专利名称：一种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸毒性的方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸毒性的方法，属于环境检测技术领域。
背景技术：
由于具有疏水疏油性等非常独特的物理化学性质，全氟辛烷磺酸(PFOS)被广泛的应用于エ业、商业和个人消费品中，如可用作疏水疏油抗污剂(地毯、纺织、室内装璜、皮革、纸质产品等)、阻燃剂(航空航天、消防) 、表面活性剂(灭火泡沫、碱性清洁剂)、光致抗蚀剂(半导体エ业)、电镀抗雾剂、相纸抗静电剂、涂料添加剂等，并可作为杀虫剂、除草剤、润滑剂、粘合剂和化妆品的成分等。目前，在废水和污泥、地表水、地下水、海水、海底沉积物和饮用水(自来水)中都检测到了不同浓度的PFOSt5PFOS除具有抗酸、抗碱、抗氧化剂和抗还原剂的能力，能耐水解、光解、生物降解等作用，还可以通过食物链积累，其在生物体内的蓄积水平远高于有机氯农药和ニ噁英等持久性有机污染物。近年来关于检测PFOS的生态毒性的研究主要集中在小鼠等哺乳动物以及斑马鱼、大型蚤等水生生物，现存方法中PFOS处理浓度远高于自然界中PFOS的存在浓度，很难真实反应自然环境中PFOS的生态干扰。且实验周期长，不易观察对后代的影响，试验成本较高。轮虫是广泛分布于各类水体中的ー类浮游动物。它们以藻类、细菌等为食物，同时又是鱼类幼苗和某些无脊椎动物等的良好饵料。轮虫繁殖快，对藻类食物的同化效率高达20-80 %，在水生态系统的物质循环和能量流动中起重要的枢纽作用。而且，轮虫与其它枝角类和桡足类等竞争食物，影响水生生物群落的组成。轮虫的分布广泛、繁殖迅速、世代时间短，其存活、繁殖和行为等对环境理化因子的变化敏感，以轮虫为受试生物进行的毒理实验过程的标准化等使其成为水生态毒理学研究的模式生物之一，并被广泛用于水环境的监測。1999年，美国环保局正式把萼花臂尾轮虫和褶皱臂尾轮虫分别作为淡水和海水污染的指示动物列入国家测试标准(ASTM，1999)。目前，在轮虫的水生态毒理学研究中主要涉及的是重金属离子化合物、雌激素、多氯联苯、多环芳烃、及农药类污染物，而PFOS对轮虫的毒性的未见报道。本发明提供了一种可以通过轮虫的生命表变化来判断PFOS毒性的方法，材料易得、实验周期短、便于观察PFOS对后代以及整个种群的影响、测试用量少、成本低。

发明内容
本发明的目的在于提供ー种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，即通过检测轮虫在PFOS存在的情况下其无性生殖策略、有性生殖策略及个体大小的变化来检测PFOS毒性的目的；此方法用很少的测试液、在较短的时间内、以简单的实验过程体现了轮虫的各发育阶段和轮虫生活史的全过程(如发育、性成熟、种群增长和生殖)；除此之外，还能估计到子一代轮虫的生殖能力。本发明所采用的技术方案如下所述
ー种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步骤如下I)轮虫的培养用轮虫培养液对轮虫进行“克隆”培养，以绿藻培养液培养的、处于指数增长期的淡水緑藻为饵料，培养时间为六个月以上，实验前用轮虫培养液对轮虫进行两周以上的预培养，培养在20±1°C、持续光照条件下进行；2)急性毒性试验将全氟辛烷磺酸(PFOS)设为100. 0、1 0. 0、1.0、0. I和O. 01mg/L 5个浓度梯度，每个梯度设置4个重复，另设I个空白对照，从预培养的试管中随机吸取带非混交卵的轮虫雌体若干个置于培养皿中进行培养，2h后收集孵化出的轮虫幼体，将轮虫幼体放入六孔板中，加入测试液，试验在20± I°C、无光照的恒温培养箱中进行，采用机率単位法分别求得其LC50 值；3)測定不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响通过种群增长率实验评价不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响，96h后，对每个试管中轮虫的非混交雌体、混交雌体和不带卵雌体分别进行计数，然后全数返回原培养器皿继续培养24h，之后对混交雌体所携帯的休眠卵及试管底部沉积的休眠卵进行计数；4)测定不同浓度PFOS对轮虫生殖策略的影响设置了不同浓度PF0S，另加I个空白对照(轮虫培养液)用于生命表实验，记录轮虫产第一枚卵所需的时间；并测量其体长体宽，检测PFOS对其生长发育的影响；之后记录轮虫的产卵数、孵化出的幼体数和母体存活情況，并记录第二代幼体非混交雌体与混交雌体的比例，由此进行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。