专利名称：一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法
技术领域：
本发明涉及食用菌种的技术领域，具体地说是是一种系统、简便与高效的斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，包括所需原料、配方、灭菌、接种、培养、光谱分析、整合定量评价这一系列过程。
背景技术：
菌种质量是食用菌产业发展的根本。然而，随着我国食用菌产业的持续发展，菌种质量问题日益突出，渐已成为阻碍我国食用菌产业发展的瓶颈之一。近年来，我国食用菌菌种质量监管体系与质量控制体系建设不断完善，为规范食用菌菌种选育、生产、经营与管理等工作提供了日渐有力的制度保障。然而，相应科研工作依然较为薄弱，基础与应用研究尚难以满足行业发展要求，从而使得菌种质量评价缺乏系统的技术支撑。因此，开发科学、规范、有效的食用菌菌种质量评价方法，是我国食用菌业持续健康发展的必然要求。斑玉蕈肉厚质嫩，味纯鲜香，具颇高的食用价值。同时，斑玉蕈富含17种氨基酸， 尤以赖氨酸及精氨酸含量最高，对婴幼儿童以至青少年的智力发育均具一定的促进作用。 此外，斑玉蕈亦含有多酚类、多糖类物质，具有清除人体内自由基、提高人体免疫力等功效。斑玉蕈是已经实现工厂化生产的主要食用菌之一，是我国能够实现工业化生产的重要食用菌之一，2008年产量已达10585t，在工业化生产的食用菌中产量仅次于金针菇与杏鲍菇。然而，其生育周期约为105d，较金针菇与杏鲍菇分别延长65d与45d。因此，对系统、简便、有效的斑玉蕈菌种质量评价方法的需求愈显迫切。目前，对于菌种质量的评价，以结实性试验方法最具说服力，然而此方法存在周期长、易受环境因素与人为因素影响等缺点。对广大斑玉蕈生产企业及个体经营者而言，时间即是效益，时间即是竞争力。因此，以实践生产角度衡量，此法存有颇大局限性。近年来，同工酶、RAPD、RFLP等分子生物学技术在食用菌科研领域中得到逐步应用，然而，上述方法在评价的准确性、经济性、可操作性、尤其是可预判性等方面依然不尽理想。因此，亟需构建一种系统、简便、有效的斑玉蕈菌种质量评价方法，通过评价斑玉蕈菌种质量的预判性指标，来评价斑玉蕈菌种质量。

发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，即系统、简便、有效的斑玉蕈菌种质量优劣的监测方法，它可克服既有方法准确性、经济性、可操作性较差等一些不足。为了实现上述目的，本发明的技术方案是一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法， 其特征在于所述的评价方法包括如下步骤a、采集菌种菌丝体；b、取去皮马铃薯200g，煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述马铃薯溶液中加入营养原料形成培养基质，培养基质的pH为7. 0 ；C、在实验瓶中放入60-80mL的评价用培养基质，再接种0. 8-1. 5cm2菌种菌丝体，于25°C温度条件下进行液体培养；d、培养7-8d或静置培养14-16d后提取培养液，然后进行可见光谱分析，获取脱色率的数值；e、对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选。使用时本发明方法的使菌种质量评价结果同单瓶产量、有效子实体数与单个子实体重量等产量性状间相关性达极显著水平，同试管栽培培养基中菌丝生长速度相关性达一般显著水平，可用于对上述指标的单独评价。同时，以上述各评价指标为组成部分，首次通过此评价方法对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，实现了对斑玉蕈菌种质量的系统、简便与高效评价。此外，此评价方法为其它食用菌菌种质量的评价提供了有力的参考。


图1为本发明的评价方法步骤流程图
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。本发明所述的评价方法包括如下步骤a、采集菌种菌丝体；b、取去皮马铃薯 200g,煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述马铃薯溶液中加入营养原料形成培养基质，培养基质的pH为7. 0 ；C、在实验瓶中放入60-80mL的评价用培养基质，再接种0. 8-1. 5cm2菌种菌丝体，于25°C温度条件下进行液体培养；d、培养7-8d或静置培养14-16d后提取培养液，然后进行可见光谱分析，获取脱色率的数值；e、对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价， 安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选。a步骤中，待评价的菌种菌丝体采用商业化生产条件下的各级菌种菌丝体、菌种选育条件下的出发菌株或各衍生菌株菌丝体，或者组织分离获得的斑玉蕈菌种纯培养物。b步骤中，每升马铃薯溶液中加入下列营养原料 20. 0 克乳糖、2. 0 克 ΝΗ4Ν03、0· 5 克 MgSO4 ·7Η20、1· 5 克 KH2PO4 和 0. 06 克溴百里酚兰(BTB)， 充分混合后形成培养基质。c步骤中，培养基质在121 °C、150KPa条件下高压灭菌后，待瓶体完全冷却，在容量为IOOmL的三角实验瓶内加入60-80mL评价用培养基质，将a步骤中采取的待评价的菌种菌丝体置于勻浆器中，勻浆30s后取1. Ocm2菌种菌丝体接种入三角实验瓶内，进行液体培养。d步骤中，提取培养液500 μ 1，置于Eppendorf centrifuge 5810R离心机中离心(5000rpm，4°C，15min)，移取 2. 0μ 1 上清液，滴注于 NanoDrop 10003. 6. 0 光谱分析系统中，全波段扫描分析后，由系统自动采集615nm处吸收峰值数据，并导入脱色率 (Decolorization Ratio) ^M-Tj ^ :DR= [I" (A615 of strain/A615 of blank) ] X 100 (DR L^l 百分数表示)，获得脱色率数值。e步骤中，将脱色率(DR)值导入脱色率与菌种质量加权关联系数拟合方程Ydk =-221. 26X2+490. 75X-210. 