专利名称：Vi糖分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及糖分析领域。
背景技术：
包含与载体蛋白偶联的荚膜糖抗原的免疫原在本领域中众所周知。偶联将不依赖 T的抗原转化为依赖T的抗原，由此增强记忆应答，形成保护性免疫力，原型偶联疫苗用于 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)B型(Hib)[例如参见参考文献1第14章]。自 Hib疫苗以来，已开发了用于保护免受脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(脑膜 炎球菌)和肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)感染的偶联糖疫苗。含 有伤寒沙门菌(Salmonella typhi)(现称为肠道沙门菌(Salmonella enterica)伤寒血清 型(serovar))荚膜多糖Vi的疫苗也已在临床试验中显示能产生免受伤寒感染的保护作用 [2，3]，也已制备出偶联疫苗(例如[4])。在糖包含于疫苗和其它生物产品中时，管理当局通常要求对其进行鉴定。然而，Vi 无法通过常规的比色法定量，包含偶联或未偶联Vi的疫苗的标准化由于缺乏定量Vi的方 法而受到阻碍[5]。测定氨基糖或糖醛酸的比色法不适用于Vi的测定，因为其聚氨基己糖 醛酸结构耐受酸水解，且氨基糖醛酸部分在咔唑检测中不形成发色团。已报道了基于干燥样品的傅里叶变换红外光谱学和吖啶橙分光光度滴定的Vi定 量检测[5]，其具有采用带电导检测(CD)的高效阴离子交换色谱(HPAEC)获得Vi中0-乙 酰基与N-乙酰基的摩尔比的方法[6]。类似地，已报道了鉴定和测定Vi的0-乙酰基含量 的NMR检测[7]。本发明的目的在于提供定量样品中Vi糖的其它改善的方法和系统。

发明内容
本发明提供定量Vi糖及其偶联物的两种简单精确的方法，其可检测到浓度非常 低(小于或等于5yg/ml，包括低达lyg/ml)的Vi。第一种，可将去-0-乙酰化Vi糖的质 子NMR光谱与内标进行比较以确定样品中的Vi糖浓度。已报道了向NMR样品中加入已知 量的参比化合物以确定糖含量[8]。然而，本发明方法将参比化合物用作去-0-乙酰化Vi 糖的NMR检测内标是新的做法。第二种，可将液相色谱用于水解和去乙酰化的Vi糖以确定 其在样品中的浓度。该方法是对现有技术如以上提到的吖啶橙方法的改进，因为其可定量 含蛋白质、试剂和其它污染物的样品中的Vi。相应地，本发明的第一方面提供通过NMR光谱学定量样品中去-0-乙酰化Vi糖的 方法。所述Vi糖完全去-0-乙酰化。Vi糖上的N-乙酰基团通常完全保留，或者已知比例 的Vi糖可发生去-N-乙酰化。去-0-乙酰化产生分辨率良好的N-乙酰基共振，可用于定量存在的Vi糖。所述方法包括以下步骤i.去-0-乙酰化样品中存在的任何Vi糖；和i i.获得所述样品的NMR光谱。然后可采用所述NMR光谱来计算样品中Vi糖的存在量。所述方法还可包括向所述样品中加入已知量的参比化合物的步骤。或者，可在之 前采用已知量的参比化合物校准NMR仪器。可通过将NMR光谱中由去-0-乙酰化Vi糖产生的一个或多个共振与参比化合物 产生的一个或多个共振进行比较来进行计算步骤。本发明的第二方面提供通过液相色谱定量样品中Vi糖的方法。优选在本发明的 该方法中采用HPAEC。在进行液相色谱分析之前，优选将样品中的Vi糖水解或去乙酰化。 优选将Vi糖水解，然后去乙酰化。水解步骤引起寡糖形成，而去乙酰化步骤完全将这些寡 糖去乙酰化，可进一步将其水解形成最终产物。虽然去乙酰化促进随后的水解，但去乙酰化 降低糖在水中的溶解度，因此如果先进行去乙酰化可引起溶解问题。然而在一些实施方式 中，可通过单一步骤达到两种结果(例如，碱处理既可水解也可去乙酰化，而酸处理仅可水 解)。所述方法包括以下步骤i.