专利名称：一种用lc-ms技术定量分析生物样品中小分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法。
背景技术：
液相色谱质谱联用技术(LC-MS技术)，以其高灵敏度和高选择性，在定量分析，特 别是小分子定量分析中的应用日益广泛。LC-MS有正离子模式和负离子模式两种工作模式，分别只能检测到正离子和负离 子。两种模式适合分析不同的化合物，因为有的化合物离子化容易形成正离子，有的化合物 离子化则容易形成负离子。因此，对于含有多种未知组分的样品，或含有离子化特点不同组 分的样品，必须分别在正离子模式和负离子模式下进行分析。内标定量法是定量分析的常用方法，是将确定量的已知化合物(内标物)加入到 样品中，与样品中的待测成分一同被分析，从而校准测定结果的方法。该方法特别适用于微 量成分的分析，因为其能较好地降低分析误差。为了用内标定量法在正离子模式和负离子模式下对同一样品进行分析，需要选择 适宜的内标物。由于常见的大多数化合物往往很难在两种模式下都有良好的信号响应，因 此不得不对两种模式分别建立内标物。如果能找到一种既能用于正离子模式，也能用于负 离子模式的内标物，则能简化操作，提高工作效率。另一方面，生物样品(血液、体液、组织勻浆、尿液、粪便等)一般为水性基质，若选 择的内标物为脂溶性，或不能较好地溶解在基质中，则影响分析效果，甚至完全找不到内标 物信号。目前国内外文献尚为见到在生物样品分析中只用一种内标物同时分析两种模式 的研究报道。

发明内容
本发明目的在于一种用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法。本发明目的是通过如下方案实现的本发明生物样品中小分子的定量分析方法为采用LC-MS技术，以苦杏仁苷作为 内标物。其中，所述的生物样品是指血清、血液、体液、组织勻浆、尿液或粪便。其中，所述的小分子化合物是指分子量小于IOOODa的化合物。本发明定量分析方法中LC-MS方法的技术条件为色谱条件流动相为A 含甲酸的水，B 含甲酸的乙腈；梯度洗脱或恒定比例洗 脱；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测。本发明定量分析方法中LC-MS方法的技术条件优选为色谱条件WatersAcquity HSS T3 色谱柱(IOOmmX 2. Imm I. D.，1. 8 μ m)，柱温24 °C ；流动相为Α:含0. 甲酸的水，8:含0. 甲酸的乙腈；洗脱梯度为0 — lmin，2% B, 1 — 2min，2%— 5% B，2 — 5min，5%— 12% B，5 — IOmin, 12%— 20% B, 10 — 12min, 20%— 30% B, 12 — 13min，50%— 100% B, 15 — 16min, 100% B, 16 — 17min, 100%— 2% B, 17 — 20min,2% B，流速 0. 5mL/min，进样量，8 μ L ；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式m/z 范围为70-1000，毛细管电压为2. 9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C，脱溶剂温为 450°C，脱溶剂气体流速为900L化―1，锥孔气流量50L化―1，锁校质荷比为m/z556. 2771 ；负离 子模式m/z范围为70-1000，毛细管电压为3. OkV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C， 脱溶剂温为450°C，脱溶剂气体流速为900L · 1Γ1，锥孔气流量50L · h—1，锁校质荷比为m/z 554.2615。本发明定量分析方法中内标溶液为1. 08mg/mL的苦杏仁苷溶液；配制方法为精 密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成1. 08mg/mL的内标溶液。其中，用本发明定量分析方法测血清中小分子化合物的步骤为A.样品处理方法精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成1. 08mg/mL的内标溶液， 将内标溶液20 μ L加入500 μ L血清中，混勻后滴加IOOyL 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s， 4°C条件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供 分析；B.标准曲线样品配制精确称取待测化合物，用50%乙腈溶解、稀释成为系列浓 度溶液；取内标溶液和待测物溶液各20 μ L加入480 μ L空白血清中，混勻后滴加100 μ L 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22μπι微孔滤膜 过滤后供分析；C.在正离子模式或负离子模式下，在LC-MS进样，测定血清中待测物的含量。本发明公开了一种采用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法，该方法中 以苦杏仁苷作为内标物。实验表明，该方法能同时在液相色谱-电喷物离子化(ESI)质谱 联用的正离子模式和负离子模式下有良好的信号响应，并且与浓度有良好的线性关系。该 方法有效解决了现有技术中不得不对正离子和负离子模式分别建立内标物的缺陷，能简化 操作，提高工作效率。