专利名称：己烯雌酚elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物源性食品中药物残留量的检测试剂盒，特别 是检测动物源性食品中己烯雌酚残留量的试剂盒。 背景技术：
己烯雌酚是一种人工合成的非甾体雌激素，因其能促进蛋白质合 成代谢，使动物日益增重，并能提高饲料功效，被大量非法应用。但由于己烯雌酚存在明显 的致癌性，可导致女性及其后代的生殖器官畸形和癌变，欧美等发达国家已相继禁止或严 格禁止使用。我国农业部第235号文件中规定，动物源性食品中己烯雌酚的残留限量为不 得检出。 目前，己烯雌酚的测定方法主要有生物测定法和气相色谱法等。微生物测定法虽 然经济，操作简便，但在样本中有其他微生物抑制剂存在时，其灵敏度和特异性受到限制； 气相色谱分析法的样本前处理及其测定操作繁琐，费用高，不宜于大量样本筛查，推广使用 受到限制。本发明试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，操作时间少， 能最大限度地减少操作误差和工作强度。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的己烯雌 酚残留检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术 含量不高，可进行一次连续多个样品中己烯雌酚含量的测定，减少了检测样本所需要的时 间。 本实用新型的技术方案是检测动物源性食品中己烯雌酚残留量的酶联免疫试剂 盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一 个自封袋、一份说明书和一份质检报告。采用96孔聚苯乙烯酶标板作为固相载体，酶标板 由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔 条有8个反应孔，在试剂盒酶标板微孔条上预包被己烯雌酚偶联抗原制成检测板，放入真 空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，以塑料硬膜为盖板膜，将6瓶0. 5ml梯度浓度的标准品浓縮液、 lml高浓度标准品溶液、12ml酶标二抗、0. 8ml己烯雌酚抗体浓縮液、7ml显色液A液、7ml 显色液B液、7ml终止液、40ml浓縮洗涤液、50ml浓縮复溶液，试剂用不同大小、不同颜色的 塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在泡沫塑料模具中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明书、质检报 告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定 (包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。将 剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样本 中的残留的己烯雌酚药物将和酶标板微孔条上预包被的偶联己烯雌酚抗原竞争抗己烯雌 酚抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与样本中己烯雌酚的残留量成负相 关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中己烯雌酚药物的残留量，其 操作简便易行。 经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼样品的最低 检测限为0. 6 ii g/kg、饲料样品最低检测限为48 ii g/kg、尿液样品最低检测限为0. 6ug/L ; 组织样品的回收率为80 % ± 10 % 、饲料样品的回收率为90 % ± 10 % 、尿液样品的回收率 为70% ±15% ;本试剂盒同炔雌醇、雌酚酮、苯甲酸己烯雌酚、雌三醇的交叉反应率均小于0. 1%。相对于其他己烯雌酚残留检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、匀质 器、振荡器、微量移液器和氮气吹干仪等实验室常规仪器，同类实验室一般均有配备，所需 成本较低。 本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于己烯雌酚药物残留的 检测。


图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm); 图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm); 图3为本实用新型酶联板的俯视图； 图4为本实用新型盖板膜平面图； 图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图； 图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图； 图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。 参见附图酶标反应微孔条(2)预包被己烯雌酚偶联抗原(3)固定于酶标板的外 框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板恒温箱内反应 时封盖酶标反应微孔条(2)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半透明塑料 试剂瓶(5)用于封装40ml浓縮洗涤液；蓝色帽的半透明塑料试剂瓶(5)用于封装50ml浓 縮复溶液；白色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6)的黑色 塑料试剂瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色塑料试剂瓶(7)用于封装7ml 终止液，绿色帽的白色塑料试剂瓶(8)用于封装O. 8ml己烯雌酚抗体浓縮液，红色帽的白色 塑料试剂瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装0. 5ml/ 瓶的标准品溶液及lml高浓度标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次 为40ml浓縮洗涤液瓶位(18) ， 50ml浓縮复溶液(11) ， 7ml显色液A液瓶位(14) ， 7ml显色 液B液瓶位(13) ， 7ml终止液瓶位(12) 、0. 8ml己烯雌酚抗体浓縮液瓶位(16) ， 12ml酶标二 抗瓶位(15)，6种0. 5ml/瓶各种浓度的标准品溶液及l瓶lml高浓度标准品溶液瓶位(17)， 盒体(19)是硬纸盒。
