专利名称：一种西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法
技术领域：
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种西地那非分子印记膜电化学传感器(MIES)的制备方法。
背景技术：
枸橼酸西地那非是第一个口服治疗阳痿的药品，需在医生指导下使用。国家药品监督管理局规定所有含枸橼酸西地那非的食品均不合法，它 与硝酸甘油药物有绝对的禁忌症，特别是对于患有高血压心绞痛而服用硝酸甘油的患者，一旦长期服用会造成血压叠加下降，对生命安全造成严重威胁。目前一些不法生产企业在保健食品、中成药中添加极少量的枸橼酸西地那非，使其具有抗疲劳、补肾壮阳等作用，但为了逃避法律的制裁并没有明示产品的潜在危害。为保证广大消费者的身体健康，规范保健食品市场，建立一个灵敏性高、特异性强的检验枸橼酸西地那非的检测方法是非常必要而又迫切的问题。目前各种新型检测分析仪器，特别是带有质谱检测器的气相色谱和液相色谱在适用性和灵敏度方面都有很大的提高。但由于保健食品、中成药品中违禁添加的药物成分多且含量极低，复杂基质成分间(尤其是复方中药成分)相互干扰等在，导致目前各种检测方法大部分存在样品制备方法繁杂、缺乏选择性等问题，因此对于功能保健食品和药品中违禁药物检测新技术的研究具有极为重要的意义。电化学传感器是一种重要的电子器件，因其设计简单、灵敏度高、价格低廉、可实现人体检测、可满足临床诊断、环境分析、食品分析和产品检测需要等优点，越来越受到人 \ 3的关注。分子印记属于超分子化学中主客体化学范畴，是源于高分子化学和材料化学等学科的一门综合学科。分子印记技术是制备具有特异选择性或专一选择性聚合物的技术。其最显著的三大特点为构效预定性，特异识别性和广泛适用性。目前电聚合分子印记传感器敏感膜具有一定报道，用电聚合方法制备西地那非分子印记敏感膜传感器未见报道。用分子印记方法富集检测保健品中违禁添加的西地那非已有文献报道。丁美娟等利用Fe3O4作为磁性材料，研究出了一种磁性分子印记技术用来检测中成药中的西地那非及伐地那非含量，Pawet D^giel等人利用固相萃取技术研究了一种在水溶液中即可检测血浆中西地那非含量的方法。保健品特别是中药类保健品由于自身成分的复杂性，以及添加违禁药物种类的多样性和未知性等问题，对其含有西地那非的分析检测提出了更高的要求。已有文献报道的检测方法有HPLC、毛细管电泳法、LC-MS等。这些传统的方法虽然也能实现对西地那非的测定，但往往由于样品基质复杂而需要经过繁琐的样品前处理，这大大影响了目标物检测的准确性和快捷性。结合分子印记技术的优良选择性进行样品前处理可实现痕量目标物的快速富集。曾有报道以分子印记技术结合传统分析方法检测复杂样品中的西地那非，虽然大大提高了检测的灵敏度和准确性但仍然面临样品处理复杂、耗时的缺点。电化学传感器最大的优势在于灵敏度高、方便快捷，可以实现实时检测。传统的电化学检测多数局限于本身具有电化学活性的待测物，与分子印记相结合的电化学传感器有望突破传统的局限，可通过待测目标物与特异性孔穴结合阻塞探针分子的通路产生电化学响应。但电聚合到电极上的分子印记层多为不导电或弱导电物质，大大影响了传感器的灵敏度。

发明内容
本发明的目的是提供一种西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，该法首次结合电化学传感器与分子印记技术的优 点构筑西地那非分子印记电化学传感器，实现对保健品、药品中违禁添加西地那非的快速检测，它不仅能维护广大消费者的合法权益，而且能更好地保障他们的身体健康安全，从而使广大消费者在对补肾壮阳类中药保健品的选购方面具有更加清晰的认识，这对完善我国药事管理与法规，规范药品生产企业的行为，净化中药保健品市场具有极为重要的推动作用。本发明的目的可以通过以下措施达到一种西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其包括以下步骤a)电极预处理将玻碳电极抛光后清洗；b)分子层层自组装修饰电极将预处理后的电极浸入到含TODA的水溶液中，进行静电吸附后用冲洗干净并吹干；再将其浸入至带负电的氧化还原石墨烯PSS-RGO溶液，浸溃后洗净、吹干；继续浸入到带正电的氧化还原石墨烯TODA-RGO溶液中，浸溃后洗净、吹干；重复前述浸入带负电的氧化还原石墨烯PSS-RGO溶液和带正电的氧化还原石墨烯PDDA-RGO溶液的步骤，以每RG07RG0+为一层，重复浸溃10 20层，得到10 20层RGO的分子层层自组装修饰电极；c)分子印记自组装溶液配制含苯二胺类功能单体和西地那非的乙醇/HAC-NaAC缓冲液，将其用氮气除氧后密封，20°C 30°C避光环境中放置5 20h，得到分子印记自组装溶液。