水解样品中存在的Vi糖；ii.去乙酰化样品中存在的Vi糖；和iii.通过液相色谱分析所述样品。本发明的该方面还提供定量样品中的水解Vi糖的方法。该方法包括以下步骤i.去乙酰化样品中存在的水解Vi糖；和ii.通过液相色谱分析所述样品。本发明的该方面还提供定量样品中的去乙酰化Vi糖的方法。该方法包括以下步 骤i.水解样品中存在的去乙酰化Vi糖；和ii.通过液相色谱分析所述样品。这些方法还可包括在所述去乙酰化步骤之后的第二次水解步骤，但这不是必需 的。本发明的该方面还提供定量样品中的Vi糖的方法，其中所述Vi糖已水解和去乙 酰化。该方法包括以下步骤(i)通过液相色谱分析所述样品。然后可采用液相色谱仪来计算样品中Vi糖的存在量。Vi 糖本发明的方法用于分析含有Vi的样品。Vi是伤寒沙门菌(先前本身分类为一 个种，现在称为肠道沙门菌的伤寒血清型)的荚膜糖，其也可在沙门菌的其它血清型(如 肠道沙门菌的丙型副伤寒(paratyphi C)血清型或都柏林(dublin)血清型)和其它细菌 如柠檬酸杆菌属(CitrcAacter)(例如，弗氏柠檬酸杆菌(C. freundii)和杨氏柠檬酸杆菌 (C. youngae))中发现。本发明的方法可用来检测任何Vi糖，无论其是何来源。Vi多糖是氨基己糖醛酸，C-3位置60-90%发生0_乙酰化的α 1，4_Ν_乙酰氨基半乳糖醛酸的线型均聚物[9-14]。Vi糖上的0-乙酰取代是其引发保护性免疫应答能力的 影响因素W]。该0-乙酰基团在本发明的方法中被完全去除。NMR光谱学本发明第一方面的方法优选采用1H NMR光谱学进行，虽然可设想到采用其它核光 谱，例如13C NMR。在本发明的该方面中，样品中的Vi糖完全去-0-乙酰化。需要完全去-0-乙酰化 是因为由天然Vi中N-乙酰基和0-乙酰基产生的NMR峰具有相同的化学位移，因此如果 去-0-乙酰化不完全，则无法精确测定N-乙酰基峰的积分。优选使用氘代溶剂和试剂，例如 D2O中的NaOD、KOD等进行去-0-乙酰化反应，因为这可降低在碳水化合物的相同区域产生 1H NMR共振的水浓度，由此改善光谱质量。由使用这些试剂产生的碱性介质也产生光谱分 散改善和峰变尖的屮NMR光谱，由此进一步改善其清晰度。如果使用NaOD，可以50-100mM 的浓度、100-750mM的浓度或150_500mM的浓度使用。有用的NaOD浓度是200mM。在所述糖发生去-0-乙酰化时，分辨率良好的N-乙酰基共振保持不变。该N-乙 酰基共振可与内标进行比较，通过向测试样品中加入已知量的参比化合物提供所述内标， 以确定Vi糖的存在浓度。或者，可在之前采用已知量的参比化合物校准NMR仪器。所述参比化合物应产生与Vi糖不同的NMR光谱，共振的化学位移与Vi糖不同。有 用的参比化合物包括柠檬酸和乙醇，柠檬酸(或柠檬酸盐)特别有用，因为其可采用干粉形 式，因此可易于称重以制备标准溶液。用来校准NMR仪器或存在于样品中的参比化合物浓 度可以是 0. 005-0. 05mM,例如 0. 0075-0. 025mM 或 0. OlmM。液相色谱柱本发明第二方面的方法可采用各种液相色谱柱，但优选利用高效液相色谱 (HPLC)。特别优选高效阴离子交换色谱(HPAEC)。有用的柱自发保留糖，从而必须从柱中洗脱糖。从色谱柱中洗脱可以是等度洗脱 或梯度洗脱。在糖的HPAEC-PAD (脉冲电流检测)分析中通常使用的洗脱剂是包含氢氧化钠 和/或乙酸钠的洗脱剂。也可使用硝酸盐和/或氯化盐洗脱剂(通常为钠盐)，其通常基本 上不含任何乙酸盐洗脱剂。为从阴离子交换柱洗脱分析物，所述洗脱剂通常为碱性，例如， pH>8、>9、> 10、> 11、> 12、> 13等。可使用氢氧化物盐(例如NaOH)来达到所需pH， 氢氧化物离子通常用于阴离子交换洗脱剂。有用的洗脱剂是溶于IOOmMNaOH的40_150mM NaNO3。可对洗出液进行氢氧化物离子化学抑制，特别是在所述离子干扰所采用的分析检 测技术的情况中。