专利名称：一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法
技术领域：
本发明属生物医学及检测领域，涉及血清标志物检测方法，具体涉及一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法。该方法能为临床肿瘤等重大疾病早期诊断，提供多种血清标志物辅助判断依据。
背景技术：
根据卫生部肿瘤防治办公室提供的我国肿瘤发病率和十大恶性肿瘤发病率排序显示中国每年癌症新发病例约为220万人，因癌症死亡人数为160万人。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。其中，肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男、女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。据预测，到2020年，中国将有550万新发癌症病例，其中死亡人数将达400万。根据上海市疾病预防控制中心最新癌情监测数据表明，2009年上海全市新发癌症病例4. 6万例，其中男性占M%，女性占46% ； 癌症是居心脑血管疾病后的第2位死因，上海每年有约3万人因癌症而死亡，其中男性占 60%，女性占40%，每1000个上海人中就有超过2人因癌症而死亡；目前上海累计约18万存活的癌症患者，每100个人中就有超过1人是癌症患者。调查显示，有关的癌症发病、死亡和现有患者人数仍呈继续上升的态势。目前，肺癌等重大疾病的临床诊断方法主要有首选胸片检查，发现肺内结节的限度是直径大于1cm，而此时肿瘤可能已经侵犯支气管上皮和血管上皮，有学者建议，大于60 岁的吸烟者，需每年做低剂量螺旋CT筛查；经皮细针针吸活检在诊断肺部恶性结节方面准确性较高，但该方法为有创性检查，能产生一定的并发症，如气胸和咯血等；痰细胞学检查利用痰液检查寻找癌细胞，特别是多次痰检，有助于对起源于大气管的中心性肿瘤，如鳞癌和小细胞癌的诊断，起源于小气管的外周性肿瘤，如腺癌，特别是直径小于2cm，仅偶尔可被痰检发现，却有重要意义。痰细胞学检查最大优势在于无创。纤维支气管镜是获得肺癌组织学证据最常用的诊断工具，然而在诊断早期肺癌方面却有局限性，因为这些病变肉眼难以判断。荧光内镜可明显提高癌前病变和原位癌的检出率，在肺癌高危人群的筛查和随访中可起重要作用，但检查费用昂贵。发展快速、费用低、灵敏度高、特异性好的无创性早期诊断新技术，特别是血清学的诊断技术，近年来已成为临床上颇为关注的热点研究领域。多种血清肿瘤标志物的联合检测重要性逐渐被临床医师所认识。在肺癌的诊断中，血清肿瘤标志物主要有癌胚抗原(CEA)、神经元烯醇化酶(NSE)、p53抗体、细胞角质素片断19(CYFRA21-1)、血管内皮生长因子等。CEA是一种具有人类胚胎抗原性的酸性糖蛋白，对肺癌的疗效判断、病情发展检测和预后的评估是一个较好的肿瘤标记物，大量实验结果表明2/3的非小细胞肺癌(NSCLC)和1/3的小细胞肺癌(SCLC)患者中CEA水平均见升高，CEA在肺癌中阳性率可达62. 85%，CEA在肺腺癌中阳性率可达81.4%。NSE是一种糖裂解酶，神经内胚层和神经内分泌组织来源的肿瘤均见升高。SCLC最常表现为神经分泌性质的肿瘤，故NSE是SCLC敏感、特异的肿瘤标志物。然而，尽管血清中的CEA和NSE已分别应用于肺癌等重大疾病诊断，但大量的临床数据表明单一肿瘤标志物存在着特异性不强的弊端，特别是对早期肿瘤的检测率不高的缺陷，临床上经常不得不采用多个标志物分别检测、联合分析的方法来提高肿瘤检测的敏感性。但是，每种标志物都需要一种放射或酶联免疫试剂盒，直接导致这些多指标检测方法普遍存在所需血清用量大、检测时间长、诊断费用高、操作复杂等不足，在人力、物力、财力上都是不现实的，从而限制了它们在临床上的应用。生物芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，具有高通量、微型化和自动化等特点，是医学检测的重要发展方向之一，但目前离临床常规使用还有一段距离。

发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，如检测标志物单一，实验周期长，血清用量大，诊断费用高等等，提供一种同时检测多种血清标志物的方法，尤其是一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法。该方法能为临床肿瘤等重大疾病的早期诊断，提供多种血清标志物辅助判断依据。为实现本发明的目的，本发明采用下述技术方案提供一种同时检测多种血清标志物的方法，尤其是一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法，本方法通过CEA和NSE生物素化包被抗体与标准样品或者待测样品反应， 然后直接加入兔抗CEA抗体和FITC标记的NSE标记抗体，反应形成抗原抗体复合物后与聚苯乙烯微球上固定的链霉亲和素结合，洗涤后加入525nm量子点以及655nm量子点，反应结束洗涤后解离量子点测定得出CEA和NSE浓度。