专利名称：用于制备和使用多重检测中的大孔珠粒的方法和体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及特别可用于多重检测的大孔粒子，以及这种粒子的制造方法和使用方法。
背景技术：
从20世纪50年代后期开始，一直在进行对大孔聚(苯乙烯-二乙烯基苯)微球的研究和开发。这些大孔微球具有与原子、离子和分子相互作用的能力。一般而言，大孔微球为孔径尺寸超过约20nm的微球。这些大孔微球为多孔的事实造成了在大孔微球的内部 “孔”以及外部表面上形成相互作用的独特能力。大孔微球的许多应用集中于用作离子交换树脂和用于液相色谱中。这些大孔微球的官能化导致它们用作分离介质。苯乙烯/二乙烯基苯共聚物的内部组成对于引入具有已知高交换能力的化合物和分子以及与具有已知高交换能力的化合物和分子反应是理想的。 还已发现大孔微球通过物理吸附感兴趣的材料在生物应用中的用途，其通常使用反相离子交换色谱，但是其他方法也是可能的并已有记载。阳离子交换树脂已通过用磺酸官能化大孔微球而制得，其可用于酸催化，并在文献中充分记载。在制备大孔微球的一种方法中，合成通过使用惰性稀释剂的悬浮聚合而完成。一旦聚合完成，除去惰性稀释剂，多孔结构保持在聚合物粒子内。在该方法中，制得的粒子相当大，但是多分散的。这些特性对于在色谱中使用(其中流动条件和填充效率是重要因素) 是不合意的。制备均勻聚合物大孔微球的另一方法采用种子乳液聚合以制备均勻的大孔微球。 该方法的一个变型采用线性聚苯乙烯与溶剂或非溶剂型稀释剂并制得大孔微球，取决于线性聚合物是与溶剂还是与非溶剂组合，该大孔微球具有控制孔体积和比表面积的一些能力。然而，需要相对较高水平的交联剂来产生具有高表面积的粒子。临床样本的分析在科学和医学中是重要的。本领域已知多种确定样本的定性和/ 或定量特性的检测。通过一步检测法检测多种分析物或可分别识别一种或更多种分析物的特性是已知的，但其具有一些局限性，如通常需要较长时间以能够检测和分类多种分析物和在检测中可获得的低灵敏度(低信号)。在单个检测过程中进行样本的同时、多种询问的能力称为“多重”，且实施这种能力的方法为“多重检测”。具有多重检测能力的一种公知的现有技术为流式细胞术。流式细胞术为使用称为流式细胞仪的仪器基于粒子的光学特性分析流体混合物中的特定粒子的光学技术。有关流式细胞术的背景信息可见于Siapiro/Tractical Flow Cytometry”，第三版(Alan R.LissJnc. 1995)；以及 Melamed 等人，“Flow Cytometry and Sorting”，第二版(Wiley-Liss 1990)，所述文献通过引用的方式并入本文。流式细胞仪以流体动力学方式将粒子的流体悬浮体汇集成细流，使得粒子以基本上单一纵列(file)的形式流下该细流并通过检查区域。当粒子流过检查区域时，如激光束的聚焦光束照射粒子。当光与粒子相互作用时，流式细胞仪内的光学检测器测量光的某些特性。常用的流式细胞仪，如可购自Luminex Corporation of Austin, Texas的检测体系可在一种或更多种波长下测量前向光散射(通常与照射中的粒子的折射率和尺寸相关)、 侧向光散射(通常与粒子尺寸相关)和粒子荧光。这种多重检测体系的另一实例为可购自Luminex Corporation of Austin,Texas 的xMAP 技术。所述xMAP技术使用一类染色粒子，在该染色粒子上可施加一种或更多种检测特异性试剂(例如通过偶联到粒子表面上的一种或更多种官能团)。粒子平台采用通过荧光可区别的不同粒子组。例如，粒子组可通过荧光波长、荧光强度、在不同波长下的荧光强度比等而得以区别。通常，荧光变化可通过将不同染料和/或荧光团引入粒子中和/ 或偶联至粒子表面来整合。在一些实施方式中，粒子组可另外通过尺寸和/或形状来区别。 在任何情况下，具有可区别的载体粒子的粒子平台通常是有利的，因为其利用流体基动力学使数种不同的分析物与检测特异性试剂结合。通常，每一种不同的粒子组可具有偶联至其上的不同试剂。不同试剂可选择性地与流体样品中的不同分析物反应。换言之，每一种不同的试剂可与样品中的一种分析物反应，但可以基本上不与样品中的任何其他分析物反应。在一些情况中，可使一种或更多种另外的可检测试剂与一种或更多种分析物反应。