其中，西地那非和苯二胺类功能单体的摩尔浓度比为1:1 1:50 ；d)电聚合反应将步骤c)得到的分子印记自组装溶液倒入反应容器中，避光，通氮气后，插入步骤b)得到的RGO层层自组装修饰的玻碳电极，于+0. 2^1. OV电位下，采用计时电流电聚合400 800s，取出，淋洗、吹干；e)洗脱模板分子将步骤d)得到的电极浸AH2SO4溶液中，在-0.8O.2V电位下处理:TlOmin。在步骤a)中，玻碳电极抛光后可先依次用乙醇和水超声清洗，然后用双蒸水淋洗并用氮气吹干。在步骤b)中，处理后的电极浸入到含TODA (聚二烯丙基二甲基氯化铵)的水溶液中静电吸附的时间为4 6h ;静电吸附后采用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干；所述TODA的水溶液的质量浓度为O. 59Γ5. 0%。在步骤b)中，将电极浸入至带负电的氧化还原石墨烯PSS(4_苯乙烯磺酸钠)-RG0(氧化还原石墨烯)溶液的时间为l(T60min;浸溃后采用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干。所述PSS-RGO溶液中RGO的摩尔浓度范围为O. lmg/mL 5. Omg/mL,优选O. 5mg/mL I. Omg/mL。本发明中PSS-RGO可采用现有方法制备，如吕伟的[石墨烯的低温制备及电化学性质研究](参考文献[1])以及 He W 等人的[An efficient reduction route for theproduction of Pd-Pt nanoparticles anchored on graphene nanosheets for use asdurable oxygen reduction electrocatalysts](参考文献[2]X步骤b)中，电极浸入到带正电的氧化还原石墨烯I3DDA-RGO溶液中的时间为l(T60min ;浸溃后用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干。所述TODA-RGO溶液中RGO的摩尔浓度范围为 O. lmg/mL 5. Omg/mL，优选 0. 5mg/mL L 0mg/mLo本发明中PSS-RGO可采用现有方法制备，如采用吕伟的[石墨烯的低温制备及电化学性质研究](参考文献[1])以及He W等人的[An efficient reduction route forthe production of Pd-Pt nanoparticles anchored on graphene nanosheets for useas durable oxygen reduction electro catalysts](参考文献[2])。步骤b)可得到 PDDA/ (RGOVRGOV'' '/RG07RG0+/) 10^20GCE 电极，即 10 20 层RGO层层自组装修饰的玻碳电极。在步骤c)中，所述苯二胺类功能单体为邻苯二胺、对苯二胺或间苯二胺；西地那非和苯二胺类功能单体的摩尔浓度比为I: I 1:50。其中西地那非的浓度范围为0. Immol/L 5. 0mmol/L ;苯二胺类功能单体的浓度范围为5. 0mmol/L、0. 0mmol/L。单体与模板分子的摩尔比直接影响分子印记膜中印记孔穴的形成及识别位点的量，进而影响其吸附性能。在自组装过程中，西地那非与对苯二胺通过氢键作用选择性结合，使MIS对目标物有更好的选择性。实验发现，根据洗脱前后电流响应值的变化，当摩尔比为1:5 1:20，特别是1:10时，MIS电流响应变化值最大。在步骤d)中，分子印记自组装溶液倒入反应容器后避光通氮气的时间为l(T30min。步骤d)中采用计时电流电聚合方式，经实验比较过西地那非标准自组装液分别采用循环伏安电聚合法与计时电流电聚合法进行电聚合成膜，对比它们电聚合洗脱前后电流响应值的变化。