专利名称：：检测hiv抗体的方法及该方法中使用的抗原的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用免疫测定法检测抗HIV的HIV抗体的方法，其中使用了至少一种衍生自HIV1-D亚型分离物的gp41，尤其是共有区-D序列的氨基酸(AA)518-533的表位区域(＝表位区域II)的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型分离物的gp41相应区域的抗原，和/或使用了至少一种衍生自HIV1-E亚型分离物的gp41，尤其是共有区-E序列的AA551-565的表位区域(＝表位区域I)的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型分离物的gp41相应区域的抗原。本发明还涉及分别含有衍生自HIV1-D亚型的env-基因产物gp41和HIV1-E亚型的gp41的组分的抗原和抗原混合物，及其用于检测HIV抗体和用作试剂盒的用途。AIDS(获得性免疫缺损综合征)是由HIV病毒引起的获得性免疫缺损疾病。目前已知的病原体是HIV1和HIV2，这两个病毒株在形态学，细胞嗜性，与T细胞CD4受体的相互作用，在体外对CD4细胞的致细胞病变效应，大体的基因组结构和导致疾病AIDS的能力方面是相似的(Clavel，1987，AIDS1，135-140)。然而，它们的免疫学相关程度很低，以致于HIV1特异性抗体一般不与HIV2发生任何交叉反应。除了最常见的HIV1-M组亚型外，还发现了另一个HIV1亚型，即O亚型(Myers等，LosAlamos数据库，1994；Sharp等，AIDS增刊8，p27-42，1994)，然而，HIV1-M组的感染占优势。除了基本的关联外，单个HIVM组亚型的一些基因组区域表现出相当大的序列差异，部分导致蛋白质水平的不均一性。因此，可能会发生诸如此类的情况，即包括检测组分和/或能与HIV1-A亚型特异性反应的抗原的HIV抗体检测不能与HIV1-B亚型样品反应。这会导致错误的阴性试验结果，而从患者的利益出发，无论如何应避免这种情况的发生。现有技术已知可使用衍生自HIVenv区域的肽来检测抗HIV的抗体。因此，EP-A-0326490中描述了用于检测HIV抗体的合成肽，该肽分别衍生自HIV1的gp41区域和HIV2的gp36区域(被称为gp42)。用这些肽不可能完全测定抗不同HIV1亚型，尤其是占优势的HIV1M组亚型的抗体。在WO95/33206中，公开了同时检测抗gp41，gp36和gag-p24的抗体的免疫学方法。该方法遵照的是如EP-A-0280211所述的桥试验原理，其中两个抗原将需检测的抗体连接起来，其中一个抗原与固相结合，通过另一个抗原携带的标记物可检测连接抗体。在WO95/33206公开的方法中，用作抗原的肽分别衍生自gp41(HIV1)和gp36(HIV2)和衍生自HIV1gag-p24。所公开的gp41肽序列衍生自HIV1O和B亚型。用此方法不可能进一步检测亚型以确保能可靠地和足够灵敏地检测出HIVM组的其它亚型。Apetrei等(AIDS1996，vol.10，pp.F57-F60)描述了这样一个问题，即当使用目前已知的可商购试验时，因HIV1-M组中的血清学不均一性，会得到错误的阴性结果。目前市售的用于诊断HIV检测的筛选试验能检测HIV1B亚型，但非B亚型类，如A，E或G亚型不能被检测或仅呈微弱的阳性。因此，现有技术已知的免疫学检测方法具有相当多的缺点。在法国专利申请FR-A1-2730493中，描述了得自HIV1MAD株的糖蛋白gp120和gp41多肽。HIV1MAD株可能属于M组的D亚型。此申请提到因HIV的高度可变性所致的错误的阴性检测反应是检测HIV感染的问题所在，但该申请中未公开解决此问题的任何方法。因此，本发明的目的是提供检测抗HIV，尤其是抗HIV1亚型的抗体的改良方法。该改良方法应能确保特异性地、清楚地检测到广泛分布的M组亚型。