可方便地采用微膜抑制剂，如Dionex 的MMS产品。“匪S III”产品采 用连续的化学抑制以增大分析物的导电率和减小洗脱剂的导电率，能够在宽浓度范围内进 行采用等度或梯度洗脱应用离子交换的直接电导检测。在洗脱剂包含乙酸根离子且产生的 乙酸干扰所采用的分析检测技术时，可避免使用从乙酸根离子产生乙酸的抑制剂。用于本发明第二方面的有用的HPAEC柱是戴安公司(Dionex)销售的“卡波帕克 (CarboPac) ”柱，如PAl [与二乙烯基苯2%交联的10 μ m直径聚苯乙烯底物，与500nm微珠 (MicroBead)季铵官能化胶乳(5%交联)附聚]、PA100、PA20、PA10[与二乙烯基苯55%交 联的10 μ m直径乙基乙烯基苯底物，与460nm微珠双官能季铵离子(5%交联)]、PA200或 MAl 柱。
有用的柱是卡波帕克PAl柱或带PAlO保护柱的卡波帕克PAlO柱。在以虹250讓 分析形式使用时，PAlO柱的容量是约100 μ eq(电荷毫当量数)。电流检测在本发明的第二方面中，优选对液相色谱柱的洗出液进行电流分析，虽然也可使 用其它检测方法。所述电流检测优选脉冲电流检测(PAD)，因为其不需要进行氢氧化物离子化学抑 制。可将各种波形用于PAD[15]。可使用负电势清洁电极，这可改善长期再现性并降低电极 磨损。用于电流检测的有用电极是金电极。作为使用电流检测的替代方法，本发明可使用电导检测，其中洗出液可进行氢氧 化物离子化学抑制。分析物本发明可用于分析Vi糖分析物。这些可以是多糖(例如聚合度至少为10，例如 20、30、40、50、60或更大)或寡糖(例如聚合度为2_10)。寡糖可以是母体多糖解聚和/或 水解的结果，例如，所述分析物可以是较大糖的含糖片段。除可用于分析全长荚膜糖以外， 本发明的方法还可用于其寡糖片段。在本发明第二方面的方法中，对样品进行处理，水解存在的任何Vi糖。该水解可 采用酸性和/或碱性条件。可采用三氟醋酸(TFA)进行所述水解步骤，例如，在4M的浓度和 120°C的温度下进行2小时。然后可用氢氧化钠处理所述样品，例如在2M的浓度和110°C的 温度下进行6小时，以将存在的任何Vi糖完全去乙酰化。基于以上讨论的原因，优选在去乙 酰化步骤之前进行水解步骤。然后可用TFA进一步处理Vi糖，例如在4M的浓度和118°C的 温度下进行2小时。碱水解是理想的，例如用NaOH处理至少2小时(例如，彡2小时、彡4 小时等)，可有效同时达到水解和去-ο-乙酰化。分析物中存在的Vi糖抗原可以是糖偶联物例如Vi糖-蛋白质偶联疫苗抗原的切 割产物。所述分析物可以是释放之前的待测产物(例如在制备或质量控制测试过程中)或 可以是释放之后的待测产物(例如用来评价稳定性、保存期限等)。分析如以上所讨论，在本发明的第二方面中，在向液相色谱柱加入样品之前，对所述 样品进行水解步骤和去乙酰化步骤。在以该方式处理的样品的HPAEC-PAD分析中可看到 特征峰。各具有不同Vi糖浓度(可采用本发明第一方面的方法测定)的若干这样样品的 HPAEC-PAD分析就该峰的积分显示线性趋势。该结果可用来产生给定仪器的校准曲线，随后 能通过与匪R方法相比成本较低、所需材料较少的方法定量样品中的Vi糖。可在Vi单糖重复单元分子数(例如摩尔)、质量、比率或浓度方面确定Vi糖的量。 通常采用摩尔以简化比率的计算，但可采用这些度量中的任何一种并相互交换以确定样品 的糖含量。如上所述，就定量测定而言，可将分析结果与已知含量的特定化合物的标准进行 比较。其它步骤在本发明第二方面的方法中，可能需要在进入柱之前从样品中去除至少一些非分析物化合物，Dionex 生产用于该目的的柱前捕获柱(pre-column trap)和保护柱，例如去 除氨基酸的氨基捕获柱、硼酸盐捕获柱等。在NMR分析或洗脱和分析之后，本发明还可包括确定受检测分析物的特征，例如
