专利名称：多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于生物气溶胶检测的荧光激发光学系统，该系统可有效滤除紫外激发光源中的杂散光，在保证激发光功率的同时，提高荧光激发光学系统的信噪比。
背景技术：
荧光是物质的一种光致发光现象，荧光光谱对应物质的电子能级结构。能够受激发射荧光的分子大部分为有机化合物，只有少数不常见的无机盐能够产生很弱的荧光。有机分子特定的激发光谱和吸收光谱常被用于光学方法的生命物质检测中，即用特定波长的激发光诱导有机分子产生荧光，再利用光电探测器对荧光进行检测。利用分子荧光作为物质分析、检测的研究方法称为荧光分析方法。荧光分析方法是高灵敏度，高选择性的分析方法，已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、司法鉴定和科学研究中。目前的荧光检测光路中，多采用紫外激发光。短于300nm的紫外光一般用来检测吸收峰在300nm以下、荧光波段在300_420nm之间的氨基酸物质。由于氨基酸存在的广泛性，紫外光能激发包括病毒在内的几乎所有生命物质产生荧光，是激发生命物质产生荧光的最佳波长。但是采用紫外光源，尤其是波长短于300nm的紫外光源，对光路中的光学元件及薄膜的材料要求较高。在激发光中通常含有荧光波段的光，来自于光源、光学元件的荧光，即300nm以上波长的光，在检测中将影响荧光信号的信噪比、增加本底测量噪声。在先技术[I](参见蔡舒窈，张佩，朱玲琳等.基于色氨酸本证荧光测量的生物气溶胶检测技术研究.光学学报，Vol. 32，0512009-1—0512009-6, 2012)利用干涉滤光片来滤除激发光中杂散光，如图I所示。该荧光激发光学系统包括紫外发光二极管、激发光准直镜组、激发光滤光片、分色镜、粒子富集板、聚焦/准直镜组、光陷阱与光电二极管。从紫外发光二极管发出的光经过激发光滤光片滤除激发光中荧光波段的杂散光，经过分色镜反射后到达粒子采集板，激发生物粒子产生荧光。在该荧光激发光学系统中，激发光滤光片采用干涉滤光片，滤除激发光中的光学噪声，存在以下一些缺点
I.干涉滤光片的加工的难度较大，成本较高。2.激发光经过激发光滤光片时损失了较大部分的激发光。目前国内生产的280nm干涉滤光片其峰值透过率一般低于24%。

发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的诸多问题，提供一种多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统。该系统可以在有效滤除光源杂散光的同时，保持激发光中有效波长光的高利用率，从而提高荧光检测的精确度。本发明的技术解决方案如下
一种多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统，包括共光路设计的激发光路和荧光接收光路，其特点在于
所述的激发光路由依次的紫外发光二极管、激发光准直镜组、第二分色镜、第三分色镜、第一分色镜、聚焦/准直镜组、粒子富集板组成；荧光接收光路由依次的粒子富集板、聚焦/准直镜组、第一分色镜、荧光滤光片、荧光聚焦镜组、光阑、光电倍增管组成，在所述的第一分色镜激发光的透射方向还设有光陷阱和光电二极管构成的监测光路，以监测紫外发光二极管的光强变化；由紫外发光二极管发出的紫外光由激发光准直镜组准直，经第二分色镜、第三分色镜和第一分色镜反射，滤除光源中的杂散光后，由聚焦/准直镜组聚焦到粒子富集板表面上的粒子富集区域，激发上面的粒子产生荧光，该荧光经过聚焦/准直镜组准直，透过第一分色镜再经荧光滤光片滤除荧光中的杂散光后，由荧光聚焦镜组汇聚到光电倍增管的接收面上，转换为可表征当前荧光强度的电信号。本发明利用多片分色镜将激发光经过多次反射，达到滤除噪声的目的。