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1本发明生物样品中小分子的定量分析方法的方法学实验本实验以血清为考察生物样品，以苦杏仁苷本身，和小分子化合物芍药苷和阿魏 酸为考察对象，采用本发明实施例1所述色谱和质谱条件进行质谱信号、色谱信号以及线 性关系考察。阿魏酸分子量194. 19，芍药苷分子量480. 45。1、样品处理方法血清中苦杏仁苷信号及线性关系考察精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成 2mg/mL的储备液，再将该储备液用50%乙腈溶液稀释成系列浓度溶液，浓度范围为正离 子模式1. 55 μ g/mL-11. 61 μ g/mL,负离子模式2. 58 μ g/mL-9. 68 μ g/mL。取各浓度溶液 20yL加入500yL空白血清中，混勻后滴加IOOyL 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条件 下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。用苦杏仁苷作内标分析其他化合物的线性关系考察精确称取芍药苷和阿魏酸， 用50%乙腈分别溶解为1. 08mg/mL和1. 24mg/mL浓度的溶液。取上述两溶液混合，以50%乙腈稀释，配制成相当于芍药苷为129. 6μ g/mL、阿魏酸148. 8 μ g/mL的混合储备液，再将 该储备液以50%乙腈稀释至系列浓度溶液，浓度范围为芍药苷0. 258-77. 76 μ g/mL，阿魏 酸0. 297-148. 8 μ g/mL。同时配制浓度为1. 08mg/mL的苦杏仁苷溶液作为内标溶液。取内 标溶液和标准品溶液各20μ L加入480μ L空白血清中，混勻后滴加100μ L 20%三氯乙酸， 漩涡震荡30s，4°C条件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。2、LC-MS 技术条件(1)色谱条件=Waters Acquity HSS T3 色谱柱(IOOmmX 2. Imm I. D.，1. 8 μ m)，柱 温24°C，流动相为A:水(含0. 甲酸)，B 乙腈(含0. 甲酸)，洗脱梯度为O — lmin， 2%B, 1 — 2min，2%—5%B，2 —5min，5%— 12% B，5 — lOmin，12%—20% B，10 — 12min， 20%— 30% B, 12 — 13min，50%— 100% B, 15 — 16min, 100% B, 16 — 17min, 100%— 2% B, 17 — 20min,2% B，流速 0. 5mL/min，进样量，8 μ L。(2)质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测。正离子模式 m/z范围为70-1000，毛细管电压为2. 9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C，脱溶剂温 为450°C，脱溶剂气体流速为900L化―1，锥孔气流量50L .h—1，锁校质荷比为m/z 556. 2771。 负离子模式m/z范围为70-1000，毛细管电压为3. OkV，锥孔电压为40kV，离子源温度为 100°C，脱溶剂温为450°C，脱溶剂气体流速为900L · h—1，锥孔气流量50L · h—1，锁校质荷比 为 m/z 554.2615。3、血清中内标物的LC-MS信号质谱信号正离子模式m/z 458. 17 [M+H]+，负离子模式m/z 456. 15 [M+H]_，质谱 图见图1。表明，苦杏仁苷在正、负两种模式下都有清晰明显的质谱信号。色谱信号色谱图见附图2。表明，苦杏仁苷在正、负两种模式下都能得到清晰且 峰形良好的色谱信号。4、血清中内标物的LC-MS线性关系图3是在正离子、负离子两种模式下大鼠血清中苦杏仁苷本身的线性关系考察结 果，横坐标是苦杏仁苷浓度，纵坐标是信号的峰面积。线性相关系数r分别为0. 9928和 0. 9951。可以看出，两种模式下均有良好的线性关系。5、用苦杏仁苷作内标物LC-MS分析血清中芍药苷、阿魏酸的线性关系图4是以苦杏仁苷为内标物在负离子模式下测定血清中芍药苷和阿魏酸的线性 关系考察结果。横坐标为芍药苷或阿魏酸在血清中的浓度，纵坐标为芍药苷或阿魏酸与内 标物苦杏仁苷的峰面积比。图5是以苦杏仁苷为内标物在正离子模式下测定血清中芍药苷的线性关系考察 结果。横坐标为芍药苷在血清中的浓度，纵坐标为芍药苷与内标物苦杏仁苷的峰面积比。表明，本发明定量分析方法中以苦杏仁苷为内标物测定血清中的小分子化合物， 线性关系良好。


图1 血清中苦杏仁 苷LC-MS质谱图(a正离子模式，b负离子模式)；图2 血清中苦杏仁苷LC-MS色谱图(a正离子模式，b负离子模式)；图3 正离子、负离子两种模式下大鼠血清中苦杏仁苷本身的线性关系考察(a正离子模式，b负离子模式)；图4 以苦杏仁苷为内标物在负离子模式下测定血清中芍药苷和阿魏酸的线性关 系考察(a测定芍药苷；b测定阿魏酸)；图5 以苦杏仁苷为内标物在正离子模式下测定血清中芍药苷的线性关系考察。下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