本发明方法能够同时识别检测两种癌症指标癌胚抗原(CEA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。具体而言，本发明方法一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法，其特征在于，其包括步骤1)制备链霉亲和素-聚苯乙烯微球复合物；2)制备FITC标记的NSE标记抗体；3)制备生物素化的CEA和NSE标记抗体；4)荧光检测。本发明方法中，利用EDC反应在聚苯乙烯微球上结合链霉亲和素，其形成的链霉亲和素-聚苯乙烯微球作为富集和分离载体，用来进行两种肿瘤标志物检测。本发明方法中，分别制备CEA、NSE肿瘤标志物的生物素化的包被抗体以及FITC标记NSE标记抗体。本发明方法中，首先混合CEA和NSE肿瘤标志物的生物素化的包被抗体，标准溶液或者血清样品中的CEA、NSE,分别制备的兔抗CEA标记抗体和FITC标记的NSE标记抗体； 加入富集和分离载体链霉亲和素-聚苯乙烯微球；随后加入抗兔525nm量子点以及抗FITC 的655nm量子点，洗涤解离后，测定355nm激发525nm和655nm处上清液荧光强度。本发明方法中，将两种生物素化的包被抗体混合后，加入含有CEA、NSE的两种肿瘤标志物标准溶液或者血清样品，于37°C反应Ih;该步骤结束后，不经洗涤直接结合兔抗 CEA标记抗体和FITC标记的NSE标记抗体，于37°C反应Ih ；该步骤结束后，不经洗涤直接加入至所制备的链霉亲和素-聚苯乙烯微球中，于37°C反应Ih;该步骤结束后，经洗涤加入
4抗兔525nm量子点以及抗FITC的655nm量子点于37°C反应lh。本发明方法中，利用含有8M尿素、10% SDS的0. IM PBS溶液解离量子点。本发明方法中，使用2种荧光量子点同时测定两种肿瘤标志物CEA和NSE。本发明方法并不局限于检测血清标志物CEA和NSE，也可以检测其它血清标志物或两种以上血清标志物。本发明方法中，并不局限于使用2种荧光量子点测定肿瘤标志物，还可以使用其它具有类似荧光特性的纳米颗粒测定肿瘤标志物。本发明方法的测定步骤在同一台仪器上进行测定。本发明的有益效果在于，本发明方法的优点有1，对原发性肺癌、肺良性疾病及健康人群进行血清癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和细胞角质素片断19(CYFRA21-1)检测，通过评估得知其在肺癌的早期诊断、病理分型及疗效判断中的意义；2，本方法能够同时识别检测两种癌症指标癌胚抗原(CEA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)；3，本方法血清用量小，多指标同时检测，检测时间快，诊断费用低，操作简单，适合推广，为目前肺癌等重大疾病早期诊断技术能够取得重大突破提供正确参考方向。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明方法进行详细地描述。 需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。


图1是本发明方法的原理图。
具体实施例方式实施例11)制备链霉亲和素-聚苯乙烯微球复合物典型步骤如下首先将500 μ L羧基聚苯乙烯微球移入一个1. 5mL的离心管中，利用pH = 6. 0的咪唑溶液(0. 1M)离心12000rpm洗涤三次后加入100 μ L溶有30mgEDC的咪唑溶液于37°C活化30min ；随后用咪唑溶液离心洗涤活化后的聚苯乙烯微球三次，最后分散于500 μ L咪唑溶液后；随后加入链霉亲和素200 μ L(0. 2mg)，37°C下反应池；PBSTW洗液洗涤三次后，加入含有2% BSA的PBS溶液500 μ L，37°C封闭Ih ；链霉亲和素-聚苯乙烯微球复合物洗涤后，保存在500 μ L含有2% BSA的PBS溶液待用。2)制备FITC标记的NSE标记抗体典型步骤如下浓缩150 μ LNSE抗体至90 μ L，ρΗ9. 2的0. IM碳酸钠/碳酸氢钠溶液中，随后加入 ο μ L的异硫氰酸荧光素(FITC)的0. IM碳酸钠碳酸氢钠溶液，在0. IM碳酸钠/碳酸氢钠溶液中透析12h，再利用PBS溶液透析12h，随后浓缩溶液至150 μ L待用， 用紫外分光光度法测得蛋白浓度为ang/mL。3)制备生物素化的CEA和NSE标记抗体
典型步骤如下将100 μ LCEA或NSE标记抗体去除杂质后，溶于100 μ LPBS中，加入5 μ L 0. IM溶于DMF的NHS化生物素(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)于4°C反应2.证，然后利用PBS透析过夜，浓缩至100 μ L待用，用紫外分光光度法测定并且调节蛋白浓度为aiig/