利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的方法达到了此目的，其中(a)使用了至少一种衍生自HIV1-D亚型分离物的gp41，优选衍生自表位区域II＝共有区-D序列的AA518-533的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型分离物的gp41相应区域的抗原，和/或(b)使用了至少一种衍生自HIV1-E亚型分离物的gp41，优选衍生自表位区域I＝共有区-E序列的AA551-565的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型分离物的gp41相应区域的抗原。借助于本发明的方法，能基本克服现有技术的缺点，这意味着能更可靠地检测被HIV1M组亚型感染的患者样品。令人惊奇地是，使用衍生自env基因产物gp41，尤其是衍生自不同HIV1亚型的gp41的表位区域I和II的序列的抗原，可更可靠地检测M组亚型和O亚型所致的HIV感染。本发明的方法中使用至少一种衍生自D亚型分离物的gp41(表位区域II＝共有区D序列的AA518-533)的抗原，和/或至少一种衍生自E亚型分离物的gp41(表位区域I＝共有区E序列的AA551-565)的抗原，可确保更可靠地检测含有抗M组亚型蛋白质的抗体的样品。而且，用此试验也可非常好地检测低抗体浓度的样品中不同的HIV亚型。本发明的方法能使错误的阴性诊断结果的危险大大降低。对本发明的方法而言，优选以不同抗原的混合物形式使用抗原。这可以降低抗体浓度高的样品中Hook效应的危险，因为混合物一般含有高亲和性的抗原以及低亲和性的抗原。本发明的方法也可以使用确定的抗原序列。可在本领域技术人员已知的所有方法的范围内使用本发明的方法，用于免疫学检测HIV感染，尤其是检测HIV抗体。所述方法包括例如均相的和非均相的免疫测定法。当使用均相的方法时，反应后，即抗体和分析物结合之后无需将固相和液相分开。在均相免疫测定法中，当分析物的存在导致抗体和抗原交联时会出现浊度，通过浊度常常能分辨出分析物的检测。基于浊度测定法的这些方法也被称为比浊法。在本发明的方法中，所用抗原可以是例如与浓度成比例地被样品中存在的抗体交联的多聚体抗原(聚半抗原)。然而，优选的是非均相的方法。例如，根据桥试验和夹心原理的方法是非均相的方法。在桥试验中，待检测的抗体与结合于固相的具有标记抗原的抗原连接。免疫学反应之后，将固相与液相分开，测定其中一相中的标记物。信号水平为分析物(此时为抗体)的量或浓度的测定值。在夹心试验中，与固相结合的抗体捕获分析物。第二个经标记的抗体也与分析物结合。按与桥试验类似的方法进行固相和液相的分离以及标记物的检测。所述方法应不会限制本发明的免疫学检测法，相反还会阐明之。特别优选根据桥试验原理进行本发明的方法，也特别优选同时使用检测特异性抗体的桥试验和检测特异性抗原的夹心试验的联合检测法(称为联合试验)。在本发明中，借助于本发明的抗原和抗原混合物可检测特异性的HIV抗体。当使用特异于一个或几个HIV抗原的抗体时，夹心法可同时检测这些抗原。德国专利申请DE19709762.6描述了能同时检测HIV抗原和抗体的联合试验。在这种联合试验中，优选使用本发明的检测法。专利申请DE19709762.6的主题是使用受体R1至R6检测HIV感染的免疫学方法，优选为非均相的方法。此方法中使用的受体R1和R2特异性地与待测的HIV1-p24和/或HIV2-p26抗原结合。所用受体R3和R4是得自HIV1，HIV2或HIV1-SubO的env区域的一个或多个抗原(HIV1/HIV1-SubO的gp160，gp120，gp41和HIV2的gp140，gp110，gp36)。R3和R4优选为gp41和/或gp36或其片段。所用受体R5和R6是得自HIV1，HIV2或HIV1-SubO的pol或gag区域的一个或几个抗原，但必须不是p24或p26。R5和R6受体优选为HIV1，HIV2或HIV1-SubO的pol区域的抗原。特别优选将逆转录酶(RT)用作受体R5和R6。下文将更详细描述的抗原和抗原混合物被优选用作联合试验中的受体R3和R4。德国专利申请DE19709762.6中所述的方法以及非均相方法中固相结合的可能性，标记物检测方法等也是本发明的组成成分，因此本文中不单独提及这些方法。本发明的方法可以湿和干试验的方式进行。在湿试验中，所有检测试剂存在于液相中。但也可以使用适于检测蛋白质或抗体的所有常规干试验形式，如EP-A-0186799所述的这些干试验或试验条在单个载体上混合所有试验组分。然而，本发明的方法优选以湿试验的方式进行。