结果显示，计时电流法电聚合形成的分子印记聚合膜洗脱模板分子后电流响应值明显大于循环伏安法电聚合洗脱后的电流响应值。在步骤e)中，采用H2SO4溶液对模板分子进行洗脱。模板分子是否彻底洗脱对电极的测定结果有着重要的影响。传统的洗脱方法往往采用有机溶剂或缓冲溶液淋洗电极，这些方法一般需要的时间长，且不能够完全除去模板分子。测试电位对苯二胺-西地那非之间结合力的影响，以探索洗脱模板分子的条件。实验结果表明，当对分子印记聚合膜施加一定正电压洗脱，洗脱后模板分子的印记孔穴重现性不好，且洗脱效果不够明显。可能是由于在正电压聚合下引发形成的聚合物膜对正电位稳定。但施加负电位时情况则不同，负电位可通过改变质子化对苯二胺与西地那非复合物内部的微环境而降低两者之间的氢键结合力，迫使模板分子从高度聚合的对苯二胺内部离开达到洗脱目的。本发明根据静电斥力和氢键在酸性溶液中易断裂的机理，将电聚合后电极浸AH2SO4溶液中，在-I. (Γ+0. 2V电位下处理3 10min使聚合膜上形成负电荷聚集，优选在_0. 8^+0. 2V电位下处理，进一步优选在-0. 8'0. 2V电位下处理。本步骤中采用的H2SO4溶液的浓度范围为0. 2mol/L 2. Omol/L0可通过以下方法对本发明电化学传感器进行检测电化学检测方法和条件循环伏安法(CV)法检测电位范围为-0. 2 0. 6V，扫描速率为IOOmV s'测试底液为 0. Imol · L-1KCl 和 Immol · T1K3Fe (CN) 6 溶液。差示脉冲法(DPV)法检测电位范围为-0. 4 0. 6V，扫描速率为50mV .s—1,电位增量为O. 005V，振幅为O. 05V，脉冲宽度为O. ls，采样宽度为O. 02s，静止时间为2s。测试前电极在H2SO4溶液中清洗至背景电流恢复。测试底液为O. Imol -L^iKCI和lmmol -L^1K3Fe (CN)6溶液。交流阻抗法(EIS):初始电位200mV，频率范围O. 01 10000Hz，测试底液为O. Imol · L 1KCl 和 Immol · L 1K3Fe(CN)6 溶液。样品测定以测定片剂中的 西 地那非为例，取某补肾强身片(规格O. 28g/片)5片，用研钵研磨充分,称取粉末IOOmg,以IOmL乙腈超声萃取20min。过滤后取滤液ImL,氮气吹干后加入pH5. 6的磷酸盐缓冲液，采用上述中的DPV法测定三份样品中西地那非的浓度。西地那非为有机弱碱，在碱性溶液中不溶。经测试，当缓冲溶液的PH为5. 6时，洗脱模板分子后电流响应值最高，说明在此条件下对苯二胺与西地那非之间形成了更多的印记位点，识别效果最好。故样品测定时溶液的酸度应在能保证西地那非完全溶解的情况下尽量低。本方法制备的西地那非分子印记膜电化学传感器，其检测限(LOD)可达到2.0X10_8mol -Γ1 (S/N=3)，灵敏度远高于现有已报道的传感器，其还具有选择性高、响应快速、稳定性和耐受性良好等特点，可实现复杂基质中西地那非的高效、灵敏和实时检测。本发明的有益效果I.本发明通过分子层层自组装将带相反电荷的RGO交替吸附到电极表面，这大大增加了电极的比表面积，增强了电子传导能力，提高了检测灵敏度。2.带相反电荷的RGO通过层层自组装，能够使每一层的纳米氧化还原石墨烯分子吸附均匀牢固，层数可控，通过控制层数可方便观察电化学响应的变化。3.将分子印记与电化学传感器相结合，提高了电化学传感器的专属性，可实现对复杂样品中西地那非的选择性检测。4.分子印记层通过自组装后再进行电聚合，形成了致密牢固包含模板分子的特异性孔穴膜层。5.选用的功能单体为苯胺类物质，既是功能单体又是传统分子印记中的交联剂，在电聚合条件下形成导电性的聚苯胺。


图I是MIES制备过程中各阶段循环伏安对比图。图中，al为裸-GCE的CV曲线、bl石墨烯LBL-GCE的CV曲线、cl电聚合后MIPs的CV曲线、dl洗脱模板分子MIES的CV曲线。图2是MIES制备过程中各阶段交流阻抗对比图。图中，a2为裸-GCE的CV曲线、b2石墨烯LBL-GCE的CV曲线、c2电聚合后MIPs的CV曲线、d2洗脱模板分子MIES的CV曲线。图3是LBL-MIES的动态吸附曲线图。图4是LBL-MIES和LBL-NIES的静态吸附曲线图。图5是LBL-MIES的选择性吸附曲线。图中，a :1 μ mol/L的西地那非和I μ mol/L伐地那非溶液吸附曲线b :1 μ mol/L的西地那非和10 μ mol/L他达那非溶液吸附曲线c 1 μ mol/L的西地那非溶液吸附曲线。图中右侧中自下至上依次为c、a、b。
