专利名称：卷烟主流烟气中丙烯酰胺的测定方法
技术领域：
本发明属于烟草化学和质谱分析技术的领域，具体涉及一种卷烟主流烟气中丙烯酰胺的检测方法。
背景技术：
丙烯酰胺是一种短链Ci-P不饱和羰基化合物，极易溶于水、乙醇和甲醇等极性溶剂，在酸中稳定，在碱中易分解，紫外光照射易发生聚合。丙烯酰胺作为一种常用的有机合成单体，大量用于生产聚丙烯酰胺及其他共聚化合物；作为各种助剂广泛用于造纸业(造纸助剂)、石油业(油田采油助剂)、纺织业(染料、色素成分)、塑胶业、化工业；作为 絮凝剂处理饮用水和污水，吸附除去水中杂质。2005年2月，联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会对食品中的丙烯酰胺进行了系统的危险性评估，其神经毒性、生殖发育毒性和遗传毒性均得到证实，并被国际癌症研究机构列为2A类致癌物。对于食品中丙烯酰胺的产生机理，目前认为最主要的途径是由食品中富含的天门冬酰胺与还原糖通过梅拉德(Maillard)反应产生。带有醒基的还原性糖与天门冬酰胺在高于100°C反应生成配糖，并通过碳氮键断裂为中间体，进而转化为丙烯酰胺；温度实验表明从120°C到170°C，丙烯酰胺产率增加，继续升温则产率下降。烟丝通过燃烧产生烟气，燃烧过程中产生较高浓度丙烯酰胺，2001年，Hoffmann等发表了烟气中69种有害成分名单，丙烯酰胺位列其中。事实证明，吸烟是人体摄入丙烯酰胺的重要途径，因此对主流烟气中丙烯酰胺释放量的定量分析研究十分必要。目前主流的丙烯酰胺检测方法仍为色谱法，可分为两大类，即基于气相色谱(GC)或液相色谱(LC)进行分离，并与多种检测器结合。气相色谱除可与质谱(MS)联用外，还可与电子捕获检测器(ECD)、火焰离子化检测器(FID)等联用。基于GC的方法通常要结合衍生化步骤，如溴化加成或硅烷化衍生等以增加方法选择性和灵敏度，但步骤繁琐、费时费力。不衍生化直接分析也是可行的，但灵敏度相对较低，并要避免进样时由于高温生成丙烯酰胺而导致的检测结果偏高。2008年，Deikmann与Jingcun WU均利用GC-MS测定了2R4F卷烟烟气中的丙烯酰胺，二者的测试结果有较大差异。液相色谱除与质谱外，还可与紫外检测器(UV)联用，当采用LC-UV方法时，须借助其他方法鉴定峰的归属；另外UV不能分辨几种常用的内标物质，在分析时不能使用同位素标记的丙烯酰胺作为内标物，必须开发研究新的内标物质以弥补在操作过程中对丙烯酰胺带来的损失。2009年，谢山岭等利用SPE-HPLC-UV法测定了 8种烤烟型香烟主流烟气中的丙烯酰胺。利用LC一MS — MS方法测定丙烯酰胺，免去了衍生反应的繁琐步骤，经过LC保留时间对照和MS两次结构确认，大幅度排除了共萃物的于扰，既保证了分析结果的准确度，又提高了检测方法的灵敏度，是目前食品中丙烯酰胺分析最具发展潜力的方法。利用LC一MS — MS方法测定卷烟主流烟气中的丙烯酰胺尚未见报道。

发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术状况而专门提供一种快速灵敏测定卷烟主流烟气中丙烯酰胺的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的利用剑桥滤片捕集5支卷烟主流烟气中总粒相物，加入D3-丙烯酰胺为内标，经去离子水超声萃取，再取适量以乙腈稀释。通过液相色谱柱的选择及流动相组成的优化，以乙腈与0. 1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测。具体测定步骤如下
标准工作曲线制定以乙腈为溶剂配制浓度约为0. 05mg/mL的丙烯酰胺标准品母液，配制浓度约为0. 43mg/mL的D3-丙烯酰胺内标溶液。分别取不同量丙烯酰胺母液于5_7个50mL三角瓶中，每个三角瓶中加入IOML D3-丙烯酰胺内标溶液，并加入30mL去离子水，摇 匀后，从每个三角瓶中各取200ML溶液，并用乙腈分别稀释至lmL，得到至少5个浓度的丙烯酰胺标准溶液；标准溶液丙烯酰胺标准品浓度范围约为0. 008-0. 256Pg/mL，每个标准溶液中D3-丙烯酰胺内标浓度约为0. 028l^g/mLo利用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述所有浓度的标准溶液中的丙烯酰胺含量进行检测，根据丙烯酰胺及内标D3-丙烯酰胺的峰面积比和二者相应的浓度比绘制丙烯酰胺的标准工作曲线并计算得到其回归方程；
样品制备按照GB/T 19609收集5支卷烟主流烟气粒相物。取出滤片，转移至50 mL锥形瓶中，准确加入30 mL去离子水及D3-丙烯酰胺内标溶液10ML，室温下以40 w功率超声20 min，静置2 min，取上清液过0. 2Mm滤膜，取过滤膜后的液体200ML，用乙腈定容至ImL。利用高效液相色谱串联质谱仪采用与前面标准溶液测定时相同的条件分别对样品溶液进行检测，根据样品中丙烯酰胺与D3-丙烯酰胺峰面积比及D3-丙烯酰胺浓度，带入标准工作曲线的回归方程中，计算出样品中丙烯酰胺含量。高效液相色谱分析条件