本领域技术人员已知的可能被HIV感染的所有生物液体都可用作样品。优选样品为体液，如全血，血清，血浆，尿液，唾液等。本发明的方法所用的抗原衍生自HIV1env基因产物gp41。优选用于本发明方法的，具有SEQIDNO1至7所述序列的抗原衍生自不同HIV1亚型的gp41的所谓表位区域I和/或II。肽的一部分被指定为gp41的表位区域II；另一部分被指定为表位区域I。这些区域之间免疫反应性很强，这些区域内的序列比较显示出不同HIV1亚型中出现的不均一性。相对于M组其它代表而言，在D亚型(表位区域II)中出现更大的序列不均一性。表1显示出不同HIV1亚型的gp41的表位区域II序列变体，表2显示出不同HIV1亚型的gp41的表位区域I序列变体，序列下面的图显示出gp41相应的氨基酸位置。表1HIV1gp41的表位区域II序列变体</tables><p>实施例23α-甲基-1，2-苯并异噻唑-3-乙酸甲酯的制备将氢化钠(1.25g，60％在油中，31.3mmol)在四氢呋喃中的混合物加入1，2-苯并异噻唑-3-乙酸甲酯(6.0g，29.0mmol)在四氢呋喃中的溶液中。搅拌30分钟后，用甲基碘(2.0mL，32.0mmol)处理反应混合物，搅拌1小时，用冰骤冷。用盐酸中和(pH5-pH6)混合物水溶液并用二氯甲烷萃取。合并有机萃取液，用无水硫酸钠干燥并在真空中浓缩获得一棕色油。使用硅胶和10％-25％在己烷中的乙醚溶液对油进行色谱分离，获得琥珀色油状物的标题产物，由NMR光谱分析鉴定之。从式(I)可得出下列优选序列SEQIDNO7-11，它们对应于SEQIDNO1-6的部分优选序列SEQIDNO7C-S-G-K-H-I-C-T-T-I(I)SEQIDNO8C-S-G-K-H-I-C-T-T-N(I)SEQIDNO9C-S-G-R-H-I-C-T-T-I(I)SEQIDNO10C-S-G-R-H-I-C-T-T-N(I)SEQIDNO11C-S-G-R-H-I-C-T-T-T(I)根据本领域技术人员已知的方法，其它氨基酸可位于这些序列侧翼，这些序列也可以被修饰。唯一需要满足的条件是经修饰的抗原必须能被针对未经修饰的部分序列的抗体识别和特异性结合。本发明的另一个主题是衍生自HIV1-E亚型的gp41P1的表位区域I的抗原。优选抗原含有最小长度为6个氨基酸的表4所述序列或其部分序列，抗原序列描述于序列草图中的SEQIDNO12。表4HIV1-E亚型的gp41的P1区域抗原利用根据SEQIDNO1至12的得自HIV1-gp41表位区域I或II的这些抗原，在检测HIV抗体时可以大大改善对非B亚型的识别。因此，本发明的另一个主题是利用根据SEQIDNO1至11或其部分序列的抗原和/或根据SEQIDNO12或其部分序列的抗原检测抗HIV的抗体，尤其是抗HIV1M组亚型的抗体。已证明使用抗原混合物对可靠检测不同的HIV1亚型特别有利。对检测方法而言，使用至少两种基于不同亚型序列的不同抗原较为有利。因此，本发明的主题也包括由至少两种抗原组成的抗原混合物，其中至少一种抗原衍生自HIV1D亚型的gp41，至少一种抗原衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的相应区域。优选HIV1-D亚型分离物的gp41抗原对应于共有区D序列的表位区域II(AA518-533)，其中特别优选使用根据SEQIDNO1-11的抗原。本发明的主题也包括由至少一种衍生自HIV1E亚型分离物的gp41的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的相应区域的抗原组成的抗原混合物。优选HIV1-E亚型分离物的gp41抗原对应于共有区E序列的表位区域I(AA551-565)，其中特别优选使用根据SEQIDNO12的抗原。根据本发明，抗原混合物也可由gp41的表位区域II和I的抗原组成。此混合物由下列抗原组成至少一种衍生自HIV1D亚型分离物的gp41的抗原，其中优选使用共有区D序列的表位区域II(AA518-533)的抗原，特别优选使用根据SEQIDNO1-11的抗原，至少一种HIV1M组不同亚型的gp41的相应区域的抗原，至少一种HIV1-E亚型分离物的gp41的抗原，其中优选使用共有区E序列的表位区域I(AA551-565)的抗原，特别优选使用根据SEQIDNO12的抗原，至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的相应区域的抗原。