具体实施方式
药品和试剂=Al2O3 (O. 05 μ m，上海辰华仪器有限公司)，西地那非、伐地那非、他达那非(Sildenafil，郑州荔诺生物科技有限公司)，氯化钾(KC1)、铁氰化钾(K3Fe (CN)6)(分析纯，上海新宝精细化工厂)，无水乙醇、乙腈(分析纯，国家集团化学试剂有限公司)，磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H20 )，磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H20，南京化学试剂有限公司)，I，4-对苯二胺(P-Phenylene diamine, p-PD,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)，氧化还原石墨烯(RG0，自制)硫酸(H2SO4,上海化学试剂有限公司)，实验用水为二次蒸馏水。O. 2mol · L^1Na2HPO4. 12H20 和 O. 3mol · L^1NaH2PO4. 2H20 水溶液配制 pH 5. 8 的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)。聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly diallyldimethyl ammonium chloride, F1DDA,美国 Sigma-aldrich 公司)，聚苯乙烯横酸钠(Polysodium-p-styrenesulfonate, PSS,美国 Sigma-aldrich 公司),实施例中的H)DA-RG0、PSS-RGO采用下述方法制备a) GO :参考文献[1]，取3. Og膨胀石墨，加入120mL浓硫酸，冰浴搅拌，分3次加入16. Og高锰酸钾。35 40°C搅拌20小时后分批次加水250mL，80°C热水浴搅拌反应2小时，反应物逐渐变为亮黄色。冷却后加入40mL过氧化氢搅拌过夜，制得GO (氧化石墨烯)。然后经酸洗、水洗至pH接近6。超声分散GOf 2小时。b) PDDA-RGO :参考文献[2]，GO定量为0. 5mg/mL，超声分散Ih。在快速搅拌条件下取200mL GO,加入28%PDDA水溶液2ml，超声2h，快速搅拌12h，水溶液清洗除去多余TODA。加入乙二醇，调PH11，在140度条件下反应4h以上，清洗，得到roDA-RGO。c) PSS-RGO G0 定量为 0. 5mg/mL,超声分散 Ih。取 200mL GO 加入 600mg PSS 超声30min，50°C搅拌24h。冷却后加入氨水和水合肼各4mL，95 100°C搅拌24h。经水洗且超声分散得到PSS-RG0。实施例I( I)玻碳电极预处理玻碳电极(Φ=3ι πι)经0. 05 μ m的Al2O3悬池液抛光后,双蒸水淋洗,然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗Imin。( 2 )分子层层自组装修饰电极将修饰电极浸入到含I3DDA的水溶液(0. 5wt%)中，静电吸附5h后用双蒸水冲洗干净，N2吹干；浸入带负电的氧化还原石墨烯(PSS-RG0，0. 6mg/mL)溶液中15min，双蒸水冲洗干净，N2吹干；然后浸入带正电的氧化还原石墨烯(PDDA-RG0，0. 6mg/mL)溶液中15min，双蒸水冲洗干净，N2吹干；每RG07RG0+为一层，重复10次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 10GCE电极，即得到10层RGO层层自组装修饰的玻碳电极(3)分子印记自组装溶液配制含5mmol *L_1对苯二胺和lmmol *L_1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合缓冲溶液，充氮气除氧后密封，室温避光环境中保持20h，完成自组装。(4)电聚合反应将分子印记自组装溶液倒入反应池中，避光，通氮气IOmin后，插入分子印记层自组装修饰好的电极，于+0. 8电位下，采用计时电流法电聚合500s，取出，去离子水淋洗，氮