其纯度等。同样地，在NMR分析、电流检测或电导检测之后，样品或洗出液可偶联入质谱仪例 如 FAB/MS 或 ESI/MS 中。偶联物本发明可用于分析疫苗的Vi糖含量，特别用于包含偶联Vi糖的疫苗。共价偶联 用来增强糖的免疫原性，其通过将糖由不依赖T的抗原转化为依赖T的抗原，由此能够引发 免疫记忆。采用偶联于载体蛋白以增强碳水化合物抗原的免疫原性是众所周知的[例如在 参考文献16-M等中综述]，特别用于儿科疫苗[25]。载体蛋白可直接或通过接头与Vi糖共价偶联。可采用任何已知方法，例如参考文献沈和27所述的方法通过接头基团进行连接。 通常的连接类型是己二酸接头，其可通过以下方式形成将游离-NH2基团(例如通过氨基 化引入Vi糖中)与己二酸偶联(例如，采用二酰亚胺活化)，然后将蛋白质与所得的糖-己 二酸中间体[20二8，29]偶联。优选通过碳二亚胺介导的合成反应制备Vi偶联物，其中己 二酸二酰胼(ADH) [30]用来衍生化蛋白质，然后衍生化的蛋白质与Vi糖的COOH基团连接 [31]。或者，可用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)衍生化蛋白质，可 用胱胺衍生化Vi糖[32，33]。然后可将所述蛋白质和Vi糖通过二硫化物交换共价连接。另一类连接键是羰基接头，其可通过以下方式形成使修饰Vi糖的游离羟基与 CDI发生反应[34，35]，之后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接键。其它接头包括β-丙酰 胺基[36]、硝基苯基-乙基胺[37]、卤代酰基卤化物[38]、糖苷键[39]、6_氨基己酸W0]、 C4-C12部分Wl]等。也可采用碳二亚胺缩合反应W2]。典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或者其类毒素或突变体。这些 常用于偶联疫苗。CRM197白喉毒素突变体特别有用W3]。其它载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[44]、合成肽W5，46]、热激 蛋白W7，48]、百日咳蛋白W9，50]、细胞因子[51]、淋巴因子[51]、激素[51]、生长因子 [51]、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[52]如附9[53]、 来自流感嗜血杆菌的蛋白D[54-56]、肺炎球菌溶素[57]或其无毒衍生物[58]、肺炎球菌表 面蛋白PspA[59]、摄铁蛋白[60]、来自艰难梭菌(C. difficile)的毒素A或B[61]、重组铜 绿假单胞菌O^seudomonas aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA) [62]等。可采用载体蛋白的混 合物。单个载体蛋白可携带多个Vi糖W3]。偶联物可具有过量载体(w/w)或过量Vi糖(w/w)，例如比率范围是1 5-5 1， 虽然也可采用更广的范围，例如1 15-15 1。载体蛋白过量的偶联物通常具有的比率 范围是例如0.2 1-0.9 1如0.5 1，或重量相等(1 1)。在一些实施方式中，所述 Vi 蛋白质比率是0.4 1-1.2 1。本发明可用于偶联之前和之后。特别在偶联之后，可通过三种方式使用本发明分 析组合物第一种，可在混合不同偶联物之前或放行疫苗之前(用于调节或质量控制目的) 测定组合物中的Vi糖水平；第二种，可测定组合物中游离的未偶联Vi糖的水平，例如以检查不完全偶联或通过监测随时间增加的游离糖跟踪偶联物水解；第三种，可就相同的原因 测定组合物中偶联Vi糖的水平。第一种和第三种方式可包括在分析之前从偶联物中释放 Vi糖。组合物中游离的未偶联Vi糖的比例可通过以下方法获得测定组合物样品中Vi 糖的总量和相同量样品中偶联Vi糖的量，然后从Vi糖的总量中减去偶联Vi糖的量，再除 以Vi糖的总量。