具体实施方式
: —、样本的前处理 1.配液 配液1 :lmol/L氢氧化钠溶液(饲料专用) 称取4. 0g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml 配液2 :2mol/L氢氧化钠溶液(组织专用) 称取8. 0g氢氧化钠加去离子水溶解定容至100ml 配液3 :乙月青-丙酮溶液(组织专用) 量取80ml无水乙腈到20ml丙酮中混匀 配液4 :6mol/L磷酸溶液[0026] 量取100ml浓磷酸到150ml去离子水中混匀 配液5:复溶工作液 用去离子水将10X浓縮复溶液按1 : 9体积比进行稀释(1份10X浓縮复溶液 +9份去离子水)用于抗体浓縮液的稀释及提取样本的复溶。 配液6 :洗涤工作液 用去离子水将20X浓縮洗涤液按1 : 19体积比进行稀释(1份20X浓縮洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4t:环境可保存一个月。 配液7:标准品工作液 用复溶工作液将每瓶标准品浓縮液根据所需量按1 : 9体积比进行稀释(1份标
准品浓縮液+9份复溶工作液)标准品工作液在4t:环境可保存半天。 2.样本前处理 组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)样本 用均质器均质组织样本；称取2. 0±0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入 6ml乙腈-丙酮溶液，用振荡器振荡10min，4000rpm/min， 15"C离心5min ;取出3ml上清液 至10ml干净的玻璃试管中，于50 6(TC氮气流下吹干；加入O. 5ml三氯甲烷溶解干燥的残 留物，用涡旋仪涡动20s，加入2mol/L氢氧化钠溶液2ml，用涡旋仪涡动30s， 4000rpm/min， 15t:离心5min ;取lml上清液至10ml干净的玻璃试管中，加入6mol/L磷酸溶液200 yl，用 涡旋仪涡动5s ;加入3ml乙腈，用振荡器振荡10min，4000rpm/min，室温离心5min，取上层 有机相lml至10ml干净的玻璃试管中，于50 6(TC氮气流下吹干；用lml复溶工作液溶 解干燥的残留物；取50iU用于检测。 尿液样本 取2ml尿液至10ml玻璃离心管中，4000rpm/min，室温离心10min，直至清亮；移取 lml清亮尿液至50ml干净的聚苯乙烯离心管中，加入lmol/L氢氧化钠溶液lml，用振荡器 振荡5min ;加入6mol/L磷酸溶液100iil，用涡旋仪涡动30s ;再加入8ml三氯甲烷进行萃 取，用振荡器振荡10min，4000rpm/min， 15。C离心5min ;去掉上层的水相，取下层有机相4ml 至10ml干净的玻璃试管中，于50 6(TC氮气流下吹干；用3ml复溶工作液溶解干燥的残 留物；取50iU用于分析。 饲料样本 称取2.0士0.05g粉粹后的饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入8ml乙腈， 用振荡器振荡10min，4000rpm/min， 15"离心5min ;移取2ml上清液至10ml干净的玻璃试 管中，于50 6(TC氮气流下吹干；加入0. 5ml三氯甲烷溶解干燥的残留物，用涡旋仪涡动 20s，加入lmol/L氢氧化钠溶液2ml，用涡旋仪涡动30s，4000rpm/min， 15。C离心5min ;取 lml上清液至2ml干净的聚苯乙烯离心管中，加入6mol/L磷酸溶液100iU，用涡旋仪涡动 30s ;取25 iil至5ml干净的聚苯乙烯离心管中，加入2975 y 1复溶工作液，用涡旋仪涡动混 匀，取50iU用于分析。
注如添加的浓度除以稀释倍数得到的值还大于8. 1时请扩大稀释倍数(如将
样本稀释到960倍)，避免检测的结果超出曲线范围导致结果偏大，使用软件处理数据时一
定要使用样本实际稀释倍数。 二、使用试剂盒的操作步骤[0042] 1、从4t:冷藏环境中取出所需试剂，置室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8t:。 3、洗涤工作液在使用前也需回温。 4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。 5、抗体工作液的稀释将抗体浓縮液用复溶工作液按照1 : IO体积比进行稀释 (1份抗体浓縮液加入10份复溶工作液)。 6、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 ii 1/孔到各自的微 孔中，然后加抗体工作液50 iU/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37t:避光环境中反 应30min。 7、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 iU/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔IO秒，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳 破)。 8、加酶标二抗加入酶标二抗100iil/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37t: 避光环境中反应30min。取出重复洗板步骤7。 9、显色加入底物液A液50iil/孔，再加B液50ia/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜 盖板后置37t:避光环境中避光反应15min。 10、测定加入终止液50 ii 1/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处(建议用 双波长450/630nm检测，在5min内读完数据)，测定每孔OD值。 三、结果判定 结果判定有两种方法，粗略判定可用第l种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与其所含己烯雌酚成负相关。 1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。假设样 本1的吸光度值为0. 112，样本2的吸光度值为0. 820，标准液吸光度值分别是Oii g/L为 1. 752 ;0. 1 y g/L为1. 320 ;0. 3 ii g/L为0. 897 ;0. 9 ii g/L为0. 462 ;2. 7 ii g/L为0. 189 ; 8. 1 y g/L为0. 058。则样本1的浓度范围是2. 7 y g/L_8. 1 y g/L再乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中己烯雌酚残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 3 ii g/L-O. 9 y g/L再乘 以其对应的稀释倍数即可得出样本中己烯雌酚残留的浓度范围。 2、定量分析 (1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸
