专利名称：鱼类染色体荧光原位杂交方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，特别是一种灵敏度高、特异性强、 定位准确，有利于分析多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍体还是 异源多倍体的鱼类染色体荧光原位杂交方法。
背景技术：
在水产动物中，自然多倍体现象比较普遍。在中国已报道的淡水鱼类核型中有多 种鱼发现了多倍体类型。多倍体鱼类因其生长优势、群体产量及抗病力等各方面都具有二 倍体鱼所无法比拟的优势，因此，许多多倍体种类已成为重要的经济鱼类或重要的养殖对 象。目前，关于鱼类染色体数目和核型的研究已有相应文献报道，如我国常见的泥鳅，李渝 成(1987)和印杰(2005)等根据染色体的基本形态学特征对泥鳅染色体中期分裂相进行核 型分析，二倍体泥鳅2n = 50，核型公式8m+6sm+36t，NF = 64 ；四倍体泥鳅4n = 100，核型 公式16m+12sm+72t，NF = 128，类似的研究在我国广布的鲤科宽鳍魚|和鳢科的月鳢(李渝 成1985)等，均有所报道。但由于缺少足够的遗传学证据，染色体核型分析通常只能以二倍 体的形式排列，即不能分析出多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍 体还是异源多倍体。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子 细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的 一种非放射性分子细胞遗传技术。FISH技术弥补了经典原位杂交和染色体带型技术的不 足，可以在分子水平上进行细胞遗传学分析。它具有灵敏度高、特异性强、定位准确等优点， 广泛应用于基因诊断、基因组作图和基因定位、核组成、染色体机构与功能、染色体进化、染 色体鉴别等多个方面，已经成为分子细胞遗传学发展最快的领域。FISH技术在人类及哺乳 动物中已成功运用，但在鱼类遗传学研究中的应用还不够深入广泛，应用报道很少，如戢福 云等人(2003)应用FISH技术证明黄鳝中存在Hsl基因；易梅生等人(2002)应用FISH技 术将人类Y染色体长臂异染色质区与鱼类基因组进行比较。迄今为止，关于FISH技术在鱼 类多倍体方面的应用未见报道。

发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种灵敏度高、特异性 强、定位准确，有利于分析多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍体 还是异源多倍体的鱼类染色体荧光原位杂交方法。本发明的技术解决方案是一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，其特征在于依次 按如下步骤进行a.制备染色体分散良好的染色体玻片标本，-80°C保存；b.将染色体玻片标本于65°C恒温干燥2小时，在4XSSC溶液中浸泡5min，取 0. 5mg/ml的RNase溶液100 μ L至染色体玻片标本上，用封口膜盖上载玻片，放入底部放有2 X SSC溶液的湿盒中37°C，30min ；然后揭掉封口膜，将染色体玻片标本放入4X SSC溶液中 浸泡5min，再转入装有卡诺固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2 X SSC溶液是 DDff与20 X SSC溶液体积比为9 1的混合液，所述4 X SSC溶液是DDW与20 X SSC溶液体 积比为41的混合液；c.以人的5. 8S+28SrDNA为探针，用Biotin-16_dUTP标记该探针，探针标记混 合液涡流振荡混合轻离心后，15°C水浴120min，65°C IOmin,室温放置IOmin后4°C冷藏； 纯化混合液与探针标记混合液按体积比为70. 5 20混合，-80°C静置20min，室温静置 IOmin, 4°C 15000rpm离心15min，加入150 μ L70%酒精轻离心，去掉上清液室温干燥5min， 加入去离子甲酰胺20yL，得纯化后的探针混合液冷藏备用；所述探针标记混合液组成为 0. 4mol/ml dATP2μ L，0. 4mol/ml dGTP2μ L，0. 4mol/ml dCTP 2 μ L，10Xbuffer 2μ L, Imol/ml Biotin-16-dUTP 1 μ L，100 μ g/ml 人的 5. 