气吹干。(5)洗脱模板分子-O. 8V恒电压下，在O. 6mol I1H2SO4溶液中处理3min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。MIS的制备过程示。

实施例2( I)玻碳电极预处理玻碳电极(Φ=3ι πι)经O. 05 μ m的Al2O3悬池液抛光后,双蒸水淋洗,然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗Imin。( 2 )分子层层自组装修饰电极将修饰电极浸入到含I3DDA的水溶液(lwt%)中，静电吸附5h后用双蒸水冲洗干净,N2吹干；浸入带负电的氧化还原石墨烯(PSS-RG0, O. 4mg/mL)溶液中15min,双蒸水冲洗干净，N2吹干；然后浸入带正电的氧化还原石墨烯(PDDA-RG0，O. 4mg/mL)溶液中15min，，双蒸水冲洗干净，N2吹干；每RG07RG0+为一层，重复20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE电极，得到20层RGO层层自组装修饰的玻碳电极。(3)分子印记自组装溶液配制含IOmmol · L—1对苯二胺和Immol · L—1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合缓冲溶液，充氮气除氧后密封，室温避光环境中保持10h，完成自组装。(4)电聚合反应将分子印记自组装溶液倒入反应池中，避光，通氮气IOmin后，插入分子印记层自组装修饰好的电极，于+0. 6电位下，采用计时电流法电聚合600s，取出，去离子水淋洗，氮气吹干(5)洗脱模板分子-O. 6V恒电压下，在O. 7mol I1H2SO4溶液中处理4min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器(MIS)。实施例3( I)玻碳电极预处理玻碳电极(C>=3mm)经O. 05 μ m的Al2O3悬池液抛光后,双蒸水淋洗,然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗Imin。( 2 )分子层层自组装修饰电极将修饰电极浸入到含I3DDA的水溶液(3wt%)中，静电吸附5h后用双蒸水冲洗干净，N2吹干；浸入带负电的氧化还原石墨烯(PSS-RG0，O. 7mg/mL)溶液中15min，双蒸水冲洗干净，N2吹干；然后浸入带正电的氧化还原石墨烯(PDDA-RG0，O. 7mg/mL)溶液中15min，，双蒸水冲洗干净，N2吹干；每RG07RG0+为一层，重复20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE电极，得到20层RGO层层自组装修饰的玻碳电极。(3)分子印记自组装溶液配制含20mmol · L-1对苯二胺和Immol · L-1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合缓冲溶液，充氮气除氧后密封，室温避光环境中保持8h，完成自组装。(4)电聚合反应
将分子印记自组装溶液倒入反应池中，避光，通氮气IOmin后,插入分子印记层自组装修饰好的电极，于+0. 4电位下，采用计时电流法电聚合800s，取出，去离子水淋洗，氮
气吹干。(5)洗脱模板分子-O. 4V恒电位下，在O. 5mol I1H2SO4溶液中处理5min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即 得分子印记膜电化学传感器。实施例4( I)玻碳电极预处理玻碳电极(Φ=3ι πι)经O. 05 μ m的Al2O3悬池液抛光后,双蒸水淋洗,然后分别用无水乙醇、去离子水超声清洗Imin。( 2 )分子层层自组装修饰电极将修饰电极浸入到含I3DDA的水溶液(2wt%)中，静电吸附5h后用双蒸水冲洗干净，N2吹干；浸入带负电的氧化还原石墨烯(PSS-RG0，O. 8mg/mL)溶液中15min，双蒸水冲洗干净，N2吹干；然后浸入带正电的氧化还原石墨烯(PDDA-RG0，O. 8mg/mL)溶液中15min，，双蒸水冲洗干净，N2吹干；每RG07RG0+为一层，重复20次，制得PDDA/ (RGOVRGOV''' /RG07RGO+/) 20GCE电极，得到20层RGO层层自组装修饰的玻碳电极。