光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(O标准)的吸
光度值，再乘以100%，艮卩 百分吸光度值(％ ) = B/B。X 100% B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B。-0 ii g/L标准溶液的平均吸光度值 (2)标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率为纵坐标，以己烯雌酚标准品浓度(P g/L)的半对数为横坐 标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中己烯雌酚的实际残留量。 若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。 四、测定前的注意事项 1、室温低于2(TC或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的0D值 偏低。 2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性
不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。 3、每加一种试剂前需要将其摇匀。 4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。 5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中 的试剂。 6、储存条件 保存试剂盒于2-8 °C ，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质 和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。 7、试剂变质的迹象 发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。 8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色时间为15min即可。若颜色较浅，
可延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。 9、该试剂盒最佳反应温度为37t:，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度
发生变化。
权利要求一种检测动物源性食品中的己烯雌酚的ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被己烯雌酚偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为6瓶标准品浓缩液、1瓶高浓度标准品溶液、酶标二抗、己烯雌酚抗体浓缩液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品浓縮液和高浓度标准品溶液均用白色 帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗用红色帽的白色PE塑料瓶，己烯雌酚抗体浓縮液用绿色帽的白 色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料 瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓縮洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓縮复溶 液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶；下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3. 根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的可 拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预 包被己烯雌酚偶联抗原；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品浓縮液6瓶，O. 5ml/ 瓶，浓度分别为0ii g/L，lii g/L，3ii g/L，9ii g/L，27ii g/L，81ii g/L ;高浓度标准品溶液1 瓶，lml ;酶标二抗1瓶，12ml ;己烯雌酚抗体浓縮液1瓶，0. 8ml ;显色液A液1瓶，7ml ;显色 液B液1瓶，7ml ;终止液1瓶，7ml ;浓縮洗涤液1瓶，40ml ;浓縮复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物源性食品中己烯雌酚残留的ELISA检测试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、己烯雌酚抗体浓缩液、己烯雌酚6个浓度标准品浓缩液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、高浓度标准品溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的己烯雌酚将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗己烯雌酚抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含己烯雌酚的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中己烯雌酚的残留量。与仪器分析技术相比具有操作简便、费用低廉、灵敏度高等特点。
文档编号G01N33/545GK201535775SQ200920173200
公开日2010年7月28日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者万宇平, 何方洋, 余厚美, 冯才伟, 冯才茂, 刘玉梅, 李勇, 汪善良, 罗晓琴, 蒲晓容, 赵正苗 申请人:北京望尔康泰生物技术有限公司;北京望尔生物技术有限公司