这种混合物可确保识别和检测抗不同HIV1亚型gp41区域的抗体的过程中良好的实验安全性。然而，如果仅为一个表位区域(如D亚型和M组其它代表的表位区域II)提供完全混合物，第二个区域仅靠其它序列(如仅一个M组代表的表位区域I的抗原)起作用即可。优选使用的是下列抗原混合物，其中含有对应于SEQIDNO1至6或其最小长度为7个氨基酸的部分序列或SEQIDNO7至11的HIV1-D亚型分离物的gp41的表位区域II的抗原，和/或含有对应于SEQIDNO12或其最小长度为6个氨基酸的部分序列的HIV1-E亚型分离物的gp41的表位区域I的抗原。因此，本发明的另一主题是使用上述抗原混合物之一检测抗HIV的抗体，尤其是抗HIV1M组亚型和O亚型的抗体。为了同时检测O亚型，必须使用一个或几个得自gp41表位区域I或II的O亚型特异性抗原。除了上述抗原混合物外，特别优选使用衍生自HIV1B亚型的gp41的表位区域II的其它抗原和/或衍生自HIV1B亚型的gp41的表位区域I的其它抗原。这种抗原混合物也可大大改善对HIV1M组亚型的识别。除了上述抗原混合物外，也优选使用衍生自HIV1O亚型分离物的gp41的表位区域II的其它抗原和/或衍生自HIV1O亚型分离物的gp41的表位区域I的其它抗原。这种抗原混合物也可大大改善对HIV1亚型的识别，因为它可确保在一次试验中识别M组亚型以及O亚型。优选给出下列混合物作为例子，因为已证明它们有利于测定HIV亚型衍生自gp41表位区域II的抗原的混合物B亚型LGIWGCSGKLICTTAVD亚型LGIWGCSGKHICTTIVO亚型(Ant70)LSLWGCKGKLVCYTSV衍生自gp41表位区域I的抗原的混合物E亚型AVERYLKDQKFLGLWB亚型AVERYLKDQQLLGIWO亚型(Ant70)ALETLLQNQQLLSLW当然，也可使用此区域中能识别其它HIV亚型，如A，C，F或G亚型的其它抗原。唯一的条件是检测过程自身必须是可行的。如果将来可鉴定其它的HIV亚型，本领域技术人员当然可使用衍生自相应亚型的env区域，优选衍生自gp41区域的其它抗原。当然，根据本领域技术人员已知的方法，可使用上述本发明的抗原和抗原混合物制备抗体或疫苗。所用抗原不仅仅是衍生自HIV1亚型的抗原。为了确保在不论病毒株如何的情况下可靠地检测HIV感染，除了使用HIV1的env区域的所述抗原外，还需使用衍生自HIV2的env区域，尤其是gp36的抗原。如上所述，本发明的抗原和抗原混合物衍生自HIV1的env区域，尤其是gp41的基因产物，特别优选衍生自gp41的表位区域I和II。优选氨基酸序列对应于天然序列，因为这样可确保在免疫学检测方法中可靠地检测不同亚型。这意味着样品中所含的针对某个HIV1亚型的抗体可特异性地结合这些抗原。在桥试验中，抗原应被抗体连接。术语抗原指的是特异性结合具有相应结合位点的抗体的结合配对物。抗原是被抗体识别和特异性结合的表位。优选抗原为肽或蛋白质，因此，优选抗原由氨基酸组成，但可以被糖结构和/或脂质结构修饰。前提条件是抗原的抗原特性，即适于结合待测抗体的能力基本上不变。然而，也可使用未经进一步修饰的纯肽形式的抗原。在竞争性试验中使用未经修饰的抗原是可以想得到的。理论上，相应方法所需的和本领域技术人员已知的所有抗原修饰都是允许的。重要的是保持抗原与被特异性检测的抗体结合的能力。如果使用的是肽抗原，对肽进行修饰十分有利。这意味着代表某个表位区域的肽也可具有例如N末端和/或C末端侧翼序列，所述序列不再对应于特异性表位。肽也可含有不会在此氨基酸序列中天然出现的非表位序列，唯一的前提条件是除了侧翼氨基酸外，肽的表位是保守的。待测抗体特异性结合相应表位，另外，肽中可插入本领域技术人员已知的间隔区，唯一的条件是必须保留与待测抗体结合的能力。通过例如取代，缺失或插入单个氨基酸残基也可修饰肽或抗原的表位区域。然而，这种修饰的前提条件是保留与待测抗体特异性结合的能力。对应于gp41的env区域，尤其是表位区域I和II的特异性表位的本发明肽和抗原也可以是其中一个或几个氨基酸经化学反应衍生化的肽衍生物。