8S+28S rDNA 探针 1 μ L，灭菌蒸溜水 6. 5 μ L，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3. 5 μ L ；所述纯化混合液是鲑鱼精子DNA和E. coli 体积比为1 1的混合液2 μ l、4mol/ml的醋酸铵2. 5 μ L及100%酒精66 μ L的混合液；d.将c步骤冷藏备用的纯化后的探针混合液在75°C的水浴锅中lOmin，迅速置于 冰盒中冷却IOmin ；e.将b步骤所得染色体玻片标本放入含70%甲酰胺/2XSSC溶液中，于70°C水 浴2min，迅速移入-20°C预冷70%酒精的染色缸内lOmin，再移入100%的_20°C预冷酒精 内5min，空气干燥；f.将杂交混合液加入到经d步骤处理的纯化后的探针混合液中，体积比5 12， 涡流振荡混合轻离心，37°C恒温培养箱内预杂交30min后，再将其滴在染色体玻片标本 上，盖上封口膜，放在2XSSC溶液湿盒中，37°C恒温培养箱内至少18h ；所述杂交混合液是 20mg/ml的BSA、20XSSC溶液、灭菌蒸馏水及50%硫酸葡聚糖的体积比为1 1 1 2 的混合液；g.揭掉封口膜洗脱，洗脱过程为经50%甲酰胺/2XSSC溶液中42°C水浴锅中 20min — 2 X SSC溶液室温20min — 1 X SSC溶液室温20min — 4 X SSC溶液室温5min ；所述 1 X SSC是DDW与20 X SSC体积比为19 1的混合液；h.取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内 滴入ΙΟΟμ LlOy g/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2 X SSC溶液湿盒中，37°C恒温培 养箱避光lh，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0. 1% Triton/4XSSC 溶液20min — 4XSSC溶液5min — 4XSSC溶液5min ；取出染色体玻片标本用吸水纸将没 有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100 μ LlOy g/ml信号放大混合液，盖上封口 膜，放在2XSSC溶液湿盒中，37°C恒温培养箱避光培育lh，揭掉封口膜，在水平往复摇床上 按以下过程避光洗脱0. 1% Triton/4XSSC溶液20min — 4XSSC溶液5min — 4XSSC溶 液5min ；再取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴 入100 μ LlO μ g/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2 X SSC溶液湿盒中，37°C恒温培养 箱避光lh，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0. 1% Trit0n/4XSSC溶 液20min — 4XSSC溶液5min — 4XSSC溶液5min ；所述10 μ g/ml检测试剂混合液是用
BSA/4XSSC配置的含10 μ g/ml的avidin-FITC溶液，所述信号放大混合液是用 BSA/4XSSC 配置的含 10 μ g/ml 的 biotin/anti-avidin 溶液；
i.把染色体玻片标本放在2 X SSC溶液中清洗5min，用吸水纸吸去染色体玻片标 本表面多余的2 X SSC溶液，在有染色体处滴入50 μ L2. 5 μ g/ml的DAPI荧光染液，盖上盖 玻片并封片，平放在载玻片夹中4°C冷藏；所述DAPI荧光染液是母液、缓冲液和DABCO体积 比为1 5 15的混合液，所述母液是将IOmgDAPI溶在IOOOml的蒸馏水中，所述缓冲液 的组成为0. 12414gTris、0. 37225g EDTA_2Na 及 0. 5844gNaCl 溶于 IOOml 蒸溜水中。本发明在获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本的基础上，应用荧光 原位杂交技术(FISH)，以Biotin-16-dUTP为标记物，用切口平移法标记探针，杂交信号经 过两级放大，将人的5. 8S+28SrDNA探针清晰地定位在多倍体鱼类的染色体核仁组织区域 (NOR)。可通过观察核糖体5. 8S+28SrDNA在多倍体鱼类的染色体定位来比较分析多倍体的 染色体倍性及核型，即分析多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍体 还是异源多倍体，为揭示鱼类的多倍体起源和进化提供了分子细胞遗传学方面的证据，同 时为更好地开发和利用鱼类多倍体提供了新的途径和方法。