类似地，组合物中偶联Vi糖的比例可通过以下方法获得测定组合物样品 中Vi糖的总量和相同量样品中游离的未偶联Vi糖的量，然后从Vi糖的总量中减去游离的 未偶联Vi糖的量，再除以Vi糖的总量。可以任何一种方式使用本发明，本领域技术人员可 方便地自主选择最适当的方法。为分别评价偶联和未偶联Vi糖，必须将其分离。偶联反应改变Vi糖的各种化学 和物理参数，可将所述差别用于分离。分析糖偶联物的方法可包括以下步骤(a)对所述糖偶联物进行处理以从载体中 释放Vi糖；和(b)如上所述分析释放的Vi糖。本发明提供释放疫苗的方法供医师使用，其 包括以下步骤(a)制备包含Vi糖偶联物的疫苗，(b)如上所述定量疫苗中的Vi糖；如果 步骤(b)的结果显示Vi糖的水平为临床使用可接受，则(c)放行所述疫苗供医师使用。可 对包装疫苗或包装前的散装疫苗实施步骤(b)。非糖组分除分析组合物中的Vi糖以外，所述过程还可包括分析其它组分或性质，例如，重 量摩尔渗透压浓度、PH、个体Vi糖或偶联物的聚合度、蛋白质含量(特别就载体蛋白而言)、 铝含量、去污剂含量、防腐剂含量等。本发明提供制备疫苗组合物的方法，其包括如上所述分析Vi糖的步骤、测定所述 组合物PH的步骤，随后任选将所述组合物pH调整到所需值例如6-8或约7的步骤。本发明还提供制备疫苗组合物的方法，其包括以下步骤(a)提供如上所述分析 的Vi糖；(b)将所述Vi糖与一种或多种载体蛋白偶联；(c)任选分析散装疫苗的pH和/或 其它性质；如果步骤(c)的结果显示所述散装疫苗为临床使用可接受，则(d)从散装疫苗进 行制备和包装供人使用。步骤(c)可包括评价最小糖浓度、评价未偶联糖偶联糖比率等。 步骤(d)可包括包装为单位剂型或多剂型，例如包装到小瓶或注射器中。通常人注射剂量 的体积是0. 5ml。本发明还提供制备疫苗组合物的方法，其包括以下步骤(a)提供如上所述分析 的Vi糖样品；(b)将所述Vi糖与一种或多种载体蛋白偶联，以形成偶联Vi糖；和(C)将偶 联Vi糖与一种或多种其它抗原混合，例如与来自甲型肝炎病毒如灭活病毒的抗原[例如 64,65]混合。可将这样的抗原吸附在铝盐佐剂(例如氢氧化物或磷酸盐)上。概述术语“包含”包括“含有”以及“由……组成”，例如“包含” X的组合物可仅由X组 成或可含有其它物质，例如X+Y。词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必 要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。与数值χ相关的术语“约”表示，例如χ士 10 %。本发明的方法可用于分析和/或制备目的。提及“分析”等不应理解为排除制备方法。“Vi糖”应理解为指伤寒沙门菌和弗氏柠檬酸杆菌的荚膜糖Vi，但其也可指任何结 构或抗原性相同的糖，例如在C-2发生N-乙酰化、在C-3发生0-乙酰化的果胶。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺 序。因此，可以任何顺序对组分进行混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后 可将合并的组分再与第三种组分合并等。术语“定量”包括精确地并比较地测定样品中物质的量，即确定其位于阈值之上或 之下。附图简述

图1显示伤寒沙门菌Vi(a 1，4-N_乙酰氨基半乳糖醛酸)结构式的图示。图2和3分别显示天然Vi糖和去-0-乙酰化Vi糖的1H NMR光谱。X表示N-乙 酰基和0-乙酰基的未分辨峰；Y表示乙酸根阴离子(天然Vi糖中的存在量非常小)；Z表