色谱柱Agilent HILIC Plus 分析柱(100mm X 2. I mm, 3.5 u m)；
流动相流动相A为0. 1%甲酸水，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件80%B开始,等度洗脱,分析时间共5min ；
进样量5ML ；
流速0. 3mL/min ；
柱温25°C。质谱条件
离子源电喷雾电离源(ESI)；
扫描方式正离子扫描；
检测方式多反应监测MRM ；
电喷雾电压5000V ；
气帘气压力30 psi ；
辅助气I压力60 psi ；
辅助气2压力60 psi ；
离子源温度500 °C。在本发明的上述条件中，以水为萃取溶剂、乙腈为样品稀释溶剂、以D3-丙烯酰胺为内标，采用0. 1%甲酸水为流动相A是本方法的关键。以水为样品萃取溶剂,能够减小样品中有机杂质进入色谱柱中的量，有效保护色谱柱；以乙腈为样品稀释溶剂，提高了离子化效率，提高了分析方法的灵敏度，并改善了峰形；以D3-丙烯酰胺为内标增加了定量的准确度；与纯水为流动相相比，0. 1%甲酸水为流动相能有效改善丙烯酰胺的色谱峰形，有利于丙烯酰胺的准确定量。本方法前处理简单，按照GB/T 19609收集5支卷烟主流烟气粒相物。取出滤片，加入内标，用去离子水超声萃取20min，静置2min，取200ML萃取液用乙腈定容至I mL，无需进一步进行样品净化步骤，即可进行液质分析。利用本发明方法对主流烟气中丙烯酰胺进行测定，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。


图I是丙烯酰胺萃取离子对色谱图； 图2是氘代丙烯酰胺即内标萃取离子对色谱 图3是样品中丙烯酰胺萃取离子对色谱 图4是加入样品中氘代丙烯酰胺即内标萃取离子对色谱图。
具体实施例方式以下对应用本发明对卷烟主流烟气中丙烯酰胺进行液质分析做进一步的说明 仪器和试剂
API4000质谱仪(美国应用生物系统公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Cerulean SM450直线式吸烟机(Cerulean, Ltd. ) ；Milli-Q50超纯水仪(美国MILLIP0RE公司);KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CP2245电子天平(感量0. OOOlg,德国Sartorius公司)。标准品丙烯酰胺(CAS:79-06-l)、D3-丙烯酰胺(CAS: 122775-19-3)购自上海安
谱公司。除特别要求以外，均应使用液相色谱纯级试剂，水为GB/T 6682规定的一级水，乙
腈、甲酸。标准溶液的配制和标准曲线的制作
以乙腈为溶剂配制浓度约为0. 05mg/mL的丙烯酰胺标准品母液，配制浓度约为
0.43mg/mL 的 D3-丙烯酰胺内标溶液。分别取 25ML、50ML、100ML、200ML、400ML、800ML 丙烯酰胺母液于6个50mL三角瓶中，每个三角瓶中加入IOML D3-丙烯酰胺内标溶液，并加入30mL去离子水，摇匀后，从每个三角瓶中各取200ML溶液，并用乙腈分别稀释至lmL，得到6个标准溶液。6个标准溶液丙烯酰胺标准品浓度范围为0. 008-0. 256Pg/mL，每个标准溶液中D3-丙烯酰胺内标浓度约为0. 028l^g/mLo利用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述所有浓度的标准溶液中的丙烯酰胺含量进行检测，根据丙烯酰胺及内标D3-丙烯酰胺的峰面积比和二者相应的浓度比绘制丙烯酰胺的标准工作曲线并计算得到其回归方程；标准曲线方程为 y=0. 113x-0. 00438，R2 =1。样品前处理
将卷烟样品放置于(22± I) °C,相对湿度为(60±2) %的环境中平衡48h，然后选其平均重量在±0.02g范围和平均吸阻在±49Pa/支范围内的烟支作为测试烟支。按照每60秒抽吸一口，每口抽吸容量35ml，抽吸持续时间2s。采用直线式吸烟机，用直径44mm的剑桥滤片捕集卷烟主流烟气总粒相物，每张滤片收集5支卷烟的总粒相物，取出滤片置于50ml锥形瓶中，准确加入30 ml去离子水，准确加入D3-丙烯酰胺内标溶液10ML，室温下以40 w功率超声20 min，静置2 min，取上清液过
0.2Mffl滤膜，取过滤膜后的液体200ML，用乙腈定容至I mL。混匀后进LC-MS/MS分析。液相色谱和质谱条件