从光源发出的光经过三片分色镜(该分色镜对300nm以上波长的光高透，对300nm以下波长的光高反)反射后到达粒子采集板，激发生物粒子产生荧光。荧光和部分反射的激发光透过一片分色镜后，经过荧光滤光片滤除激发光波段中的杂散光，最后经过荧光聚焦镜组到达光电倍 增管探测器的接收面。所述的紫外发光二极管在室温和额定供电电压条件下，可以实现500 i! W的功率输出，光出射角为6° ,发光部分直径为6. 35mm。其发光光谱如图3所不。LED所发射的光噪声光谱如图4所示，该紫外发光二极管含有300nm以上的光噪声。所述的分色镜透过率光谱如图5所示。虽然在300nm以上的波段，分色镜也会对荧光信号造成一定的损耗，但透过率还是高达90%左右，即对荧光波段有很高的透射率。与此同时，它对300nm以下的紫外波段光却具有极低的透过率，即对这一波段的紫外光高反。第二分色镜、第三分色镜用来滤除光源中的杂散光；第一分色镜除了滤除光源中的杂散光之外，用来滤除一部分荧光光路中混杂的激发光。所述的激发光准直镜组采用平凸镜，凸面的曲率半径为25_。光源与准直透镜之间的距离为60_，经仿真分析与实验，光经过准直透镜之后的光具有很好的准直性。所述的聚焦/准直镜组将激发光会聚于采集板上，呈直径2mm的光斑；受激产生的荧光通过聚焦/准直镜组准直后进入荧光收集光路。所述的荧光滤光片为有色玻璃，是特定频段的带通滤光片。如果采集板上是色氨酸颗粒，色氨酸的荧光波段是330nnT420nm之间，则采用滤光片ZJB360，对360nm以上波段的光具有高透过率(80%)，对其他波长的透过率为O。所述的荧光聚焦镜组将特定波段的荧光聚焦到通光口径为3mm的光阑。所述的所有玻璃元件，包括采集板、激发光准直透镜、聚焦/准直镜组、荧光聚焦镜组、第一分色镜、第二分色镜、第三分色镜、荧光滤光片均是石英玻璃品，以保证在285nm左右的激发波长下不产生荧光。光陷阱中光电二极管的作用是检测由分光镜透过的少量紫外光，由此监测并反馈LED的光强变化，进而提高整个系统的稳定性。与在先技术相比，本发明有以下技术效果
I、有效抑制了激发光中的噪声波段(300nm以上)的光。在分别用一片分色镜、两片分色镜和三片分色镜时，在采集板上无任何荧光物质的情况下，用PMT测得的荧光电压分别是4620mV、650mV、350mV。与原来使用I片分色镜的设计相比，本发明对杂散光的抑制作用
大大提闻。2、提高了激发光有效波长的利用率。原有设计使用激发光滤光片，其峰值波长(285nm)透过率仅为24%，大大损耗了激发光的强度。通过功率计的测量，LED本身的发光功率为533. 3uW，分别用一片分色镜、两片分色镜和三片分色镜时，到达采集板处的激发光功率分别是242. 2uW、231.5uW、223. 3uW。原设计中到达采集板的激发光功率小于100 uff,本发明将激发光利用率提高了I倍多。 3、由于反射镀膜比干涉镀膜在技术上实现更加容易，其过度区域也更窄，所以本发明的设计更易实现。


图I为现有的采用干涉滤光片的光学检测系统示意图。 图2为本发明一种多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统示意图。图3为280nmLED光源的出射光谱图。图4为280nmLED所发射的噪声光谱图。图5为分色镜透射光谱图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。图I是现有的采用干涉滤光片的光学检测系统平面示意图，该光学检测系统由激发光路和荧光接收光路组成。激发光路由紫外发光二极管I、激发光准直镜组2、激发光滤光片12、第一分色镜3、聚焦/准直镜组4、粒子富集板5、光陷阱6、光电二极管7组成；荧光接收光路由粒子富集板5、聚焦/准直镜组4、荧光滤光片8、荧光聚焦镜组9、光阑10、光电倍增管11组成。