示N-乙酰基。图4显示乙醇作为参比化合物存在时的去-0-乙酰化Vi糖的1H NMR光谱。b 乙 酸根阴离子；c =N-乙酰基；d =H-I ；e :H-2 ；f :H_3 ；g :H_4 ；h :H_5。图5显示柠檬酸的1H NMR光谱。图6显示柠檬酸作为参比化合物存在时去-0-乙酰化Vi糖样品的部分1H NMR光 谱。括弧表示柠檬酸盐和N-Ac。图7显示在120°C的温度下用浓度为4M的TFA水解2小时后Vi糖的HPAEC-PAD 分析。图8显示在i)去-0-乙酰化和ii) 1200C的温度下用浓度为4M的TFA水解2小时 后Vi糖的HPAEC-PAD分析。图9显示在i) IlO0C的温度下用浓度为2M的氢氧化钠完全去乙酰化6小时和 ii) 120°C的温度下用浓度为4M的TFA水解2小时后Vi糖的HPAEC-PAD分析。图10显示在i) 1200C的温度下用浓度为4M的TFA水解2小时和ii) 110°C的温度 下用浓度为2M的氢氧化钠完全去乙酰化6小时后Vi糖的HPAEC-PAD分析。图11显示通过将图10中箭头标出的峰的积分对Vi浓度(由1H NMR确定； 5-200 μ g/ml)作图产生的校准曲线。R2 = 0. 997。图12显示120°C的温度下用浓度为4M的TFA水解2小时和110°C下用2M的氢氧 化钠完全去乙酰化6小时后Vi糖偶联物的HPAEC-PAD分析。图13显示Vi为0-200 μ g/ml时的另一个校准曲线。R2 = 0. 9993。实施本发明的方式NMR 分析将15 μ 1柠檬酸盐标准溶液(0. 4328mmol/ml,通过将127. 3mg柠檬酸三钠 (294. lg/mol)溶解于Iml D2O中制备得到)加入溶于NaODQOOmM)的0. 015mmol Vi糖溶 液(标称，基于Vi糖粉末的干重)。获得如图6所示的NMR光谱。Vi糖粉末的纯度如下计 算NCOCH3 (3H)共振的积分:92 ；92/3 = 30. 66 (对应于 IH 的积分)柠檬酸盐GH)共振的积分100 ； 100/4 = 25 (对应于IH的积分)
光谱中Vi糖/柠檬酸盐的摩尔比=30. 66/25 = 1. 2264加入试管的柠檬酸盐的摩尔数0. 0065mmol因此 Vi 糖的摩尔数=0. 0065x 1. 2264 = 0. 008mmol如上所示，基于Vi糖粉末干重的溶液中Vi糖的摩尔数0. 015mmolVi 糖粉末的纯度=0. 008/0. 015x 100 = 53. 3%柠檬酸盐或乙醇标准存在下(RT，500MHz，D2O中)去_0_乙酰化Vi糖的 NMR光 谱分布为5. IOppm Hl，4.70ppm H5，4.44ppm H4，4.2ppm H2，4. 13ppm H3，2. 06ppm 非-0-乙 酰化残基中的N-乙酰基(3H)，1. 9Ippm在去-0-乙酰化过程中产生的乙酸根阴离子(3H)， 2. 72-2. 48ppm 4H 柠檬酸盐，3. 62ppm(2H, CH3CE^OH)，1. 25ppm(3H, CH3CH2OH)。用来获得以上列出的光谱的仪器(布鲁克(Bruker)DRX 500MHz NMR分光计)参 数如下核1HNS 采样扫描次数(Number of scans) 128数据点数(Numberof data points) TD 32768空扫次数(Number of dummy scans) DS 0谱宽(Spectralwidth) Hz SffH 5000采样时间(Acquisitiontime)AQ[秒]3. 2768500接受器增益调整(Receivergain adjust) RGA 256驻留时间(Dwelltime)Dff 100. 00 μ s预扫延迟时间(I^re scan-delay) D 198. 86 μ sDl 检测延迟时间(relaxation delay)[秒]10( > 5*T1)胃_目足各力/]、 (Dimension οfaccumulation loop) TDO 1fl 通道Pl [μ s] 4. 00，Π通道高功率脉冲PLl [dB]0. 00, fl通道脉冲功率水平HPAEC-PAD 分析用以下物质处理含Vi糖的样品· TFA 4M，2 小时，120°C· NaOH 2M，6 小时，110°C产生图10中箭头标出的峰。