LC-MS/MS 分析所用色谱柱为 Agilent HILIC Plus 分析柱(100_ X2. I mm, 3.5U m),柱温25°C;流动相A为含0. 1%甲酸的水溶液，流动相B为乙腈溶液；采用20%A、80%B 等度洗脱，流速300 u L/min,分析时间5 min,进样体积5 y L。离子源电喷雾电离源(ESI);扫描方式正离子扫描；检测方式多反应监测MRM ；电喷雾电压5000V ;气帘气压力30 psi ;辅助气I压力60 psi ;辅助气2压力60 psi ；离子源温度500 0C ;丙烯酰胺及D3-丙烯酰胺定量离子对、驻留时间、碰撞能量(CE)及去簇电压(DP)参见表I。表I :丙烯酰胺及内标的定量离子对、驻留时间、碰撞能量及去簇电压
权利要求
1.一种卷烟主流烟气中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于以剑桥滤片捕集主流烟气总粒相物，加入D3-丙烯酰胺为内标，以水为样品萃取溶剂，乙腈为稀释溶剂，乙腈与0. 1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测，具体测定步骤如下 (1)标准工作曲线制定 (I. I)以乙腈为溶剂配制浓度为0. 05mg/mL的丙烯酰胺标准品母液，配制浓度约为0.43mg/mL的D3-丙烯酰胺内标溶液； (1.2)分别取不同量丙烯酰胺母液于5-7个50mL三角瓶中，每个三角瓶中加入IOMLD3-丙烯酰胺内标溶液，并加入30mL去离子水，摇匀后，从每个三角瓶中各取200ML溶液，并用乙腈分别稀释至lmL，得到至少5个浓度的丙烯酰胺标准溶液；标准溶液丙烯酰胺标准品浓度范围约为0. 008-0. 256Pg/mL，每个标准溶液中D3-丙烯酰胺内标浓度约为0. 028呢/mL ； (I. 3)利用高效液相色谱串联质谱仪分别对上述所有浓度的标准溶液中的丙烯酰胺含量进行检测，根据丙烯酰胺及内标D3-丙烯酰胺的峰面积比和二者相应的浓度比绘制丙烯酰胺的标准工作曲线并计算得到其回归方程； (2)样品制备 (2. I)利用剑桥滤片捕集5支卷烟主流烟气中总粒相物， 取出滤片，转移至50 mL锥形瓶中，准确加入30 mL去离子水及D3-丙烯酰胺内标溶液10ML，室温下超声萃取，静置后取上清液过0. 2M 滤膜，取过滤膜后的液体200ML，用乙腈定容至I mL ； (2. 2)利用高效液相色谱串联质谱仪采用与步骤(I. 3)相同的条件分别对样品溶液进行检测，根据样品中丙烯酰胺与D3-丙烯酰胺峰面积比及D3-丙烯酰胺浓度，带入标准工作曲线的回归方程中，计算出样品中丙烯酰胺含量。
2.根据权利要求I所述的卷烟主流烟气中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于(2.I)中的超声萃取时的超声波功率为40 w、时间20 min。
3.根据权利要求I所述的卷烟主流烟气中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于高效液相色谱串联质谱仪分析条件如下 (3. I)色谱条件 色谱柱Agilent HILIC Plus 分析柱(100mm X 2. I mm, 3.5 u m)； 流动相流动相A为0. 1%甲酸水，流动相B为乙腈； 梯度洗脱条件80%B开始,等度洗脱,分析时间共5min ； 进样量5ML ；流速0. 3mL/min ； 柱温25°C ； (3. 2)质谱条件 离子源电喷雾电离源(ESI)； 扫描方式正离子扫描； 检测方式多反应监测MRM ； 电喷雾电压5000V ；气帘气压力30 psi ；辅助气I压力60 psi ； 辅助气2压力60 psi ；离子源温度500 °C。
全文摘要
一种卷烟主流烟气中丙烯酰胺的测定方法，其特征在于以剑桥滤片捕集主流烟气总粒相物，加入D3-丙烯酰胺为内标，以水为样品萃取溶剂，乙腈为稀释溶剂，乙腈与0.1%甲酸水溶液为流动相，采用四级杆串接质谱对主流烟气中的丙烯酰胺进行检测。本发明的特点是以水为样品萃取溶剂，能够减小样品中有机杂质进入色谱柱中的量，有效保护色谱柱；以乙腈为样品稀释溶剂，提高了离子化效率，提高了分析方法的灵敏度，并改善了峰形；以D3-丙烯酰胺为内标增加了定量的准确度；与纯水为流动相相比，0.1%甲酸水为流动相能有效改善丙烯酰胺的色谱峰形，有利于丙烯酰胺的准确定量。本方法前处理简单，重复性和回收率好，适用于大批量样品的分析。
文档编号G01N30/88GK102749411SQ20121023804
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月11日 优先权日2012年7月11日
发明者余晶晶, 刘克建, 刘惠民, 张晓兵, 王冰, 王昇, 蔡君兰, 谢复炜, 赵阁 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院