本发明肽衍生物的具体例子为具有衍生化骨架或/和反应性的氨基酸侧链基团，如游离氨基，游离羧基或/和游离羟基的分子。氨基衍生物的具体例子为氨磺酰或氨甲酰，硫代氨基甲酸乙酯衍生物和铵盐，如盐酸化物。羧基衍生物是盐，酯和酰胺。羟基衍生物的例子是O-酰基或O-烷基衍生物。优选根据本领域技术人员已知的方法，通过化学合成进行肽的生产，此处无需进一步解释。理论上，也可以利用重组方法生产肽和抗原，其中所述表位或抗原可以是较大重组蛋白的一部分。术语肽衍生物也包括其中一个或几个氨基酸被20个标准氨基酸的天然或非天然氨基酸同系物取代的肽。这种同系物的例子是4-羟基脯氨酸，5-羟基赖氨酸，3-甲基组氨酸，高丝氨酸，鸟氨酸，β-丙氨酸和4氨基丁酸。肽衍生物必须显示出与衍生它们的肽或抗原基本上等价的与待测抗体的结合特异性或/和亲和性。根据本发明并对应于一个特异性表位的肽或抗原也是肽模拟物质，下文称之为肽模拟物，它显示出与上述肽或肽衍生物基本上等价的与待测抗体的结合特异性或/和亲和性。肽模拟物在其与待测抗体的相互作用方面能替代肽，相对于天然肽而言，尤其是与蛋白酶或肽酶相比时，表现出增强的稳定性。产生肽模拟物的方法描述于Giannis和Kolter，Angew.Chem.(应用化学)105(1993)，1303-1326和Lee等，Bull.Chem.Soc.Jpn.66(1993)，2006-2010。表位的长度，即本发明抗原的长度被调整为gp41天然表位的长度。表位的最小长度通常至少为4至6个氨基酸。然而，所选择的长度高于此数目，即为6至20，特别优选为8至15个氨基酸。对肽模拟物或肽衍生物而言，类似的分子长度或尺寸是必需的。为了在免疫测定法中使用，根据本领域技术人员已知的方法提供的本发明抗原可具有如生物素的固相结合基团，如地高辛配基的半抗原，和其它标记物基团，如金属螯合复合物。产生经半抗原标记的肽的方法描述于WO96/03423。产生经金属-螯合物标记的肽的方法描述于WO96/03651。抗原不只能被分开使用，也能作为单个抗原的混合物使用，所述混合物中的各个抗原一次仅含有一个相同表位。具有出现1次以上的表位，即多个表位经常是有利的。多个表位也被称为聚半抗原，聚半抗原尤其适于检测特异性的IgM。在WO96/03652中，公开了这种聚半抗原及其制备方法，也公开了聚半抗原与标记物基团，半抗原和固相结合基团的偶联。优选将本发明的抗原用作聚半抗原，本领域技术人员从WO96/03652中易于概况其制备方法。本发明的另一主题是利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的试剂，所述试剂由以下成分组成a)至少一种衍生自HIV1-D亚型分离物的gp41，优选衍生自共有区-D序列的表位区域II(AA518-533)的抗原，和至少一种衍生自M组不同HIV1-亚型分离物的gp41相应区域的抗原，和/或(b)至少一种衍生自HIV1-E亚型分离物的gp41，优选衍生自共有区-E序列的表位区域I(AA551-565)的抗原，和至少一种衍生自M组不同HIV1-亚型分离物的gp41相应区域的抗原，和免疫测定法所用的其它通常的检测添加物。其它物质是例如缓冲液，盐，去污剂和佐剂，如牛血清白蛋白。所需添加物是本领域技术人员已知的，或者是易于确定的。下列实施例将进一步描述本发明。实施例实施例1合成生物素化的肽通过在分批-肽合成仪，如AppliedBiosystemsA431或A433上合成芴甲氧羰基-(Fmoc)-固相肽，产生HIV-gp41病毒蛋白质的氨基酸序列的相应部分序列。为此，使用了4.0当量的下列各种Fmoc氨基酸衍生物表5</tables>将氨基酸或氨基酸衍生物溶于N-甲基吡咯烷酮。该肽建构在400至500mg4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)-苯氧基树脂(TetrahedronLetters28(1987)，2107)上，上样量为0.4-0.7mmol/g(JACS95(1973)，1328)。以二甲基甲酰胺作为反应介质，在20分钟内，与4当量二环己基碳二亚胺和4当量N-羟基苯并三唑进行Fmoc-氨基酸衍生物的偶联反应。在各个合成步骤后，在20分钟内用20％哌啶在二甲基甲酰胺中分离Fmoc基团。