采用与上述相同方式处理Vi浓度为5-200 μ g/ml (由 1H NMR确定)的样品显示HPAEC-PAD分析检测到的所示积分峰的线性趋势(见图11)。该 校准曲线允许进行Vi定量。其它实验证实了所述方法可检测到浓度低达1 μ g/ml的糖。图13是来自这样的 实验的校准曲线。采用NaOH处理4小时还实现完全水解，由此避免需要进行额外的TFA步骤，且将 NaOH处理的时间减少了 2个小时。更短的NaOH处理也是有效的O小时)，但产生的峰面 积较低。所用的仪器是带PAlO保护柱的卡波帕克PAlO柱。将溶于IOOmMNaOH的40mM NaNO3用作洗脱剂。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可进行修改而仍在本发明的范围和构思 内。参考文献(其内容通过引用纳入本文)[1]《疫苗》(Vaccines) (Plotkin 等编)第 4 版，ISBN :0721696880.[2]Acharya 等(1981)N Engl J Med 311 :1101-1104.[3]Klugman 等(1987)Lancet ii :1165-1169.[4] Canh 等(2004) Infect Immun. 72(11) :6586-8.[5]Stone 等(1988) J Clin Microbiol 26(4) :719-25.[6]Kao 等(2004)Vaccine 22:335-344.[7]Lemercinier 等(2000)Biologicals 28(1) :17-24.[8] Jones (2005) J Pharm Biomed Anal 38(5) :840-50.[9]Clark 等(1958)J Biol Chem 230 :81-89.[10]Heyns 等(1967)Carbohydr Res 3:340-353.[ll]Heyns 等(1959)Chem Ber 92 :2435-2438.[12]Webster 等(1954)Arch Biochern Biophys50 :223-224.[13]Webster 等(1954)J Immunol 73 :16-22.[14]Whiteside 等(1961) J Immunol 86:538-542.[15]LaCourse 和 Johnson(1993)Anal Chem 65 :50-55.[16] Lindberg (1999) Vaccine 17 增刊 2[17]Buttery 禾口 Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34 :163-8.[18]Ahmad 和 Chapnick(1999nnfect Dis Clin North Am 13 :113-33, vii.[19]Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47 :563-567.[20] EP-B-O 477508.[21]美国专利 5，306，492.[22]W098/42721.[23]Dick等刊于《偶联疫苗》(Conjugate Vaccines) (Cruse等编)卡尔格出版公 司(Karger)，巴塞尔，1989，第 10 卷，48-114.[24]Hermanson《生物偶联技术》(Bioconjugate ^Techniques)，学术出版社，加州 圣迭戈(1996).[25] Ramsay 等(2001) Lancet 357(9251) :195-6.[26]美国专利 4，882，317.[27]美国专利 4，695，624.[28]Mol. Immunol, 1985,22,907-919.[29]EP-A-0208375.[30]美国专利 4，965，338.[31]Kossaczka 等(1997)Infect Immun 65(6) :2088-93.[32]美国专利 5，204，098.[33] Szn ^ (1989) Infect Immun 57(12) :3823.