(3)分子印记自组装溶液配制含40mmol · L-1对苯二胺和Immol · L-1西地那非的乙醇/NaAC-HAC混合缓冲溶液，充氮气除氧后密封，室温避光环境中保持6h，完成自组装。(4)电聚合反应将分子印记自组装溶液倒入反应池中，避光，通氮气IOmin后，插入分子印记层自组装修饰好的电极，于+1. O电位下，采用计时电流法电聚合400s，取出，去离子水淋洗，氮
气吹干。(5)洗脱模板分子-O. 2V恒电位下，在O. 4mol I1H2SO4溶液中处理6min，去除模板分子。取出，去离子水反复淋洗干净，氮气吹干，即得分子印记膜电化学传感器。MIES制备过程的表征I.电极修饰过程的电化学表征I. I电聚合前不同修饰玻碳电极循环伏安图分析对比两种方法修饰的玻碳电极电流响应值的变化。同一根玻碳电极先后操作(al为裸-GCE的CV曲线、bl石墨烯LBL-GCE的CV曲线、cl电聚合后MIPs的CV曲线、dl洗脱模板分子MIES的CV曲线)，经相同的方法预处理后，按上述CV法在除氧K3Fe (CN) 6/KCl测试溶液中测定CV曲线。结果显示，bl中电极的CV面积最大，电流响应值最高，说明石墨烯层层吸附修饰后玻碳电极氧化还原反应敏感度最高，即(RG0+/RG0_) 20/PDDA/GCE薄膜表面传递电荷的能力更强，可能是由于层层吸附石墨烯电极比表面积更大，表面可自由移动电子的数目多，从而提高了薄膜电荷传导能力。I. 2MIES制备过程中各阶段循环伏安对比按上述CV法，对MIES制备过程中各阶段进行了循环伏安表征。(图I结果显示，在al、bl中石墨烯层层吸附法修饰的循环伏安电流响应值较高，CV曲线面积较大，表明经石墨烯层层吸附法修饰后，玻碳电极的表面传递电荷的能力更强，导电能力增强。分析Cl曲线，结果表明随着电极表面电聚合的进行，MIPs膜逐渐变厚，电极表面形成了一层致密的弱导电性聚苯二胺薄膜，阻碍了探针分子的氧化还原反应，因此循环伏安电流响应值逐渐降低，说明了分子聚合膜能够稳定地修饰在电极表面。从曲线dl中可以看出，将印记膜电极浸入O. 5mol/L H2SO4溶液中用电位诱导法洗脱模板分子后，循环伏安电流响应值显著增强，说明目标分子通过该途径洗脱后，形成带有一定数目印记孔穴的印记膜，探针分子可以通过孔穴到达电极表面进行氧化还原反应，因此，电流响应值增加。I. 3MIES制备过程中各阶段交流阻抗对比

法拉第阻抗可用来有效地探测修饰电极表面的状况。在交流阻抗曲线中弧的半径越大，阻抗越大，反之阻抗越小。按上述交流阻抗法在测试背景溶液中对裸GCE曲线(a2)、石墨烯LBL-GCE曲线(b2)、电聚合后MIPs曲线(c2)、洗脱模板分子的MIES曲线(d2)进行了交流阻抗表征。图2结果显示，在a2、b2中，石墨烯层层吸附法修饰的玻碳电极交流阻抗较小，表明经石墨烯层层吸附法修饰后，玻碳电极的电子转移的阻力降低，导电能力增强。分析c2图，结果表明随着电极表面自组装的进行，MIPs膜逐渐变厚，电极阻抗逐渐增大。说明通过自组装和电聚合，分子聚合膜能够稳定地修饰在电极表面。从d2中可以看出，将印记膜电极浸入O. 5mol/LH2S04溶液中用电位诱导法洗脱模板分子后，阻抗值明显减小，这说明目标分子可以通过该途径洗脱，印记膜电极可实现再生。MIES吸附性能评价I.动态吸附试验分别精密配置5 μ mol/L、10 μ mol/L、50 μ mol/L的西地那非标准溶液。分别于I、5、10、15、20、25、30、40min时取出，按上述CV法测定西地那非传感器的电化学响应值得变化。曲线在初始阶段上升比较快，约在20min趋于饱和。即使西地那非的初始浓度不同，达到饱和状态吸附量基本相同，可见膜内识别位点数一定，进一步证明了印记层内形成了西地那非的特异性孔穴。2.静态吸附试验用MIPs对150 μ L的一系列浓度(O. 5 μ mol/L-250 μ mol/L)西地那非标准溶液分别吸附20min。按上述CV法测试吸附前后电极电流相应变化值，随着西地那非浓度增大，Δ Ip也逐渐增大，这是由于较多的西地那非可占据较多的印记孔穴，阻塞探针分子通过聚合层发生氧化还原反应而使电流减小，电流变化值增大。