具体实施例方式实施例1 采用本发明生物样品中小分子定量分析方法分析四物汤灌胃后大鼠血 清中阿魏酸和芍药苷的含量1、给药取血 SD雌性大鼠(200 士 20g)，三天适应性饲养并禁食12hr后灌胃四物汤浓煎液，分别 于5min(n = 5)和15min(n = 5)后腹主动脉取血5mL，4°C下3000rpm离心5min后取血清。2、血清样品处理方法精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成1. 0811^/1^的内标溶液，将内标溶液2(^1^ 加入500 μ L血清中，混勻后滴加100 μ L 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条件下13000rpm 离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。3、标准曲线样品配制方法精确称取芍药苷和阿魏酸，用50%乙腈分别溶解为1. 08mg/mL和1. 24mg/mL浓度 的溶液。取上述两溶液混合，以50%乙腈稀释，配制成相当于芍药苷为129. 6μ g/mL、阿魏 酸148. 8μ g/mL的混合储备液，将该储备液以50 %乙腈稀释至系列浓度溶液，浓度范围为 芍药苷0. 259-77. 76 μ g/mL,阿魏酸1. 488-148. 8 μ g/mL。同时配制浓度为1. 08mg/mL的苦 杏仁苷溶液作为内标溶液。取内标溶液和标准品溶液各20 μ L加入480 μ L空白血清中，混 勻后滴加ΙΟΟμ L 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条件下13000rpm离心lOmin，上清液经 0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析。4、技术条件色谱条件=WatersAcquity HSS T3 色谱柱(IOOmmX 2. Imm I. D.，1. 8 μ m)，柱温 240C ；流动相为A 含0. 甲酸的水，8:含0. 甲酸的乙腈；洗脱梯度为O — lmin，2% B, 1 — 2min，2%— 5% B，2 — 5min，5%— 12% B，5 — lOmin, 12%— 20% B, 10 — 12min, 20%— 30% B, 12 — 13min，50%— 100% B, 15 — 16min, 100% B, 16 — 17min, 100%— 2% B, 17 — 20min,2% B，流速 0. 5mL/min，进样量，8 μ L ；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式m/z 范围为70-1000，毛细管电压为2. 9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C，脱溶剂温为 450°C，脱溶剂气体流速为900L化―1，锥孔气流量50L化―1，锁校质荷比为m/z556. 2771 ；负离 子模式m/z范围为70-1000，毛细管电压为3. OkV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C， 脱溶剂温为450°C，脱溶剂气体流速为900L · 1Γ1，锥孔气流量50L · h—1，锁校质荷比为m/z 554.2615。5、测定化合物含量 负离子模式测定血清阿魏酸含量，正离子模式测定血清芍药苷含量。6、测定结果
负离子模式下，血清阿魏酸标准曲线方程y = 0. 1119X-0. 0018，r = 0. 9856 ；

正离子模式下，血清芍药苷标准曲线方程y = 0. 3791x+0. 0252，r = 0. 9976 ；具 体结果见表1 :表1血清中阿魏酸和芍药苷含量
权利要求
1.一种生物样品中小分子的定量分析方法，其特征在于该定量分析方法采用LC-MS技 术，以苦杏仁苷作为内标物。
2.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的生物样品是指血清、血 液、体液、组织勻浆、尿液或粪便。
3.如权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的小分子化合物是指分子 量小于IOOODa的化合物。
4.如权利要求1-3任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的技术 条件为色谱条件流动相为A 含甲酸的水，B 含甲酸的乙腈；梯度洗脱或恒定比例洗脱；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测。
5.如权利要求4所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的技术条件为色谱条件Waters Acquity HSS T3 色谱柱(IOOmmX 2. Imm I. D.，1. 8 μ m)，柱温 24°C ； 流动相为A 含0. 1 %甲酸的水，B 含0. 1 %甲酸的乙腈；洗脱梯度为O — Imin, 2% B, 1 — 2min，2%—5% B，2 —5min，5%— 12% B, 5 ^ lOmin，12%—20% B，10 — 12min,20% —30% B, 12 ^ 13min, 50 % — 100 % B，15 — 16min, 100 % B，16 — 17min, 100%^ 2% B, 17 — 20min,2% B，流速 0. 5mL/min，进样量，8 μ L ；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式m/z范 围为70-1000，毛细管电压为2. 9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C，脱溶剂温为 450°C，脱溶剂气体流速为900L化―1，锥孔气流量50L化―1，锁校质荷比为m/z556. 2771 ；负离 子模式m/z范围为70-1000，毛细管电压为3. OkV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C， 脱溶剂温为450°C，脱溶剂气体流速为900L · 1Γ1，锥孔气流量50L · h—1，锁校质荷比为m/z 554.2615。