75，以数值的形式对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，并安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选，加权关联系数值越趋近1，指示菌种质量越好；当数值小于0.9时，即应慎用或弃用；越趋近0，指示菌种质量越差。观察液体培养基颜色的变化黄色一黄绿一绿色一蓝绿一蓝色，为菌种质量由优至劣，将显色反应对应数值导入显色反应与菌种质量加权关联系数拟合方程Yai = 7. 7379X-1. 7118，即可对斑玉蕈菌种质量进行评价，并安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选，加权关联系数值越趋近5，指示菌种质量越好；当数值小于5时，即应慎用或弃用；数值越趋近1，指示菌种质量越差。 需要强调的是，在进行斑玉蕈菌种质量评价过程中，DR值评价适用于条件较好，对评价结果要求较高的菌种生产部门或大中型斑玉蕈工业化生产企业；而显色反应评价较适于条件相对有限，对评价结果要求相对较低的斑玉蕈菌种或商业化生产单位或个人。
实施例本发明首先针对待评价菌种建立基准参数，测定培养液显色反应与吸光度值；以上述参数为基准，对待评价菌种进行整合定量评价。本发明实施例依照以下四步进行。1.待评价菌种待评价斑玉蕈菌株见表1，以此为基础构建斑玉蕈菌种质量整合定量评价标准体系。表1供试真姬菇菌株
权利要求
1.一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于所述的评价方法包括如下步骤a、采集菌种菌丝体；b、取去皮马铃薯200g，煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述马铃薯溶液中加入营养原料形成培养基质，培养基质的pH为7. 0 ；C、在实验瓶中放入60-80mL 的评价用培养基质，再接种0. 8-1. 5cm2菌种菌丝体，于25°C温度条件下进行液体培养；d、 培养7-8d或静置培养14-16d后提取培养液，然后进行可见光谱分析，获取脱色率的数值； e、对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选。
2.根据权利要求1所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于a步骤中，待评价的菌种菌丝体采用商业化生产条件下的各级菌种菌丝体、菌种选育条件下的出发菌株或各衍生菌株菌丝体，或者组织分离获得的斑玉蕈菌种纯培养物。
3.根据权利要求1所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于b步骤中，每升马铃薯溶液中加入下列营养原料20. 0克乳糖、2. 0克ΝΗ4Ν03、0. 5克MgSO4 · 7H20、 1. 5克KH2PO4和0. 06克溴百里酚兰(BTB)，充分混合后形成培养基质。
4.根据权利要求1所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于c步骤中，培养基质在121°C、150Iffa条件下高压灭菌后，待瓶体完全冷却，在容量为IOOmL的三角实验瓶内加入60-80mL评价用培养基质，将a步骤中采取的待评价的菌种菌丝体置于勻浆器中，勻浆30s后取0. 8-1. 5cm2菌种菌丝体接种入三角实验瓶内，进行液体培养。
5.根据权利要求1所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于d步骤中，提取培养液 500 μ 1，置于 Eppendorf centrifuge5810R 离心机中离心(5000rpm，4°C， 15min)，移取2. 0 μ 1上清液，滴注于NanoDrop 10003. 6. 0光谱分析系统中，全波段扫描分析后，由系统自动采集615nm处吸收峰值数据，并导入脱色率(DecolorizationRatio)换算方程DR= [1-(A615 of strain/A615 of blank) ] X 100 (DR 以百分数表示)，获得脱色率数值。
6.根据权利要求1所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于e步骤中，将脱色率(DR)值导入脱色率与菌种质量加权关联系数拟合方程^ik =-221. 26X2+490. 75X-210. 75，以数值的形式对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，并安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选，加权关联系数值越趋近1，指示菌种质量越好；当数值小于0.9时，即应慎用或弃用；越趋近0，指示菌种质量越差。7、根据权利要求1 所述的一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，其特征在于:e步骤中，观察液体培养基颜色的变化黄色一黄绿一绿色一蓝绿一蓝色，为菌种质量由优至劣，将显色反应对应数值导入显色反应与菌种质量加权关联系数拟合方程Yai = 7. 7379X-1. 7118，即可对斑玉蕈菌种质量进行评价，并安照评价结果对菌种菌丝体进行质量优劣的筛选，加权关联系数值越趋近 5，指示菌种质量越好；当数值小于5时，即应慎用或弃用；数值越趋近1，指示菌种质量越差。
全文摘要
本发明公开了一种斑玉蕈菌种质量优劣的检测方法，它可克服既有食用菌菌种质量评价方法所难以克服的系统性、简便性与高效性等问题。本发明使评价结果同单瓶产量、有效子实体数与单个子实体重量等产量性状间相关性达极显著水平，同试管栽培培养基中菌丝生长速度相关性达一般显著水平，就此可通过此法对上述菌种质量评价指标进行单独评价。同时，以上述各评价指标为组成部分，首次通过此评价方法对斑玉蕈菌种质量进行整合定量评价，实现了对斑玉蕈菌种质量的系统、简便与高效评价。此外，此评价方法为其它食用菌菌种质量的整合定量评价提供了有力参考。
文档编号G01N21/25GK102405762SQ201010292360
公开日2012年4月11日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者冯志勇, 刘洋, 汪虹, 陈明杰, 陈辉 申请人:上海市农业科学院