图1为本发明实施例1 二倍体泥鳅染色体中期相(DAPI复染)效果图。图2为本发明实施例1 二倍体泥鳅染色体中期相的荧光原位杂交效果图。图3是本发明实施例2四倍体泥鳅染色体中期相(DAPI复染)效果图。图4为本发明实施例2四倍体泥鳅染色体中期相的荧光原位杂交效果图。
具体实施例方式实施例1 a.染色体玻片标本的制备运用红细胞核体积测量或流式细胞仪等方法对收集的泥鳅进行倍性检测，筛选自 然二倍体，按照现有技术的方法，以活体鳃组织为材料，空气干燥法制备自然二倍体的染色 体玻片标本，在相差显微镜下观察，选择图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本放 在-80°C冰箱中保存。b.染色体玻片标本的前处理1)将-80 V保存的染色体玻片标本取出，放入65°C恒温箱2小时干燥；2)将干燥后的染色体玻片标本放入4XSSC溶液中浸泡5min，用移液枪吸取取 0. 5mg/ml的RNase溶液100 μ L至染色体玻片标本上，用封口膜盖上载玻片，将载玻片放入 底部放有2 X SSC溶液的湿盒中37°C，30min。每两个载玻片一组进行操作；3)用尖细镊子小心地移去封口膜，立即将玻片放入4XSSC溶液浸泡5min，再转入 装有卡诺固定液的染色缸中浸泡5min后拿出晾干。所用2 X SSC溶液是DDW与20 X SSC溶液体积比为9 1的混合液，所述4 X SSC 溶液是DDW与20 X SSC溶液体积比为4 1的混合液，所述20 X SSC溶液(柠檬酸钠缓冲 液)是 175. 3g NaCl,88. 2gNa3C6H507 · 2H20 和 IOOOmlDDff 的混合液。c探针标记和纯化以人的5. 8S+28SrDNA为探针，用Biotin-16_dUTP标记该探针，探针标记混合液涡 流振荡混合轻离心后，15°C水浴120min，65°C lOmin，室温放置IOmin后4°C冷藏；纯化混合
6液与探针标记混合液按体积比为70. 5 20混合(如70. 5μ L 20 μ L)，_80°C静置20min， 室温静置10min，4°C 15000rpm离心15min，加入150 μ L70%酒精轻离心，去掉上清液室温 干燥5min，加入去离子甲酰胺20 μ L，得纯化后的探针混合液冷藏备用；所述探针标记混合 液组成为0· 4mol/mldATP2y L，0. 4mol/ml dGTP2 μ L，0. 4mol/ml dCTP 2 μ L, IOXbuffer 2 μ L，lmol/mlBiotin-16-dUTP 1 μ L, 100 μ g/ml 人的 5. 8S+28S rDNA 探针 1 μ L,灭菌蒸馏 水6. 5 μ L，DNA聚合酶I和DNA酶混合液(瑞士 Roche公司)3. 5 μ L ；所述纯化混合液是鲑 鱼精子DNA和Ε. coli体积比为1 1的混合液(瑞士 Roche公司)2 μ l、4mol/ml的醋酸 铵2. 5 μ L及100%酒精66 μ L的混合液；d.探针变性将步骤冷藏备用的探针混合液在75°C的水浴锅中变性lOmin，迅速置于冰盒中冷 去P IOmin0e.染色体变性1)将b步骤所得染色体玻片标本放入含70%甲酰胺/2XSSC溶液中，于70°C水浴 变性2min，每两个载玻片一组进行操作；2)迅速移入_20°C预冷70%酒精的染色缸内IOmin脱水，再移入100%的_20°C预 冷酒精内5min ；3)空气干燥。f.杂交1)准备杂交混合液(每张载玻片40 μ L) :20mg/ml的BSA 1份，20 X SSC 1份，灭 菌蒸馏水1份，50%硫酸葡聚糖2份保存于冰上；2)将杂交混合液加入到变性后的探针混合液中(体积比5 12)，涡流振荡混合 轻离心，37°C温润培养箱内预杂交30min ；3)在每个己变性和脱水之后的染色体玻片标本上加40 μ L加入探针的杂交混合 液，盖上封口膜，避免有气泡；4)将加了探针的染色体玻片标本放在2XSSC溶液湿盒中，37°C温润培养箱(预热 至37°C )内保育至少18h。g.杂交后的洗脱小心揭掉封口膜，经以下液体(染色缸中盛装)洗脱50%甲酰胺/2XSSC中42°C 水浴锅中20min — 2 X SSC溶液室温20min — 1 X SSC溶液室温20min — 4 X SSC溶液室温 5min,洗脱过程中多次上下移动玻片，充分洗净，所述1 X SSC是DDW与20 X SSC体积比为 19 1的混合液。