6.如权利要求1_3、5任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的内 标溶液为1. 08mg/mL的苦杏仁苷溶液；其配制方法为精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈 配成1. 08mg/mL的内标溶液。
7.如权利要求4所述的定量分析方法，其特征在于其中所述LC-MS方法的内标溶液 为1.08mg/mL的苦杏仁苷溶液；其配制方法为精密称取苦杏仁苷，溶于50 %乙腈配成 1. 08mg/mL的内标溶液。
8.如权利要求1-7任一所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的生物样品为血清。
9.如权利要求8所述的定量分析方法，其特征在于该定量分析方法的具体步骤为A.样品处理方法精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液，将内 标溶液20 μ L加入500 μ L血清中，混勻后滴加100 μ L 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条 件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析；B.标准曲线样品配制精确称取待测化合物，用50%乙腈溶解、稀释成为系列浓度溶 液；取内标溶液和待测物溶液各20 μ L加入480 μ L空白血清中，混勻后滴加100 μ L 20% 三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤 后供分析；C.在正离子模式或负离子模式下，在LC-MS进样，测定血清中待测物的含量。
10.如权利要求8所述的定量分析方法，其特征在于其中所述的小分子化合物为阿魏 酸和芍药苷，具体定量分析步骤为A.样品处理方法精密称取苦杏仁苷，溶于50%乙腈配成1.08mg/mL的内标溶液，将内 标溶液20 μ L加入500 μ L血清中，混勻后滴加100 μ L 20%三氯乙酸，漩涡震荡30s，4°C条 件下13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析；B.标准曲线样品配制方法精确称取芍药苷和阿魏酸，用50%乙腈分别溶解为 1. 08mg/mL和1. 24mg/mL浓度的溶液，取上述两溶液混合，以50%乙腈稀释，配制成相当于 芍药苷为129. 6 μ g/mL、阿魏酸148. 8 μ g/mL的混合储备液，将该储备液以50%乙腈稀释至 系列浓度溶液，浓度范围为芍药苷0. 259-77. 76 μ g/mL,阿魏酸1. 488-148. 8 μ g/mL,同时 配制浓度为1. 08mg/mL的苦杏仁苷溶液作为内标溶液，取内标溶液和标准品溶液各20 μ L 加入480 μ L空白血清中，混勻后滴加100 μ L 20 %三氯乙酸，漩涡震荡30s，4 °C条件下 13000rpm离心lOmin，上清液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤后供分析；C.技术条件色谱条件Waters Acquity HSS T3 色谱柱(IOOmmX 2. lmml. D.，1. 8 μ m)，柱温 24°C ； 流动相为A 含0. 1 %甲酸的水，B 含0. 1 %甲酸的乙腈；洗脱梯度为O — Imin, 2% B, 1 — 2min，2%—5% B，2 — 5min，5%— 12% B, 5 ^ lOmin, 12%—20% B，10 — 12min,20% —30% B, 12 ^ 13min, 50 % — 100 % B，15 — 16min, 100 % B，16 — 17min, 100%^ 2% B, 17 — 20min,2% B，流速 0. 5mL/min，进样量，8 μ L ；质谱条件电喷雾电离离子源(ESI)，正、负离子模式分别检测；正离子模式m/z范 围为70-1000，毛细管电压为2. 9kV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C，脱溶剂温为 450°C，脱溶剂气体流速为900L化―1，锥孔气流量50L化―1，锁校质荷比为m/z556. 2771 ；负离 子模式m/z范围为70-1000，毛细管电压为3. OkV，锥孔电压为40kV，离子源温度为100°C， 脱溶剂温为450°C，脱溶剂气体流速为900L · 1Γ1，锥孔气流量50L · h—1，锁校质荷比为m/z 554. 2615 ；D.测定化合物含量负离子模式测定血清阿魏酸含量，正离子模式测定血清芍药苷含量。
全文摘要
本发明公开了一种采用LC-MS技术定量分析生物样品中小分子的方法，该方法中以苦杏仁苷作为内标物。实验表明，该方法能同时在液相色谱-电喷物离子化(ESI)质谱联用的正离子模式和负离子模式下有良好的信号响应，并且与浓度有良好的线性关系。该方法有效解决了现有技术中不得不对正离子和负离子模式分别建立内标物的缺陷，能简化操作，提高工作效率。
文档编号G01N30/72GK102053127SQ20101054121
公开日2011年5月11日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者刘明, 梁乾德, 王宇光, 肖成荣, 谭洪玲, 马增春, 马靖, 高月 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所