专利名称：Npm1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外诊断检测技术领域，具体涉及NPMl基因突变的液相芯片联合检 测方法及其诊断试剂盒。
背景技术：
核磷蛋白(nucleophosmiiNPM)基因定位于人类染色体5q35，含有12个外显子， 编码由294个氨基酸组成的NPM蛋白。NPMl参与核糖体的合成和中心体复制以调控细胞增 殖和周期进程。NPMl突变仅累及第12号外显子，目前有超过40种不同的突变亚型，其中 绝大多数包含了 12号外显子4个碱基的插入。其中最常见的是NPMl-mutA，占所有突变的 75% -80%，它是在野生型NPMl核苷酸序列上第956-959位上插入1个TCTG4个核苷酸而 形成串联重复序列。NPMl-mutB和NPMl-mutD各占10%和5%，分别插入的是CATG和CCTG ； 其余突变较少见。NPMl基因突变是目前急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中最常见 的突变形式，约占所有AML的35 %，而在正常核型的AML中可占46 % -62 %。AML是一组高 度异质性疾病，正常核型AML约占成人原发AML患者的40% -50%,是中危组细胞遗传学 分类中人数最多的一个亚型，也是目前研究的热点之一。最近国外几个大规模的多中心研 究相继显示，在具有分子异质性的正常核型AML患者中，46% -62%可检测到核磷蛋白成员 NPMl基因突变及(或)表达的改变，它在AML的诊断、分型及判断预后与监测微小残留病灶 等方面有重要价值。另外，近来有报道显示在骨髓增生异常综合症(MDS)患者中，也存在着NPMl突变。目前，白血病和骨髓增生异常综合症主要是依靠细胞形态学、免疫学、细胞遗传 学、分子生物学等检测方法来进行诊断和检测分型。细胞形态学受主观因素影响，临床诊断 的一致率仅为70%左右。核型分析和显带技术等细胞遗传学方法是在全基因组水平筛查 染色体易位，容易漏检许多染色体的微小异常。免疫学方法具有较高的假阳性率和假阴性 率，并且无法做到早期诊断。当前国内外广泛使用的分子生物学检测白血病基因突变的方 法中，荧光原位杂交技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存在着检测通 量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip) 技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种 检测方法，能够迅速、稳定、准确地对白血病的多种基因突变进行联合并行检测，液相芯片 (xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。液相芯片能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、 灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造 过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为 100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分 子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交 反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可
4以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列 快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红 色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧 光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激 发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特 定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽 等突出优点，对NPMl的多种基因突变进行联合并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。

发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种NPMl基因突变的联合检测方法及诊断 试剂盒。该方法及试剂盒包含对多种NPMl基因突变的联合检测，可以对急性髓系白血病 (AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断提供重要的参考依据，同时对患者进行疗 效观察、预后及微小残留疾病进行动态监测。本检测方法及诊断试剂盒具有高灵敏度、高特 异性、高准确度、检测迅速等优点。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下在本发明的一方面，提供一种NPMl基因突变的联合检测方法，包括以下步骤(1)包含多种不同荧光编码的羧基微球beads ；每种微球上分别共价结合针对 NPMl的多种突变基因的mRNA所设计的特异性核酸探针；所述NPMl的多种突变基因包含以 下任意一种基因或任意组合的多种基因NPMl-mutA(SPNPMl mutation ·Α)、NPMl_mutB (即 NPMl mutation B)、NPMl-mutD (艮口 NPMl mutation D)，即所述 NPMl 的多种突变基因可以 是NPMl-mutA、NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意一种或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB、NPMl-mutD中的任意两种基因组合或加上其它基因，也可以是NPMl_mutA、 NPMl-mutB和NPMl-mutD三种基因组合或加上其它基因；(2)针对多种不同的NPMl突变基因的mRNA，分别设计上下游引物，对不同的突变 基因的mRNA，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；(3)含有特异性核酸探针的微球与NPMl突变基因mRNA的逆转录扩增产物杂交后， 加入链霉亲和素_藻红蛋白(Str印tavidin-PE)，通过液相芯片xMAP法检测荧光信号；(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中 是否含有NPMl突变基因，和/或样品中突变基因的表达状况。以上检测方法的步骤(1)中，所述的微球是平均直径为5.6μπι，结合了不同荧光 染料的聚苯烯微球，即色彩编码微球(color-coded beads)。步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对NPMl的多种突变基因的特异性核酸 探针，包括如下序列(其中5’端含氨基修饰)NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID N0. 2 所 示；