所述一种或更多种另外的试剂可通过荧光 (例如荧光波长、荧光强度等)进行检测(并有可能进行区别)。除了提高的反应动力学之外，多重检测平台的使用有利地允许使用者简单地将一种或更多种粒子亚组加入样品所暴露的群中，或者将一种或更多种粒子亚组从样品所暴露的群中除去，从而改变在研究之中的分析物。上述技术和方法不能在定量的单个或多重生物检测体系中利用大孔微球。Tuncel 等人，“Electron microscopic observation of uniform macroporous particles. I. Effect of seed latex type and diluent, "Journal of Applied Polymer Science，第 71 卷，第 14 期，1999，第 2271-2290 页；Ugelstad 的美国专利 No. 4，459，378 ；和 El-Aasser ^A "Synthesis and Characterization of Monodisperse Porous Polymer Particles, "Journal of Polymer Science =Part A，第 30 卷，1992，第 235-244 页描述了合成大孔微球的方法。美国专利 No. 7，141,431 ；5, 981, 180 ；6，632，526 ；6, 733,812 ； 7, 241, 883和7，274，316描述了用于多重生物检测的各种体系和方法。美国专利 No. 6，773，812描述了磁响应珠粒的制造和使用方法。本文引用的所有文献以引用方式并入本文，如同由法律或规定所允许的最大程度上地在本文中完全阐述那样。

发明内容
本发明使得能够在多重检测中使用大孔粒子并提供其制备和使用方法。这种大孔微球可通过如种子乳液、分散聚合、微乳液(mini-emulsion)、悬浮聚合的方法以及本领域技术人员公知的其他常规技术制得。广义而言，本文的大孔粒子具有多个大孔，其中粒子可例如通过包含一种或更多种荧光染料或者借助尺寸差异或光散射性质而彼此区别开来。在宽泛的形式中，进行多重检测的方法包括提供一组珠粒，其中至少一些珠粒是大孔的，其中所述珠粒可区分为至少两类。多重检测的方法包括将所述珠粒暴露于两种或更多种感兴趣的分析物，并确定哪类珠粒受所述感兴趣的分析物的影响。通常，根据本发明的制备大孔珠粒的方法起始于提供种粒子，将所述种粒子与单体和交联剂混合以使该种粒子溶胀。例如通过加热、超声、产生自由基或其他公知的引发聚合的常规方法聚合经溶胀的粒子。然后用合适的溶剂洗涤这些粒子以暴露大孔。优选地， 仅使用低水平的交联剂(例如< 15% )，这使得染料或其他区别材料(如磁性材料)更易于引入。本发明的大孔珠粒可制备为用于多重检测中是独特地可区别的。可在粒子形成过程中引入可区别的荧光染料。或者，荧光染料可在粒子形成之后与粒子缔合。材料如染料分子、纳米粒子、液晶、量子点、RF-发送器、放射性材料、磁响应材料或其他类似材料的引入可产生能够以多重形式使用的粒子。也预期可通过将识别码蚀刻进微球中而标记这些微球。 可在本发明中使用形成可区别的粒子的这些和其他方法。在本发明的描述中荧光将用作区别特性的例子，但对于本领域技术人员而言应当显而易见的是，区别一个粒子与另一个粒子的任意特性(如使用磁响应粒子)与本发明都是相容的。有利地，染色的大孔珠粒具有显著提高的表面积，这在多重检测过程中提高了信号。在一个特别优选的形式中，可使一种或更多种官能团引入染色的大孔珠粒中。有利地，在大孔珠粒的大孔和外部表面区域之间可存在不同的部分。即，大孔和外部的区别可在于官能团的存在与否，或者存在不同的官能团。