h.杂交信号的放大1)取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴 入100μ LlOy g/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2 X SSC溶液湿盒中，37°C温润培养 箱(预热至37 °C)避光温育Ih;2)小心揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0. 1 % Triton/4X SSC 溶液 20min — 4XSSC 溶液 5min —换成新的(干净的)4XSSC 溶液 5min ；3)取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴 入100μ LlOy g/ml信号放大混合液，盖上封口膜，放在2 X SSC溶液湿盒中，37°C温润培养
7箱(预热至37 °C )避光温育Ih ；4)小心揭掉封口膜，在水平往复摇床上经以下过程避光洗脱0. 1 % Triton/4X SSC 溶液 20min — 4XSSC 溶液 5min —换成新的(干净的)4XSSC 溶液 5min ；5)再次加入检测试剂混合液并洗脱，同上述1)和2)。所述10 μ g/ml检测试剂混合液是用1 % BSA/4 X SSC配置的含10 μ g/ml的 avidin-FITC溶液，所述信号放大混合液是用1 % BSA/4 X SSC配置的含10 μ g/ml的 biotin/anti-avidin 溶液。i.复染和封片1)把杂交后的染色体玻片标本放在2XSSC溶液中清洗5min ；2)用吸水纸吸去标本玻片表面多余的2XSSC溶液，在有染色体处滴入 50 μ L2. 5 μ g/ml的DAPI荧光染液，盖上盖玻片，指甲油封片，平放在载玻片夹中4°C冷 藏；所述DAPI荧光染液是母液、缓冲液和DABCO体积比为1 5 15的混合液，所述母液 是将IOmgDAPI溶在IOOOml的蒸馏水中，所述缓冲液的组成为0. 12414gTris、0. 37225g EDTA-2Na 及 0. 5844g NaCl 溶于 IOOml 蒸溜水中。信号检测观察实施例1所述的荧光原位杂交鱼类染色体需在冷藏3 7天内观察，用 Olympus AH2荧光显微镜观察杂交信号(观察波长DAPI 330 400nm，FITC 350 490nm)，Spot Cooled CCD装置捕获图像，利用Spot和Photoshop软件进行图像处理。中期相(DAPI复染)效果图及中期相的荧光原位杂交效果图分别如图1(A)、图 2(B)所示。染色体用DAPI复染色，呈现蓝色；箭头示杂交信号位点(绿色)；标尺示为 10 μ m。实施例2 与实施例1所不同的是染色体玻片标本的制备运用红细胞核体积测量或流式细 胞仪等方法对收集的泥鳅进行倍性检测，筛选自然四倍体，按照现有技术的方法，以活体鳃 组织为材料，空气干燥法制备自然四倍体的染色体玻片标本，在相差显微镜下观察，选择图 像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本放在-80 V冰箱中保存。其他步骤及信号观察均同实施例1。中期相(DAPI复染)效果图及中期相的荧光原位杂交效果图分别如图3(C)、图 4(D)所示。染色体用DAPI复染色，呈现蓝色；箭头示杂交信号位点(绿色)；标尺示为 10 μ m。
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权利要求
一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，其特征在于依次按如下步骤进行a.制备染色体分散良好的染色体玻片标本， 80℃保存；b.将染色体玻片标本于65℃恒温干燥2小时，在4×SSC溶液中浸泡5min，取0.5mg/ml的RNase溶液100μL至染色体玻片标本上，用封口膜盖上载玻片，放入底部放有2×SSC溶液的湿盒中37℃，30min；然后揭掉封口膜，将染色体玻片标本放入4×SSC溶液中浸泡5min，再转入装有卡诺固定液的染色缸中浸泡5min后取出、晾干；所述2×SSC溶液是DDW与20×SSC溶液体积比为9∶1的混合液，所述4×SSC溶液是DDW与20×SSC溶液体积比为4∶1的混合液；c.