如果该肽含有分子内的二硫键，则在偶联人工间隔区之前，在六氟异丙醇/二氯甲烷中在固相上用碘氧化Fmoc-保护的肽序列(Kober等，ThePeptideAcademicPress，NewYork，11981，pp.145-47)；随后，分离N-末端的Fmoc保护基团，并将间隔区以及N-末端的生物素或二吡啶基-钌复合物偶联。肽从合成树脂上释放和对酸不稳定的保护基的裂解-在赖氨酸上的苯基乙酰基保护基除外-用20ml三氟乙酸，0.5ml乙二硫醇，1ml苯硫基甲烷，1.5g苯酚和1ml水在室温下，40分钟内进行。随后将反应溶液与300ml冷二异丙基醚混合，为了使肽完全沉淀，在0℃保存40分钟。滤出沉淀，用二异丙基醚洗涤，用少量50％乙酸溶解，然后冻干。所得的粗产物通过制备性HPLC在Delta-PAKRPC18材料上以相应的梯度(洗脱剂A水，0.1％三氟乙酸，洗脱剂B乙腈，0.1％三氟乙酸)纯化120分钟(柱子50×300mm，100，15μ)。通过离子喷雾质谱检验所洗脱物质的特性。表6合成的生物素化的肽名称“C(ox)”表示分子内二硫键，“XUZU”是间隔区(见表5)。实施例2合成地高辛配基化的肽按类似于实施例1的方法进行肽合成，如果序列中存在赖氨酸，则使用氨基酸衍生物Fmoc-Lys(PhAc)-OH代替Fmoc-Lys(Boc)-OH进行合成。裂解最后一个间隔区氨基酸的N末端Fmoc保护性基之后即完成了合成。肽从合成树脂上释放和对酸不稳定的保护基裂解的过程中，未从赖氨酸上除去苯基乙酰基保护基。在溶液中通过活性酯衍生物(如地高辛配基-3-羧基甲基酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯)给肽的游离氨基导入地高辛配基或地高辛标记物。将衍生化的肽溶于DMSO和0.1M磷酸钾缓冲液，pH8.5的混合物中，随后，给每个游离伯氨基官能团逐滴加入2当量溶于少量DMSO中的活性酯，并在室温下搅拌。通过分析性HPLC观察反应进程，利用制备性HPLC纯化产物。如果肽含有仍被苯基乙酰基保护的赖氨酸，室温下，在最后一步中，于含水介质中用固定化的PenG-酰胺酶酶促分离此保护基。过滤固定化酶，利用制备性HPLC纯化肽，通过离子喷雾质谱检验所洗脱物质的特性。表7地高辛配基化的肽实施例3评价亚型特异性抗原3.1一般免疫学试验按类似于Enzymuntest抗-HIV1+2+SubtypeO(ref.no.1557319，BoehringerMannheimGmbH，德国)使用说明中所述的方法进行试验。不同的是用肽溶液替代抗原瓶2a和2b(所用抗原量各为5nmol/ml)，而缓冲液和检测试剂未变。根据2步夹心ELISA原理，于25℃，在ES600或ES700仪器(厂商BoehringerMannheimGmbH，德国)中进行试验，样品被置于被链霉亲和素包被的试管中，体积为100微升。使用了下列试剂保温缓冲液Tris50mMpH7.5；牛血清组分缀合缓冲液Tris50mMpH7.5；牛血清组分缀合物过氧化物酶-(POD)标记的羊抗地高辛配基抗体底物ABTS底物溶液(2.2’连氮基-二[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐]1.9mmol/l溶于100mmol/l磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液，pH4.4，过硼酸钠3.2mmol/l)3.2评价结果</tables>经证实使用含有不同HIV亚型的抗原的抗原混合物比使用单个抗原有利使用抗原混合物可较早识别(较高稀释度)的感染样品，即通过使用抗原混合物，能以积极的方式影响稀释敏感性。使用本发明的抗原混合物可更可靠地检测B亚型和D亚型的感染。相对于D亚型特异性抗原而言，B亚型血清与较高稀释度的B亚型特异性抗原反应。类似地，D亚型血清与较高稀释度的D亚型特异性抗原呈阳性反应，而它们较少与B亚型特异性抗原反应。权利要求1.利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的方法，其中(a)使用了至少一种HIV1-D亚型分离物的gp24抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原，和/或(b)使用了至少一种HIV1-E亚型分离物的gp24抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原。