mLo4)荧光检测典型步骤如下CEA和NSE生物素化包被抗体各0. 0625 μ L加入到25 μ L含有 2% BSA,0. 5% Triton-X 100的0. IMPBS中于1. 5mL离心管中，加入标准样品或者待测样品25 μ L于37°C下反应lh，再加入25 μ L含有0. 5 μ L兔抗CEA抗体和0. 5 μ LFITC标记的 NSE标记抗体于37°C下反应Ih ；取10 μ L链霉亲和素-聚苯乙烯微球复合物洗涤一次后，用 2% BSA,0. 5% Triton-X 100的0. IMPBS稀释为50 μ L，然后加入上述抗体-抗原-标记抗体溶液50μ L，37°C反应Ih ；用含有0. 5% Tween 20的0. IM PBS洗涤3次后，加入1 500 倍稀释的抗兔525nm量子点以及抗FITC的655nm量子点100yL，37°C反应Ih ；反应结束后用 0.5% Tween 20 的 0. IM PBS 洗涤 3 次，再用 150 μ L 含有 8M 尿素、10% SDS 的 0. IMPBS 溶液解离量子点，30min后过滤洗涤溶液；355nm激发，525nm和655nm处测定上清液荧光强度定量血清中CEA和NSE含量。
权利要求
1.一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法，其特征在于，通过癌胚抗原CEA和神经元特异性烯醇化酶NSE生物素化包被抗体与标准样品或者待测样品反应后，直接加入兔抗CEA抗体和FITC标记的NSE标记抗体，反应形成抗原抗体复合物后与聚苯乙烯微球上固定的链霉亲和素结合，洗涤后加入525nm荧光量子点以及655nm荧光量子点，反应结束洗涤后解离量子点，同时测定得出癌胚抗原CEA和神经元特异性烯醇化酶NSE浓度，其包括步骤1)制备链霉亲和素-聚苯乙烯微球复合物；2)制备FITC标记的NSE标记抗体；3)制备生物素化的CEA和NSE标记抗体；4)荧光检测。
2.按权利要求1所述的均相荧光同时检测多种血清标志物的方法，其特征在于，所述的步骤1)中，利用EDC反应在聚苯乙烯微球上结合链霉亲和素，其形成的链霉亲和素-聚苯乙烯微球作为富集和分离载体。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法中，分别制备CEA、NSE肿瘤标志物的生物素化的包被抗体以及FITC标记NSE标记抗体。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法中，将CEA、NSE肿瘤标志物的生物素化的包被抗体混合后，加入含有CEA、NSE的两种肿瘤标志物标准溶液或者血清样品， 于37°C反应Ih0
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤结束后，不经洗涤直接结合兔抗 CEA标记抗体和FITC标记的NSE标记抗体，于37°C反应Ih。
6.按权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤结束后，不经洗涤直接加入至所制备的链霉亲和素-聚苯乙烯微球中，于37°C反应lh。
7.按权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤结束后，经洗涤加入抗兔525nm量子点以及抗FITC的655nm量子点，于37°C反应lh。
8.按权利要求1或7所述的方法，其特征在于，用含有8M尿素、10%SDS的0. IM PBS 溶液解离量子点。
9.按权利要求1所述的方法，其特征在于，用2种荧光量子点同时测定两种肿瘤标志物 CEA 禾口 NSE0
10.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血清标志物还包括其它血清标志物或两种以上血清标志物。
11.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光还包括其它具有类似荧光特性的纳米颗粒。
12.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的的测定步骤采用同一台测定仪器。
全文摘要
本发明属生物医学及检测领域，涉及一种均相荧光同时检测多种血清标志物的方法。该方法通过癌胚抗原CEA和神经元特异性烯醇化酶NSE生物素化包被抗体与标准样品或者待测样品反应后，直接加入兔抗CEA抗体和FITC标记的NSE标记抗体，反应形成抗原抗体复合物后与聚苯乙烯微球上固定的链霉亲和素结合，洗涤后加入两种荧光量子点，反应结束洗涤后解离量子点，同时测定得出癌胚抗原CEA和神经元特异性烯醇化酶NSE浓度，本方法血清用量小，多指标同时检测，检测时间快，诊断费用低，操作简单，适合推广，能为临床肿瘤等重大疾病早期诊治提供正确参考方向。
文档编号G01N33/545GK102375057SQ201010250060
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者刘彩云, 卢建忠, 曹志娟, 李欢 申请人:复旦大学