本发明的方法中，所述的轮虫培养液为MBL培养液。本发明的方法中，步骤4中所述的PFOS浓度为O. 01,0. I和I. Omg/L。本发明的方法中，所述轮虫优选为萼花臂尾轮虫。
具体实施例方式下面将结合实施例进行详细说明，以对本发明方法的目的、特征和优点有更深入的了解。以下的实施例具体解释本发明，本发明的范围不受实施例的限制。实施例I本实施例涉及到利用萼花臂尾轮虫检测水中PFOS毒性的方法，包括如下步骤，其中步骤4中所述的PFOS浓度为O. Olmg/L。I.轮虫的来源和培养首先采集受试萼花臂尾轮虫，实验室内用轮虫培养液对其进行“克隆”培养，以绿藻培养液培养的、处于指数增长期的淡水緑藻(C. pyrenoidosa)为饵料，培养时间为六个月以上，实验前用改良的轮虫培养液配方(USEPA，1985)的轮虫培养液对轮虫进行两周以上的预培养，预培养时每天投喂密度为I. OXlO6ceIls · ml/1的绿藻，培养在20±1°C、持续光照条件下(30001x)。2.急性毒性试验全氟辛烷磺酸(PFOS)购自Sigma-Aldrich,^ (PFOS)设为 100. 0,10. O、I. 0,0. I和0. 01mg/L 5个浓度梯度，每个梯度设置4个重复，另设I个空白对照(EPA培养基)。测试液的配制采用母液稀释的方法，先用蒸馏水配制I. Og/L的母液，然后用EPA培养基(不含藻食物)稀释得到不同浓度的PFOS测试液，从预培养的试管中随机吸取带非混交卵的轮虫雌体若干个置于培养皿中进行培养，2h后收集孵化出的轮虫幼体，每10个轮虫幼体放入容积为IOmL的六孔板中，加入5mL测试液，试验在(20±1)で、无光照的恒温培养箱中进行，采用机率単位法分别求得其LC50值。3.不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响通过种群增长率实验评价不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响，该实验在六孔板中进行。在每个孔中放入龄长小于2h的轮虫幼体15个，并添加配制好的各浓度PFOS溶液至10ml，饵料为I. OX 106cells/L的绿藻，PFOS浓度设置为5组，分别为O. 125,0. 25、
O.5、I. 0、2. Omg/L并设I个对照组(培养液不含 PF0S);每组均设4个重复，实验在温度为(20±1)°C的恒温培养箱中进行。实验过程中，每12h悬浮沉积于试管底部的藻类食物，每24h更换内含I. OX 106cells/L绿藻的测试液，96h后，对每个试管中轮虫的非混交雌体、混交雌体和不带卵雌体分别进行计数，然后全数返回原培养器皿继续培养24h，之后对混交雌体所携帯的休眠卵及试管底部沉积的休眠卵进行计数，种群增长率试验结果显示O. 125mg/L的PFOS对轮虫种群增长率影响差异不显著，其余四种浓度(O. 25、0. 5、1.0、2.0mg/L)的PFOS对轮虫种群增长率影响差异显著。4.不同浓度PFOS对轮虫生殖策略的影响选用浓度为O. 01mg/L的PFOS用于生命表实验，生命表实验在特制的24孔塑料板中进行，每孔中放入一个龄长在2h内的幼体，加入ImL的测试液，实验开始的48h内，每隔3h观察一次，记录轮虫产第一枚卵所需的时间；32h时测量其体长体宽，检测PFOS对其生长发育的影响；之后每8h观察一次，记录轮虫的产卵数、孵化出的幼体数和母体存活情況，并移去幼体至96孔板，记录第二代幼体非混交雌体与混交雌体的比例；每间隔24h将存活的母体转移到新鮮的测试液中，实验结果显示0. 