图2为本发明一种多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统示意图。由图可见，本发明的多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统，包括激发光光路，荧光接收光路。本荧光检测系统采用共光路设计。所述的激发光路由依次紫外发光二极管I、激发光准直镜组2、第二分色镜13、第三分色镜14、第一分色镜3、聚焦/准直镜组4和粒子富集板5组成；荧光接收光路由粒子富集板5、聚焦/准直镜组4、第一分色镜3、荧光滤光片8、荧光聚焦镜组9、光阑10和光电倍增管11组成，在所述的第一分色镜3激发光的透射方向还设有光陷阱6和光电二极管7构成的监测光路。由紫外发光二极管I发出的紫外光由激发光准直镜组2准直，经第二分色镜13、第三分色镜14和第一分色镜3反射，滤除光源中的杂散光后，激发光由聚焦/准直镜组4聚焦到粒子富集板5表面上的粒子富集区域，激发上面的粒子产生荧光。该荧光经过聚焦/准直镜组6准直，透过第一分色镜3再经荧光滤光片8滤除荧光中的杂散光后，由荧光聚焦镜组9汇聚到光电倍增管11的接收面上，转换为可表征当前荧光强度的电信号。在所述的第一分色镜3激发光的透射方向还设有光陷阱6和光电二极管7构成的监测光路。以检测由第一分色镜3透射的微量激发光，由此实时监测紫外发光二极管I的光源强度，为修正荧光检测结果提供参考。所述的紫外发光二极管I在室温和额定供电电压条件下，在室温和额定供电电压条件下，可以实现500 ii W的功率输出，光出射角为6° ,发光部分直径为6. 35_。其发光光谱如图2所示。LED所发射的光噪声光谱如图3所示，该LED含有300nm以上波长的光噪声，必须滤除光源中含有的荧光波段成分，防止其对后续测量结果造成干扰。所述的激发光准直镜组2对光源准直输出。该准直透镜采用平凸镜，凸面的曲率半径为25mm。光源与准直透镜之间的距离为60mm，经仿真分析与实验，光经过准直镜组后具有很好的准直性。所述的第一分色镜3、第二分色镜13、第三分色镜14构成了一个级联滤波系统，对300nm以下的光高反，对300nm以上的光高透。所述的分色镜透过率如图5所示。虽然在300nm以上的波段，分色镜也会对荧光信号造成一定的损耗，但透过率还是高达90%左右， 即对荧光波段有很高的透射率；与此同时，它对300nm以下的紫外波段光却具有极低的透过率，即对这一波段的紫外光高反。第二分色镜13、第三分色镜14用来滤除光源中的杂散光；第一分色镜3除了滤除光源中的杂散光之外，用来滤除一部分荧光光路中混杂的激发光。所述的聚焦/准直镜组4由两片透镜组成，激发光经过聚焦/准直镜组，会聚于采集板上，呈直径2mm的光斑；受激产生的荧光通过聚焦/准直镜组准直后进入荧光接收光路。所述的粒子采集板5用于将待探测的粒子富集到粒子富集区域，便于紫外光诱导激发产生突光。所述的光陷阱6和光电二极管7，作用是检测由分光镜透过的少量紫外光，由此监测并反馈紫外发光二极管的光强变化，进而提高整个系统的稳定性。所述的荧光滤光片8为有色玻璃，是特定频段的带通滤光片。如果采集板上是色氨酸颗粒，色氨酸的荧光波段是330nnT420nm之间，则采用滤光片ZJB360，对360nm以上波段的光具有高透过率(80%)，对其他波长的透过率为O。主要作用是滤除荧光中残留的激发光等杂散光。所述的荧光聚焦镜组9将特定波段的荧光聚焦到通光口径为3mm的光阑10。所述的光电倍增管11具有极高的灵敏度和极低的噪声，为了获得高信噪比荧光强度，利用光电倍增管来探测荧光强度。为了使需要检测的荧光波段有很好的响应特性，光电倍增管的响应谱线必须与待测的荧光波段相匹配。当采集板上没有粒子附着时，在紫外光作用下没有荧光出射，当这一部分反射光再次经过分色镜和荧光滤波片后，仍有一定的残留，这一部分光便是我们要尽力滤除的。用光电检测装置可以获取残留光的光强，通过对比滤波前后残留光的光强，便可以获知光路的滤波效果。启动LED及光电检测电路，这时由光电倍增管及后续放大电路输出的电压信号即反映了残留光的光强。在一片分色镜、两片分色镜和三片分色镜等不同情况下，这一电压信号分别是