图1为使用扫描电子显微镜拍摄的根据本发明的大孔粒子的图像；图2为使用透射电子显微镜拍摄的根据本发明的大孔粒子的图像；图3为说明制备加入官能团的大孔粒子的优选方法的流程图；以及图4为说明使用封端剂制备具有官能团的大孔粒子的替代方法的流程图。优选实施方案的描述尽管本文针对“微球”或“粒子”描述了实施方案，应了解本文所述的体系和方法还可以与粒子、聚苯乙烯珠粒、微粒、纳米点、纳米粒子、纳米壳、珠粒、微珠、乳胶粒子、 乳胶珠粒、荧光珠粒、荧光粒子、着色粒子、着色珠粒、有机物、非有机物或本领域已知的任意其他离散物质一起使用。微球可用作分子反应的媒介。适当的粒子的实例在美国专利 No. 5，736，330 ；5，981，180 ；6，057，107 ；6，268，222 ；6，449，562 ；6，514，295 ；6，524，793 和 6，528，165中说明和描述，其以引用方式并入本文，如同它们在本文中完全阐述那样。本文所述的体系和方法可以与这些专利中描述的任意微球或粒子一起使用。术语“粒子”和“微球”和“珠粒”在本文中可互换使用。此外，与本文所述的体系和方法相容的粒子类型包括具有与粒子结合或与粒子缔合的荧光材料的粒子。可用于本文所述的方法和体系中的粒子类型包括具有引入至粒子核内的一种或更多种荧光染料或荧光性染料的粒子。还包括具有直接与粒子表面偶联的荧光染料或荧光粒子以提供分类荧光(即用于确定粒子身份或粒子所属的亚组而测得和使用的荧光发射)的粒子。用于使荧光染料与这种粒子缔合的方法在美国专利No. 6，268，222 和6，649，414中说明和描述，所述专利以引用方式并入本文，如同它们在本文中完全阐述那样。可用于本文所述的方法和体系中的粒子还包括当暴露于一种或更多种适当光源时其本身将显示出一种或更多种荧光信号的粒子。此外，可制备粒子，使得在激发时，粒子显示出一种或更多种荧光信号，每种所述荧光信号可单独使用或组合使用以确定粒子身份。如下文所述，图像数据处理可包括粒子的分类，特别是对于多分析物流体而言更是如此，以及与粒子结合的分析物的量的确定。本文所述的方法通常包括分析粒子的一幅或多幅图像，以及处理由图像测得的数据以确定粒子的一种或更多种特性，例如但不限于表示在多种检测波长下粒子的荧光发射量级的数值。粒子的一种或更多种特性的随后处理可根据美国专利No. 5，736，330 ； 5，981，180 ；6，449，562 ；6，524，793 ；6，592，822 和 6，939，720 中描述的方法进行，所述专利以引用方式并入本文，如同它们在本文中完全阐述那样。在一个实例中，在美国专利 No. 5，981，180中描述的技术可以在多重方案中与本文所述的荧光测量一起使用，其中粒子被分类为用于分析单个样品中的多种分析物的亚组。用于多重检测的微球的必需特性是其可独特地区别的能力。实现其的一种特别有效的方法是使用掺杂有染料分子或可用作识别剂的粒子的适当溶剂使包含聚合物的多孔珠粒溶胀。为了成功用于定量多重生物检测(其中珠粒本身可通过它们的荧光信号进行识别)，珠粒必须通过适合于所用的特定聚合物以及染料分子本身的溶剂进行溶胀。这可通过略微交联所述珠粒与如二乙烯基苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯等的单体(例如通过使用含有 <约25%交联剂，优选<约15%交联剂的溶液)来实现。相反，用于制备大孔珠粒的现有方法利用高水平的交联剂(例如>25%)以提供色谱法所需的高表面积和刚性。尽管一些溶胀在这些条件下仍可发生，但其远远低于制备含有足够水平的荧光染料分子的珠粒以生成适用于多重检测的可行的大孔珠粒所需的程度。在一方面，本发明通过有效增加珠粒的表面积而提高了多重检测体系中的信号和检测。优选采用改进的种子乳液技术合成根据本发明的大孔粒子。这涉及可溶性聚合物的种粒子的合成。优选的方法使用通过任意合适的方法(包括但不限于分散聚合、乳液聚合和悬浮聚合)制得的种粒子。将溶胀剂引入种粒子中以促进溶胀。一旦制得种粒子，随后将所述种粒子分散到合适的溶液中，所述溶液可含有能够乳化合适单体的表面活性剂和/ 或稳定剂。在本发明的一种方法中，单步种子乳液聚合使用线性聚苯乙烯种粒子作为大孔珠粒制备中的惰性稀释剂。所述方法采用低水平的交联剂；少于15%的二乙烯基苯或任意其他合适的交联剂。通过在乳液聚合步骤中包含特定比例的一种或更多种荧光染料，产生借助于其中所含的荧光标记物单独编码的粒子。转向附图，图3(a)_(e)显示了制备大孔粒子的一种方法，所述大孔粒子具有结合至其上的官能团以促进分析物质偶联至粒子。根据本发明，这种粒子特别可用于进行多重检测。(a)将种粒子6与具有混入其中的官能团载体(例如丙烯酸、甲基丙烯酸以提供羧基)的单体8 (例如苯乙烯、二乙烯基苯)以及水、表面活性剂和自由基引发剂混合，-任选地引入荧光染料、磁响应材料或其他粒状材料；(b)使种粒子溶胀；(c)施加热以引发聚合；(d)将聚合粒子10暴露于相同或不同的官能团12的载体以形成在粒子10的外部；