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权利要求
I.一种定量样品中存在的Vi糖的方法，其包括以下步骤
1.去-0-乙酰化样品中存在的任何Vi糖；和 ii.获得所述样品的NMR光谱。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤(iii)采用所述NMR光谱来计算样品 中Vi糖的存在量。
3.如之前任一项权利要求所述的方法，其还包括以下步骤(iv)向所述样品加入已知 量的参比化合物。
4.如之前任一项权利要求所述的方法，其特征在于，N-乙酰基共振用来计算样品中Vi 糖的存在量。
5.如之前任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述NMR光谱是1HNMR光谱。
6.如之前任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述Vi糖由氘氧化钠去-0-乙酰化。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述参比化合物选自柠檬酸或乙醇。
8.—种通过液相色谱定量样品中存在的Vi糖的方法。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液相色谱是高效阴离子交换色谱 (HPAEC)。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用脉冲电流检测(PAD)(HPAEC-PAD)。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其包括以下步骤(i)水解所述样品中存在 的Vi糖；(ii)去乙酰化所述样品中存在的Vi糖；和(iii)通过液相色谱分析所述样品。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在所述去乙酰化步骤之 后的第二水解步骤。
13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，120°C的温度下用浓度为4M的三氟 醋酸(TFA)处理2小时来进行所述水解步骤。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其特征在于，110°C的温度下用浓度为2M 的氢氧化钠处理6小时来进行所述去乙酰化步骤。
15.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，水解和去乙酰化包括100-150°C的 温度下用氢氧化钠处理2-6小时。
16.如之前任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述Vi糖来自伤寒沙门菌 (Salmonella typhi)。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述Vi糖来自弗氏柠檬酸杆 菌(Citrobacter freundii)。
全文摘要
可通过两种新的方法检测伤寒沙门菌的Vi糖。第一种，可采用其质子NMR光谱，与内标作比较从而能定量分析。第二种，可将带电流检测的阴离子交换色谱用于水解的糖。
文档编号G01N33/15GK102089653SQ200980127894
公开日2011年6月8日 申请日期2009年6月12日 优先权日2008年6月13日
发明者D·普罗蒂, F·伯尔蒂, F·米可利 申请人:诺华有限公司