当浓度为50 μ mol -Γ1时，吸附达到平衡，Λ Ip值不再变化，认为此时识别位点几乎全部被模板分子占据，表明印记孔穴及活性结合位点对西地那非具有高度亲合力和特异的识别能力。3.选择性吸附试验选择性是考察分子印记聚合物印记效果和性能好坏的重要指标，也是传感器能否应用于实际样品检测的前提。设计干扰性实验用于考察分子印记效果，即研究膜内识别位点对模板分子是否具有特异选择性，是否不受其他竞争性底物的干扰。实验中采用ED类化合物伐地那非和他达那非进行与西地那非进行对比实验。分别将电极浸入A、B、C溶液里吸附20min后，在Immol · Γ1铁氰化钾和O. Imol · T1KCl的溶液中采用前文中的DPV法进行DPV扫描分析。结果显示，印记膜电极对A、B、C的电流响应值相近或相同，表明在I倍和10倍浓度干扰物分别存在得条件下，印记膜对西地那非的吸附量不变，即西地那非洗脱后留下的印记孔穴对西地那非的吸附不受伐地那非和他达那非的干扰，从而显示本实验中制备的西地那非电化学传感器具有稳定的特异性吸附能力。A 1 μ mol/L的西地那非和I μ mol/L伐地那非标准溶液B :1 μ mol/L的西地那非和10 μ mol/L他达那非标准溶液C :1 μ mol/L的西地那非标准溶液。样品测定方法学I.标准曲线与检测限 西地那非的DPV氧化峰电流与其浓度在2. O X 10-8-5· O X 10_7mol · Γ1和5. OX 10_7-5. OX 10_5mol · L—1的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程分别为Ip=-2. 5251C+9. 9314，r=0. 9973。Ip=-O. 0159C+8. 6788，r=0. 9971。由于氧化还原石墨烯纳米粒层层修饰而产生了大的比表面积，石墨烯优良的电传导和氧化催化活性，以及MIS具有的选择富集与吸附特性，使检测限(LOD)可达到2. OXlO^mol · Γ1 (S/N=3)，与已报道的传感器相比有更高的灵敏度。2. MIES的稳定性和重现性同实施例3法制备5根LBL-MIES，测定10 μ mol · Γ1西地那非PBS溶液吸附前后Δ Ip, RSD 为 4. 7% ;同一根 LBL-MIES 重复测定Λ IplO 次，RSD 为 2. 7%。表明 LBL-MIES 制备方法稳定，重现性好，且测定重复性优良。另将LBL-MIES干燥后4° C冰箱保存10天，其电流响应降为初始时的94%，20后电流响应下降低于10%。3.实际样品分析以本实施例2得到的LBL-MIES测定片剂中的西地那非，取某补肾强身片(规格0. 28g/片)5片，用研钵研磨充分,称取粉末IOOmg,以IOmL乙腈超声萃取20min。过滤后取滤液lmL，氮气吹干后加入pH5. 6的磷酸盐缓冲液，采用上述中的DPV法测定样品中西地那非的浓度，结果显示中药性保健品强身片中的西地那非含量为7. 91 μ g/g。分别在补肾壮阳类中药保健品中加入低、中、高3个浓度的西地那非标准溶液，进行加样回收率试验，具体结果见表I。表I补肾强生片中西地那非的含量测定
H标物样品含量(Pg/g)加样量(g/g) 回收率(％) RSD (%)
4. 74 92. 34 2.31西地那非 7.91 9.49 97. 71 2.03___11. 86__95. 86__I. 8权利要求
1.一种西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤 a)电极预处理将玻碳电极抛光后清洗； b)分子层层自组装修饰电极将预处理后的电极浸入到含TODA的水溶液中，进行静电吸附后用冲洗干净并吹干；再将其浸入至带负电的氧化还原石墨烯PSS-RGO溶液，浸溃后洗净、吹干；继续浸入到带正电的氧化还原石墨烯TODA-RGO溶液中，浸溃后洗净、吹干；重复前述浸入带负电的氧化还原石墨烯PSS-RGO溶液和带正电的氧化还原石墨烯I3DDA-RGO溶液的步骤，以每RG07RG0+为一层，重复浸溃10 20层，得到10 20层RGO的分子层层自组装修饰电极； c)分子印记自组装溶液配制含苯二胺类功能单体和西地那非的乙醇/HAC-NaAC缓冲液，将其用氮气除氧后密封，20°C 30°C避光环境中放置5 20h，得到分子印记自组装溶液；其中，西地那非和苯二胺类功能单体的摩尔浓度比为1:1 1:50 ； d)电聚合反应将步骤c)得到的分子印记自组装溶液倒入反应容器中，避光，通氮气后，插入步骤b)得到的RGO层层自组装修饰的玻碳电极，于+0. 2^1. OV电位下，采用计时电流电聚合400 800s，取出，淋洗、吹干； e)洗脱模板分子将步骤d)得到的电极浸AH2SO4溶液中，在-0.8^+0. 2V电位下处理3 IOmin0