(e)在溶剂中洗涤粒子-溶剂洗去未交联形成孔14的种子聚合物。为了制备本发明的大孔粒子，包含种粒子6的线性聚合物必须具有足够的分子量，如本领域所公知地那样，从而适于制得具有大孔结构的最终粒子10。该参数通常经由操控单体8的聚合速率或通过使用链转移剂而得以动力学控制。聚合速率可通过使用自由基产生的不同方法或通过自由基引发剂本身的性质，或通过操控反应的加热分布来改变。图1、2和3所示的大孔粒子10由多种单体和共聚单体合成。通常，利用苯乙烯、 二乙烯基苯和其他共聚单体(如丙烯酸、甲基丙烯酸和多种其他单体)。这些的更全面但非穷举的清单可见于美国专利No. 7，141，431。优选地，单体单元移动至线性聚合物中被分散于能够稳定单体和线性聚合物的合适溶剂中。单体经过溶剂，并使线性聚合物溶胀至其体积的20-30倍和150倍或更大。施加能量源，最通常为热(优选方法)，其产生自由基级联 (cascade)并产生新的聚合物。可使用本领域技术人员已知的其他聚合引发方法。在优选的粒子制备方法中，单体还含有足够的交联剂，所述交联剂一旦聚合就生成交联的新的聚合物网络。所述新的聚合物与线性聚合物基本上不相容，并在之后除去线性聚合物。在此时形成交联的大孔粒子。大孔粒子10可通过使用成孔剂而获得。这些成孔剂主要由可引入可溶胀的聚合物粒子的溶剂和非溶剂组成。在聚合步骤过程中，由于新形成的交联聚合物相与成孔剂之间的不相容性，二者分离。在聚合完成之后，通过引入能够溶解成孔剂的溶剂而除去成孔剂，并获得多孔结构。除了使用溶剂和非溶剂作为可行的成孔剂之外，线性或非线性聚合物可在适当条件下用于获得相同的效果。更具体而言，当种粒子具有合适的分子量时，种粒子本身可用作成孔剂，如上所述。在本发明的另外的方面中，磁性和/或非磁性材料可与粒子缔合以便于粒子处理。这些材料的一些实例为铁的氧化和铁、钴、锰的络合物，金纳米粒子和其他材料。对于磁性种类，它们可为铁磁性、顺磁性或超顺磁性。或者，可使用本领域技术人员公知的许多其他物质。这些材料可以多种方式与粒子缔合。在一种方法中，所述材料可悬浮于单体混合物本身中。在聚合后，所述材料整合到粒子中。在另一方法中，可将单独的盐引入完成的粒子中，然后可原位形成所需的络合物。又一可能性是用所需络合物涂布完成的粒子。引入这种材料的另一种方法是通过在适当的溶剂如四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、苯或甲苯中使完成的粒子溶胀。所述材料(例如磁性材料)首先用促进迁移的有机材料(如油酸)涂布。这可能的原因之一是由于在本文优选实施方案中所用的低水平的交联剂(通常<约25%，优选< 15% )。该低水平的交联剂使得珠粒在很大程度上溶胀，从而允许材料的引入。一旦磁性和/或非磁性材料已经与粒子缔合，则所述材料可用另外的聚合物再涂布(overcoat)。在本发明的大孔珠粒的整个表面上分布的表面化学生成在其上进行偶联化学的理想基材。偶联可通过吸附至珠粒表面或者共价偶联珠粒表面上的反应性基团而实现。描述了用于制备在外部表面和内部孔表面上具有不同官能团的大孔珠粒的方法。有时有利的是，改变溶胀单体以包含可能具有特定兴趣的部分。这些的一些实例为羧酸酯、胺、亚胺、硫酸酯和其他。在线性聚合物的溶胀过程中加入含有特定官能团的物质，通常为单体。本发明的大孔粒子的一个特别的优点在于提供在粒子的孔结构内含有与外表面上的官能团不同的官能团的粒子。表1列出了可使用的常见官能团，但本领域技术人员会理解表1是非穷举的，而仅仅是示例性的。
有机化合物中的常见官能团
权利要求
1.适用于多重检测中的多个粒子，其包含一组具有低水平的交联剂的所述粒子，该一组粒子具有多个大孔并结合一种或更多种荧光染料，且可区别于其他所述粒子。
2.根据权利要求1所述的多个粒子，其中所述一组粒子中的至少一些是磁响应的。
3.根据权利要求1所述的多个粒子，其中所述一组粒子具有不同尺寸。
4.根据权利要求1所述的多个粒子，其中所述一组粒子具有与所述其他粒子不同的光散射性质。
5.多个大孔粒子，所述大孔粒子具有大于约20nm的孔，其中所述粒子的外部表面区域具有与所述孔的内部不同的部分。