(I).在一片分色镜反射时，输出电压信号为4. 4V ;(2).在两片分色镜反射时，输出电压信号为600mV;
(3).在三片分色镜反射时，输出电压信号为350mV;
由上述结果可知，三片式分色镜的级联方式确实能对LED出射光中的杂散光实现有效的抑制，从而达到滤波的效果；
利用光功率计分别测定三种情况下入射到采集板上的激发光功率，实验结果如下
1、在一片分色镜反射时，到达采集板的紫外光功率为240.2 u W
2、在两片分色镜反射时，到达采集板的紫外光功率为231.5 u W
3、在三片分色镜反射时，到达采集板的紫外光功率为223.3 u W
从上述的实验结果可知，如果采用干涉滤光片进行滤波，干涉滤光片的最大透过率只有24%，故如果应用干涉滤光片进行滤波，可利用的光能量将小于一片分色镜光路中光能的24%，而利用三片式分色镜结构，两片和三片滤光片光路中到达采集板上的能量只有很少的衰减(能量损失小于90%)，这远远高于原有的利用干涉滤光片的滤波方案。与在先技术相比，本发明的特点在于采用多片反射式激发光系统进行荧光的激发，得到的激发光光强较高，光学噪声较小，降低了对镀膜工艺的要求，减少了荧光信号处理的难度，从而大大提高了系统的信噪比。
权利要求
1.一种多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统，包括共光路设计的激发光路和荧光接收光路，其特征在于 所述的激发光路由依次的紫外发光二极管(I)、激发光准直镜组(2)、第二分色镜(13),第三分色镜(14)、第一分色镜(3)、聚焦/准直镜组(4)和粒子富集板(5)组成；荧光接收光路由依次的粒子富集板(5)、聚焦/准直镜组(4)、第一分色镜(3)、荧光滤光片(8)、荧光聚焦镜组(9)、光阑(10)和光电倍增管(11)组成，在所述的第一分色镜(3)激发光的透射方向还设有光陷阱(6)和光电二极管(7)构成的监测光路，以监测紫外发光二极管的光强变化；由紫外发光二极管(I)发出的紫外光由激发光准直镜组(2)准直，经第二分色镜(13)、第三分色镜(14)和第一分色镜(3)反射，滤除光源中的杂散光后，由聚焦/准直镜组(4)聚焦到粒子富集板(5)表面上的粒子富集区域，激发上面的粒子产生荧光，该荧光经过聚焦/准直镜组(6 )准直，再经荧光滤光片(8 )滤除荧光中的杂散光后，由荧光聚焦镜组(9 )汇聚到光电倍增管(11)的接收面上，转换为可表征当前荧光强度的电信号。
全文摘要
一种用于生物气溶胶检测的多片反射式紫外光诱导生物荧光检测系统，包括共光路设计的激发光路和荧光接收光路，所述的激发光路由依次的紫外发光二极管、激发光准直镜组、第二分色镜、第三分色镜、第一分色镜、聚焦/准直镜组和粒子富集板组成；荧光接收光路由依次的粒子富集板、聚焦/准直镜组、第一分色镜、荧光滤光片、荧光聚焦镜组、光阑和光电倍增管组成，在所述的第一分色镜激发光的透射方向还设有光陷阱和光电二极管构成的监测光路。本发明可有效滤除紫外激发光源中的杂散光，保持激发光中有效波长光的高利用率，从而提高了荧光检测的精确度。
文档编号G01N21/64GK102798621SQ201210292870
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者赵永凯, 徐傲, 张佩, 蔡舒窈, 熊超, 黄惠杰 申请人:中国科学院上海光学精密机械研究所