NPMl-mutD 5' -AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所 示；或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。步骤(2)中，所述的针对NPMl不同突变基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如 下序列(其中上游引物5’端含生物素标签)NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 6 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3',如 SEQ ID NO. 8 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 9 所示；或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。步骤⑷中，所述的内参基因Abelson基因的引物和探针序列如下上游引物5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示；探针5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID N0. 12 所示；或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85%的序列；或者与上述序列的碱基互补序列；或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。在本发明的另一方面，提供一种检测多种NPMl基因突变的诊断试剂盒，包含共价 结合了 NPMl突变基因mRNA特异性探针的微球混合物、结合了 Abelson基因探针的微球、 NPMl突变基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白 Str印tavidin-PE、质控品(阴性对照和阳性对照)。以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种 突变基因质粒的混合液(包括含Abelson基因的质粒)，阴性对照品为不含有突变基因及 Abelson基因的质粒溶液；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。在本发明的另一方面，提供一种检测多种NPMl基因突变的诊断试剂盒在检测体 外样品，对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断、复发、治疗方 案的确定以及预后判断中的应用。由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、 高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对NPMl突变基因进行定性和定量检 测，能在临床检测上得到更好的应用。此外，本发明可以对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断提供重要的参考依据，同时对患者进行疗效观察，预后与 微小残留疾病的动态监测提供重要的依据。
具体实施例方式下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的 实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化 形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。实验材料引物和探针均由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；逆转录 cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司；多重PCR试剂盒、不同编号的微球(表面羧基修饰)、 链霉亲和素_藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)购置于Pierce公司；2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N_月桂酰基氨酸钠 (Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购置于sigma公司。缓冲液和杂交液的配置偶联缓冲液，PH4.5250mlMES4. 88g ；1.5 X TMAC 杂交溶液250ml5M TMAC225ml20% Sarkosyl1.88mlIM Tris-HCl, ΡΗ8. O18.75ml0. 5Μ EDTA, ΡΗ8. 03. OmldH201. 37ml ；1.5 X TMAC 杂交溶液250ml5M TMAC150ml20% Sarkosyl1.25mlIM Tris-HCl, PH8. 012.5ml0. 5M EDTA, PH8. 02. OmldH2084.25ml;TE 缓冲液，PH8. 0500mlIM Tris-HCl, PH8. 05ml0. 5M EDTA, PH8. 0ImldH20444ml实施例1 1种NPMl基因突变的液相芯片检测方法具体的检测方法包括如下步骤一 .检测NPMl-mutA突变基因的微球混合液的制备1.按照以下序列合成寡核苷酸探针NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所 示；Abelson 基因:5，_AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12所示；2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、21号的2种羧基微球偶 联2. 1取出一小份_20°C保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；2. 2用dH20分别溶解NPMl-mutA和Abelson的寡核苷酸探针，浓度为lmM(lnmol/ μ 1)；2. 3分别全速涡旋编号为11、21号的2种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一 的微球悬液；2. 4分别取2. 5 X IO6微球储存悬液到2个离心管中；2. 5 10，OOOg,离心，l_2min ；2. 6移除上清液，用50 μ 1 0. IM MES, ρΗ4. 5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20 秒；2. 7将2种浓度为ImM寡核苷酸探针分别用dH20以1 10的比例稀释，使其浓度 为 0. Inmol/μ 1 ；2. 8每种探针各加入2 μ 1 (浓度为0. Inmol/μ 1)到混勻的相应的微球里，涡旋混 合；2. 9用dH20配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC 的使用)； 2. 10加入2. 5μ 1 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到2种微球中(25 μ g终浓度 约为0. 5 μ g/ μ 1)涡旋混勻；2. 11室温避光孵育30min ；2. 12用dH20配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意EDC粉末如果潮解，则 应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；2. 13 2种微球中各加入2. 5 μ 1 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混勻；2. 