6.根据权利要求5所述的多个大孔粒子，其中所述孔具有第一官能团，而所述表面区域具有第二官能团。
7.根据权利要求5所述的多个大孔粒子，其中所述孔不具有官能团，而所述表面区域具有官能团。
8.根据权利要求5所述的多个大孔粒子，其中所述孔具有官能团，而所述表面区域不具有官能团。
9.根据权利要求5所述的多个大孔粒子，其中每个所述粒子具有可区别的荧光发射。
10.一种进行多重检测的方法，其包括如下步骤提供一组珠粒，其中至少一些珠粒为大孔的并包含一种或更多种荧光染料，其中所述珠粒能够区别为至少两类；将所述珠粒暴露于两种或更多种感兴趣的分析物；以及确定哪类珠粒受所述感兴趣的分析物的影响。
11.根据权利要求10所述的方法，其中许多所述大孔珠粒能够通过磁响应来区别。
12.根据权利要求10所述的方法，其中许多所述大孔珠粒具有孔，所述孔具有与所述孔之外的外部表面区域不同的部分。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述孔具有第一官能团，而所述外部表面区域具有第二官能团。
14.一种制备大孔珠粒的方法，其包括a.提供具有多个聚合物链的种粒子；b.将所述种粒子与包含小于约25%的交联剂的单体混合物混合；c.使所述种粒子溶胀；d.引发经溶胀的所述粒子的聚合；e.在溶剂中洗涤经溶胀的所述粒子以露出大孔；以及f.在步骤a-e中的一个或更多个步骤过程中引入可区别的特性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述种粒子通过分散聚合、乳液聚合或悬浮聚合制得。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述聚合通过加热经溶胀的所述粒子而引发。
17.一种通过包括如下步骤的方法制得的大孔珠粒a.提供具有多个聚合物链的种粒子；b.将所述种粒子与含有小于约25%的交联剂的溶液混合；c.使所述种粒子溶胀；d.引发经溶胀的所述粒子的聚合；e.在溶剂中洗涤经溶胀的所述粒子以露出大孔；以及f.在步骤a-e中的一个或更多个步骤过程中引入可区别的特性。
18.—种多重检测，其使用如下物质进行(a)大孔珠粒，其中至少一些所述大孔珠粒具有孔，所述孔具有与外部表面不同的部分，以及(b)选自如下的其他所述珠粒i.无孔珠粒； .具有与(a)的尺寸不同的珠粒；iii.具有不同荧光信号的珠粒；和iv.通过具有不同磁特性而可区别的珠粒。
19.根据权利要求17所述的珠粒，还包括在所述洗涤步骤之前或之后任选地使官能团改性。
20.根据权利要求17所述的珠粒，其中将所述种粒子与单体和交联剂混合以使所述种粒子溶胀。
21.根据权利要求20所述的珠粒，其中小于15%的溶液为交联剂。
22.根据权利要求17所述的珠粒，其中所述可区别的特性为一种或更多种荧光染料。
23.根据权利要求17所述的珠粒，其中所述可区别的特性为一种或更多种磁性粒子。
24.根据权利要求19所述的珠粒，还通过引入作为第一活性基团的共聚单体而将所述粒子官能化。
25.根据权利要求M所述的珠粒，还使第二活性基团偶联至所述珠粒表面。
26.根据权利要求25所述的珠粒，还除去生孔材料以露出含有所述第一活性基团的孔。
27.根据权利要求M所述的珠粒，其中在除去生孔材料之后，引入封端剂以将所述第一活性基团保留在所述孔中。
28.根据权利要求14所述的方法，其中小于15%的混合物为交联剂。
29.根据权利要求14所述的方法，其中所述可区别的特性为一种或更多种荧光染料。
30.根据权利要求14所述的方法，还在所述洗涤步骤之前或之后使官能团改性。
全文摘要
公开了大孔珠粒和制备与使用这种大孔珠粒的方法，其中所述珠粒对于在多重检测中的用途是可区别的。优选地，所述珠粒可通过两种或更多种独特的荧光染料来区别，且至少一些珠粒是磁响应的。在一种优选的形式中，一些大孔珠粒具有与外部表面具有不同部分的内部孔，使得殊粒具有粘附的不同官能团。
文档编号G01N33/52GK102265155SQ200980144541
公开日2011年11月30日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者多恩·钱德勒, 本·迈兹, 詹森·贝德雷 申请人:卢米耐克斯公司