2.权利要求1的方法，其中(a)使用了至少一种衍生自HIV1-D亚型分离物共有序列表位区域II的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41相应区域的抗原，和/或(b)使用了至少一种衍生自HIV1-E亚型分离物共有序列表位区域I的抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41相应区域的抗原。3.权利要求1的方法，其中HIV1-D亚型分离物的gp41的抗原对应于SEQIDNO1至11或其部分序列和/或HIV1-E亚型分离物的gp41的抗原对应于SEQIDNO12或其部分序列。4.由至少两种抗原组成的抗原混合物，其中至少一种抗原衍生自HIV1-D亚型分离物的gp41，至少一种抗原为HIV1M组不同亚型的gp41的抗原，和/或至少一种抗原衍生自HIV1-E亚型分离物的gp41，至少一种抗原为HIV1M组不同亚型的gp41的抗原。5.权利要求4的抗原混合物，其中HIV1-D亚型分离物的gp41的抗原衍生自HIV1-D亚型共有序列表位区域II，和/或HIV1-E亚型分离物的gp41的抗原衍生自HIV1-E亚型共有序列表位区域I。6.权利要求4或5的抗原混合物，其中HIV1-D亚型分离物的gp41的抗原对应于SEQIDNO1至11或其部分序列，最小长度为7AA，和/或HIV1-E亚型分离物的gp41的抗原对应于SEQIDNO12或其部分序列，最小长度为6AA。7.权利要求4至6中任一项的抗原混合物，其中使用了衍生自HIV1O亚型的表位区域I和/或II的其它抗原。8.含有根据SEQIDNO1至11的序列或其部分序列，最小长度为7AA的抗原。9.含有根据SEQIDNO12的序列或其部分序列，最小长度为6AA的抗原。10.权利要求5至7中任一项的抗原混合物用于检测抗HIV抗体的用途。11.权利要求8或9的抗原用于检测抗HIV抗体的用途。12.权利要求8或9的抗原或权利要求5至7中的任一项的抗原混合物在根据DE19709762.6的联合试验中用于检测抗HIV抗体的用途。13.利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的试剂，它由以下成分组成(a)至少一种HIV1-D亚型分离物的gp24抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原，和/或(b)至少一种HIV1-E亚型分离物的gp24抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原，和免疫测定法平常所用的试验添加物。14.利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的试剂，它由以下成分组成(a)至少一种来自HIV1-D亚型分离物共有序列表位区域II的gp41抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原，和/或(b)至少一种来自HIV1-E亚型分离物共有序列表位区域I的gp41抗原，和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原和免疫测定法平常所用的试验添加物。全文摘要本发明涉及利用免疫测定法检测抗HIV的抗体的方法,其中使用了至少一种HIV1－D亚型分离物的env基因产物gp41的抗原,和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原,和/或使用了至少一种HIV1－E亚型分离物的gp41的抗原,和至少一种衍生自HIV1M组不同亚型的gp41的抗原。本发明还涉及分别含有衍生自HIV1－D亚型分离物的gp41和HIV1－E亚型分离物的gp41的组分的抗原和抗原混合物,及其用于检测HIV抗体和用作试剂盒的用途。文档编号G01N33/569GK1263536SQ98807173公开日2000年8月16日申请日期1998年5月13日优先权日1997年5月16日发明者F·多尼,E·法兹,E·霍尔斯申请人:罗赫诊断器材股份有限公司