以人的5.8S+28SrDNA为探针，用Biotin 16 dUTP标记该探针，探针标记混合液涡流振荡混合轻离心后，15℃水浴120min，65℃10min，室温放置10min后4℃冷藏；加入纯化混合液，纯化混合液与探针标记混合液的体积比为70.5∶20， 80℃静置20min，室温静置10min，4℃15000rpm离心15min，加入150μL70％酒精轻离心，去掉上清液室温干燥5min，加入去离子甲酰胺20μL，得纯化后的探针混合液冷藏备用；所述探针标记混合液组成为0.4mol/ml dATP2μL，0.4mol/ml dGTP2μL，0.4mol/ml dCTP 2μL，10×buffer 2μL，1mol/mlBiotin 16 dUTP 1μL，100μg/ml人的5.8S+28S rDNA探针1μL，灭菌蒸馏水6.5μL，DNA聚合酶I和DNA酶混合液3.5μL；所述纯化混合液是鲑鱼精子DNA和E.coli体积比为1∶1的混合液2μl、4mol/ml的醋酸铵2.5μL及100％酒精66μL的混合液；d.将c步骤冷藏备用的纯化后的探针混合液在75℃的水浴锅中10min，迅速置于冰盒中冷却10min；e.将b步骤所得染色体玻片标本放入含70％甲酰胺/2×SSC溶液中，于70℃水浴2min，迅速移入 20℃预冷70％酒精的染色缸内10min，再移入100％的 20℃预冷酒精内5min，空气干燥；f.将杂交混合液加入到经d步骤处理的纯化后的探针混合液中，体积比5∶12，涡流振荡混合轻离心，37℃恒温培养箱内预杂交30min后，再将其滴在染色体玻片标本上，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱内至少18h；所述杂交混合液是20mg/ml的BSA、20×SSC溶液、灭菌蒸馏水及50％硫酸葡聚糖的体积比为1∶1∶1∶2的混合液；g.揭掉封口膜洗脱，洗脱过程为经50％甲酰胺/2×SSC溶液中42℃水浴锅中20min→2×SSC溶液室温20min→1×SSC溶液室温20min→4×SSC溶液室温5min；所述1×SSC是DDW与20×SSC体积比为19∶1的混合液；h.取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml信号放大混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光培育1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；再取出染色体玻片标本用吸水纸将没有染色体的部分擦干，在有染色体范围内滴入100μL10μg/ml检测试剂混合液，盖上封口膜，放在2×SSC溶液湿盒中，37℃恒温培养箱避光1h，揭掉封口膜，在水平往复摇床上按以下过程避光洗脱0.1％Triton/4×SSC溶液20min→4×SSC溶液5min→4×SSC溶液5min；所述10μg/ml检测试剂混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的avidin FITC溶液，所述信号放大混合液是用1％BSA/4×SSC配置的含10μg/ml的biotin/anti avidin溶液；i.把染色体玻片标本放在2×SSC溶液中清洗5min，用吸水纸吸去染色体玻片标本表面多余的2×SSC溶液，在有染色体处滴入50μL2.5μg/ml的DAPI荧光染液，盖上盖玻片并封片，平放在载玻片夹中4℃冷藏；所述DAPI荧光染液是母液、缓冲液和DABCO体积比为1∶5∶15的混合液，所述母液是将10mgDAPI溶在1000ml的蒸馏水中，所述缓冲液的组成为0.12414gTris、0.37225g EDTA 2Na及0.5844gNaCl溶于100ml蒸馏水中。
全文摘要
本发明公开一种鱼类染色体荧光原位杂交方法，是在获得图像清晰、染色体分散良好的中期分裂相标本的基础上，应用荧光原位杂交技术(FISH)，以Biotin-16-dUTP为标记物，用切口平移法标记探针，杂交信号经过两级放大，将人的5.8S+28SrDNA探针清晰地定位在多倍体鱼类的染色体核仁组织区域(NOR)。可通过观察核糖体5.8S+28SrDNA在多倍体鱼类的染色体定位来比较分析多倍体的染色体倍性及核型，即分析多倍体鱼类是遗传多倍体，还是进化多倍体，以及是同源多倍体还是异源多倍体。
文档编号G01N21/64GK101974622SQ20101029372
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者于卓, 张东升, 张明昭, 李雅娟, 钱聪, 魏杰 申请人:大连海洋大学