14室温避光孵育30min ；2. 15 2 种偶联微球中各加入 Iml 0. 02% Tween-20 ；2. 16 10，OOOg,离心，l_2min ；2. 17移除上清，分别用Iml 0. 1 % SDS重悬2种偶联微球，振荡混勻；2. 18 10，OOOg,离心，l_2min ；2. 19移除上清，分别加入100 μ 1 TE, ΡΗ8. 0，涡旋混合20s,重悬微球；2. 20用细胞计数器计数2种偶联了寡核苷酸探针的微球；a.用dH20将偶联微球以1 100稀释；b.涡旋震荡充分混勻；c.取10 μ 1到细胞计数器上；d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；e.微球/ μ 1 = (4大格微球总量)X 2. 5 X 100 (稀释倍数)。3.微球混合液的配置将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列NPMl-mutA探针微球11和Abelson 探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μ 1，2-8°C避光保存。二 .样本的制备
取1-5号AML或MDS患者的临床样本，分别按照下面的步骤提取RNA 1.淋巴细胞提取取新鲜全血2ml加Iml 3%柠檬酸钠，混勻后3000r/min离心， 10min，4°C，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150 μ 1.然后加Iml TRIZ0L， 室温放置5min，使其充分裂解；3. 12，OOOrpm 离心 5min，取上清；4.每Iml Trizol中加入200 μ 1氯仿，剧振荡混勻后室温放置15min ；5. 40C 12，OOOg 离心 15min ；6.吸取上层水相，至另一离心管中；7.每Iml Trizol中加入500 μ 1异丙醇混勻，室温放置5-lOmin ；8. 40C 12，OOOg 离心 IOmin,弃上清，RNA 沉于管底；9.按每Iml Trizol中加入Iml 75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；10. 40C 8，OOOg 离心 5min，尽量弃上清；11.室温晾干或真空干燥5-lOmin ；12.用 50ul RNase-free dH20 溶解 RNA 样品，55_60°C，5-lOmin ；13.测OD值定量RNA浓度。三.多重RT-PCR按照如下方法对上述的1-5号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增l.cDNA第一链的合成①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；Total RNA5 10 μ g/3 μ 1Oligo (dT) 18Primer (0. 5 μ g/ μ 1) 1 μ 1RNase-free water forward to 12 μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；②离心管于70°C温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离 心收集管壁上的反应液到管底；③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；5 X react ion buffer4 μ 1RNase Inhibitor (20U/μ 1)1 μ 1IOmMdNTPsMix2μ 1轻轻混勻反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；④离心管于37°C温育5分钟；⑤力口入 1 μ 1 RevertAidTM Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，终体积为 20 μ 1 ；⑥离心管于42°C反应60分钟；⑦离心管于70°C加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；2.多重 PCR2. 1按照如下序列合成引物NPMl-mutA 上游引物 5，_biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID N0. 4 所示； 下游引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID N0. 5 所示；
Abelson 基因上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如 SEQ ID NO. 11 所示。2. 2 多重 PCR 反应采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下终体积为50 μ 1(2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 中含热启动 TaqDNA 酶、MgCl2 和 dNTPMix。)PCR 扩增程序:95 V 15min ；94°C 30s，55°C 90s, 72°C 90s, 35 个循环；72°C IOmin ； 4°C保温。四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；2.涡旋震荡20s，混勻微球；3.制备微球工作液，用1. 5 X TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/ μ 1。(注每个反应需要33μ 1的微球工作液)；4.涡旋震荡20s，混勻微球工作液；5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μ 1微球工作液；6.向每个样品孔内分别加入1-5号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(PH为 8. 0)，总体积为17 μ 1 ；7.用排枪上下吸打，温柔混勻反应液；8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100°C下孵育l_3min，使样品中的寡核苷酸去掉二 级结构；9.在杂交温度下孵育反应板15min ；10.制备新鲜的检测混合液，用IXTMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液 至10 μ g/ml (每个反应需要25 μ 1的检测混合液)；11.向每孔加入25μ 1的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混勻；12.在杂交温度下孵育5min ；上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并95°C, l-3min ；杂交温度，forever；13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持杂交温度， 对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。五.检测结果及分析检测结果(荧光MFI值)如表1所示表 1
0138]Template cDNA
0139]2 X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
0140]IOXPrimer mix
0141]RNase-free water