01mg/L的PFOS处理延长了轮虫幼体阶段历时，降低了种群中的混交雌体百分率，进而影响下一代种群中雌雄比例，对产卵量无明显影响。实施例2以浓度为O. lmg/L的PFOS溶液来代替实施例I中的步骤4中O. 01mg/L的PFOS溶液，其他条件同实施例I。实验表明，0. lmg/L的PFOS处理延长了轮虫幼体阶段历时、缩短了轮虫的平均寿命、降低了种群中的混交雌体百分率，进而影响下一代种群中雌雄比例，对产卵量无明显影响。实施例3以浓度为I. 0mg/L的PFOS溶液来代替实施例I中的步骤4中0. 01mg/L的PFOS溶液，其他条件同实施例I。实验表明，I. 0mg/L的PFOS处理抑制了轮虫的生长、延长了轮虫幼体阶段历时、缩短了轮虫的平均寿命、降低了种群中的混交雌体百分率，进而影响下ー代种群中雌雄比例，且大大抑制了轮虫的产卵量。实施例1，2，3实验结果如表I所示表I.暴露在不同浓度PFOS下(mg/L)的萼花臂尾轮虫的幼体期时间(T)、平均寿命(ML)、平均产卵量(EQ)及混交雌体数/非混交雌体数的比例(MF/AF)。
权利要求
1.ー种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的方法，包括步骤如下 1)轮虫的培养 用轮虫培养液对轮虫进行“克隆”培养，以绿藻培养液培养的、处于指数增长期的淡水緑藻为饵料，培养时间为六个月以上，实验前用轮虫培养液对轮虫进行两周以上的预培养，培养在20 ± Iで、持续光照条件下进行； 2)急性毒性试验 将全氟辛烷磺酸(PFOS)设为100. O、10. O、I. 0、0. I和O. 01mg/L 5个浓度梯度，每个梯度设置4个重复，另设I个空白对照，从预培养的试管中随机吸取带非混交卵的轮虫雌体若干个置于培养皿中进行培养，2h后收集孵化出的轮虫幼体，将轮虫幼体放入六孔板中，加入测试液，试验在20±1°C、无光照的恒温培养箱中进行，采用机率単位法分别求得其LC50值； 3)測定不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响 通过种群增长率实验评价不同浓度PFOS对轮虫种群增长率的影响，96h后，对每个试管中轮虫的非混交雌体、混交雌体和不带卵雌体分别进行计数，然后全数返回原培养器皿继续培养24h，之后对混交雌体所携帯的休眠卵及试管底部沉积的休眠卵进行计数； 4)測定不同浓度PFOS对轮虫生殖策略的影响 设置了不同浓度PF0S，另加I个空白对照(轮虫培养液)用于生命表实验，记录轮虫产第一枚卵所需的时间；并测量其体长体宽，检测PFOS对其生长发育的影响；之后记录轮虫的产卵数、孵化出的幼体数和母体存活情況，并记录第二代幼体非混交雌体与混交雌体的比例，由此进行水中全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性的測定。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的轮虫培养液为MBL培养液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤4中所述的PFOS浓度为O.01,0. I和1.Omg/し
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述轮虫为萼花臂尾轮虫。
全文摘要
本发明涉及一种利用轮虫检测水中全氟辛烷磺酸(PFOS)生物毒性的方法，属于环境检测技术领域。具体是选用轮虫作为模式生物，此种生物分布广泛、繁殖迅速、世代时间短，存活、繁殖和行为等对环境理化因子的变化敏感；通过不同浓度的PFOS水溶液对轮虫种群密度的改变评价其对生态系统的影响，然后以其对轮虫生活史的影响确定PFOS的作用机制。本发明克服了目前测定水中PFOS生物毒性中周期长、操作复杂的困难，提供了一个简便、灵敏、系统的检测水中PFOS毒性的方法，该方法方便、快速、成本低廉。
文档编号G01N33/00GK102692478SQ20121017360
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月31日 优先权日2012年5月31日
发明者孙栋, 张利兰, 牛军峰 申请人:北京师范大学