2.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤a)中，玻碳电极抛光后先依次用乙醇和水超声清洗，然后用双蒸水淋洗并用氮气吹干。
3.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤b)中，处理后的电极浸入到含I3DDA的水溶液中静电吸附的时间为4 6h ;静电吸附后用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干；所述I3DDA的水溶液的质量浓度为0. 59T5. 0%。
4.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤b)中，电极浸入至带负电的氧化还原石墨烯PSS-RGO溶液的时间为l(T60min ;浸溃后用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干；所述PSS-RGO溶液中RGO的摩尔浓度范围为0. Img/mL 5. 0mg/mLo
5.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤b)中，电极浸入到带正电的氧化还原石墨烯I3DDA-RGO溶液中的时间为l(T60min ；浸溃后用双蒸水冲洗干净并用氮气吹干；所述I3DDA-RGO溶液中RGO的摩尔浓度范围为0.lmg/mL 5. 0mg/mLo
6.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤c)中，所述苯二胺类功能单体为邻苯二胺、对苯二胺或间苯二胺。
7.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤c)中，西地那非和苯二胺类功能单体的摩尔浓度比为1:5 1:20。
8.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤c)中，含苯二胺类功能单体和西地那非的乙醇/HAC-NaAC缓冲液中西地那非的浓度范围为0. lmmol/L 5. 0mmol/L ;苯二胺类功能单体的浓度范围为5. 0mmol/L 50. 0mmol/L。
9.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤d)中，分子印记自组装溶液倒入反应容器后避光通氮气的时间为l(T30min。
10.根据权利要求I所述的西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，其特征在于在步骤e)中，H2SO4溶液的浓度范围为0. 2mol/L^2. OmoI/L0
全文摘要
本申请公开了一种西地那非分子印记膜电化学传感器的制备方法，该方法依次经过电极预处理、分子层层自组装修饰电极、分子印记层自组装、电聚合反应以及模板分子洗脱等步骤制备得到西地那非分子印记膜电化学传感器(MIES)。本发明制备的分子印记电化学传感器具有选择性高、响应快速、灵敏度高、稳定性和耐受性良好等特点，可实现复杂基质中西地那非的高效、灵敏和实时检测。它不仅能维护广大消费者的合法权益，而且能更好地保障他们的身体健康安全，从而使广大消费者在对补肾壮阳类中药保健品、食品的选购方面具有更加清晰的认识，这对完善我国药事管理与法规，规范药品生产企业的行为，净化中药保健品市场具有极为重要的推动作用。
文档编号G01N27/30GK102768232SQ20121022572
公开日2012年11月7日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者周学敏, 姜慧君, 文婷婷, 李芸, 薛诚, 韩青 申请人:南京医科大学