故可优先使用RP膜。
权利要求
一种用于检测样品中是否含有待测物质的试剂盒，包括胶体金层析试纸、胶体金标记的抗体和扩增待测物质的特异引物；所述扩增待测物质的特异引物由两条引物组成，物质A修饰一条引物，物质B修饰另一条引物，所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗所述物质A的抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有抗所述物质B的抗体；所述胶体金层析试纸的质控位置包被有与所述抗物质A的抗体具有相互作用的抗体；所述物质A和物质B为如下3种中的一种且不相同生物素、荧光素和地高辛。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述物质A为生物素，所述物质B为荧 光素或地高辛；所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的抗生物素多克隆抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有抗荧光素的单克隆抗体或抗地高辛的单克隆 抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述物质A为生物素，所述物质B 为荧光素或地高辛；所述胶体金标记的抗体为胶体金标记的兔抗生物素多克隆抗体；所述胶体金层析试纸的检测位置包被有小鼠抗荧光素的单克隆抗体或小鼠抗地高辛 的单克隆抗体；所述胶体金层析试纸的质控位置包被有羊抗兔抗体。
4.根据权利要求1或2或3所述的试剂盒，其特征在于所述胶体金层析试纸由样品 吸收垫、反应膜和吸水垫依次连接而成；所述检测位置位于所述反应膜上，所述质控位置位 于所述反应膜上；所述检测位置在所述质控位置与所述样品吸收垫之间。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述样品吸收垫的材质是玻 璃纤维素膜；所述反应膜的材质是硝酸纤维素膜；所述吸水垫的材质是吸水纸。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于所述待测物质为病毒；所述病 毒为菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)；扩增菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus)的特异引物中一条引物序列 为 5，-ATAGTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，另一条引物序列为5，-AGT GGA CCA TGT GAGAAAC-3，。
7.根据权利要求1-6中任一所述的试剂盒，其特征在于所述扩增菜豆荚斑驳病毒 (Bean pod mottle virus)的特异引物为如下1)或2)所示1)一条引物序列为5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，在5，端标记生物素；另一 条引物序列为5’ -AGT GGA CCA TGT GAG AAA C-3’，在5’端标记荧光素；2)一条引物序列为5，-ATA GTT CCA TTA GAG GGC GTG-3，，在5，端标记生物素；另一 条引物序列为:5，-AGT GGA CCA TGT GAG AAA C-3，，在5，端标记地高辛。
8.—种检测样品中是否含有待测物质的方法，是用权利要求1-7中任一所述试剂盒进 行检测，根据检测结果判断待测样品中是否含有待测物质；所述根据检测结果判断待测样品中是否含有待测物质的方法为若所述胶体金层析试 纸的质控位置和检测位置均显色，则判定所述待测样品中含有待测物质；若所述胶体金层析试纸的质控位置显色、但检测位置不显色，则判定所述待测样品中不含有待测物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述用权利要求1-7中任一所述试剂盒 进行检测的方法包括如下步骤1)用权利要求1-7中任一所述试剂盒中的特异引物对待测样品进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物；2)将所述PCR扩增产物与权利要求1-7中任一所述试剂盒中的胶体金标记的抗体混 合，记作检测液；3)用权利要求1-7中任一所述试剂盒中的胶体金层析试纸对所述检测液进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测菜豆荚斑驳病毒的方法及专用试剂盒。该试剂盒包括胶体金层析试纸、胶体金标记的抗体和扩增待测物质的特异引物。本发明将核酸扩增的高灵敏度和胶体金层析方法快速简便、直观的优点结合起来，通过对PCR特异性引物进行修饰，再用胶体金标记特异性修饰物的抗体，最终实现对所扩增的目标核酸片段的特异性检测，具有广泛的实用性。实验结果证明，本发明方法检测结果准确可靠。本发明方法省时省力，操作简单。
文档编号G01N33/558GK101865921SQ20101020450
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月11日 优先权日2010年6月11日
发明者张永江, 李桂芬, 魏梅生 申请人:中国检验检疫科学研究院