10 μ 1 25 μ 1 5 μ 1 10 μ 权利要求
一种NPM1基因突变的联合检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)包含多种不同荧光编码的羧基微球Beads，每种微球上分别共价结合针对NPM1的多种突变基因的mRNA所设计的特异性核酸探针；所述的NPM1的多种突变基因包含以下任意一种基因或任意组合的多种基因NPM1 mutA、NPM1 mutB和NPM1 mutD；(2)针对NPM1的多种突变基因的mRNA，分别设计上下游引物，对不同的突变基因的mRNA，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；(3)含有特异性核酸探针的微球与NPM1突变基因mRNA的逆转录扩增产物混合杂交，加入链霉亲和素 藻红蛋白Streptavidin PE后，通过液相芯片xMAP方法检测荧光信号；(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中是否存在NPM1突变基因，和/或样品中突变基因的表达状况。
2.如权利要求1所述的NPM1基因突变的联合检测方法，其特征在于，步骤(1)中， 所述的微球是平均直径为5. 6 y m，结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即色彩编码微球 Color-coded beads0
3.如权利要求1所述的NPM1基因突变的联合检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述 的共价结合于微球上的针对NPM1的多种突变基因的特异性核酸探针，包括如下序列，其中 5’端含氨基修饰NPMl-mutA :5，-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示； NPMl-mutB :5，-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； NPMl-mutD :5，-AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； 或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列； 或者与上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
4.如权利要求1所述的NPM1基因突变的联合检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所 述的针对不同NPM1突变基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’ 端含生物素标签NPMl-mutA 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示；NPMl-mutB 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 7 所示；NPMl-mutD 上游引物 5，-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3，，如 SEQ ID NO. 8 所示；下游 引物 5，-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3，，如 SEQ ID NO. 9 所示；或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列； 或者与上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
5.如权利要求1所述的NPM1基因突变的联合检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述 的内参基因为Abelson基因，其引物和探针序列如下上游引物 5，-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3，，如 SEQ ID NO. 10 所示；2下游引物 5，-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3，，如 SEQ ID NO. 11 所示； 探针 5，-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3，，如 SEQ ID NO. 12 所示； 或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列； 或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85%的序列； 或者与上述序列的碱基互补序列； 或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
6.一种检测NPM1基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，包含了权利要求1中所述的共 价结合了 NPM1突变基因特异性探针的微球混合物及结合了 Abelson基因探针的微球、权利 要求1中所述的NPM1突变基因mRNA的上下游引物及Abelson基因的上下游引物、链霉亲 和素-藻红蛋白和质控品。
7.如权利要求6所述的检测NPM1基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，所述的微球混 合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
8.如权利要求6所述的检测NPM1基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，所述的质控品 包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种NPM1突变基因质粒的混合液，包括含 Abelson基因的质粒；阴性对照为不含有NPM1突变基因及Abelson基因的质粒溶液。
9.一种如权利要求6所述的检测NPM1基因突变的诊断试剂盒在检测体外样品，对急性 髓系白血病和骨髓增生异常综合症的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后判断中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种核磷蛋白NPM1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒，通过对NPM1突变基因NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与逆转录PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中是否含有NPM1基因突变及突变基因的表达状况。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对NPM1基因突变进行定性和定量检测，为急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。
文档编号G01N21/64GK101955994SQ20101020265
公开日2011年1月26日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者邵棠, 陈鸣 申请人:江苏迈迪基因生物科技有限公司