专利名称：一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测体液细胞结核杆菌早期分泌抗原靶ESAT6的免疫细胞化学染色试剂盒。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的人兽共患慢性传染病，是威胁人类的三大传染性疾病之一，目前全世界大约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年大约有200-300万人死于结核。加之多重耐药结核菌的流行、人类免疫缺陷病毒的感染及贫穷等多种因素的影响，结核病发病率呈日益回升的严重趋势，结核性脑膜炎(TBM)的发病率亦逐渐升高。结核性脑膜炎是严重的中枢神经系统感染性疾病，病死率和病残率均较高。因此，早期、快速、有效的病原学诊断对及时治疗结核性脑膜炎、减少病死率和后遗症极其重要。目前常用的结核分支杆菌感染的检测方法包括
脑脊液抗酸杆菌涂片法具有简便、快速、价廉的优点，但阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌> io4/mi才能找到，特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需要通过进一步的试验才能确定是否为结核分支杆菌，无法区分死菌和活菌。结核分枝杆菌培养检查，培养时间较长，需4 8周，且阳性率低，多在20 30%， 对临床早期诊断价值有限。分子生物学具有敏感、快速、特异、高效等优点，但在大批量临床应用中，PCR作为一种诊断手段仍然存在一定的假阳性和假阴性，污染、扩增循环过多或退火温度过低而引起非特异性扩增产物从而产生假阳性，需要相应的检测设备且检测费用高。结核菌素皮肤试验(TST )是建立在机体对PPD迟发性超敏反应的基础上，但PPD是将结核分支杆菌培养物加热灭活和沉淀制成的一组蛋白质，为成分不明确的复合抗原，其许多成分与卡介苗和非结核分枝杆菌的抗原成分相同，因此，在卡介苗接种率和非结核分枝杆菌感染率较高的地区，TST方法的特异度较低。对于免疫低下者、近期感染者、年幼儿童及营养不良者，TST方法缺乏足够的灵敏度。另外，TST方法缺乏一个内在固有数值来判定一个人是否存在结核杆菌的感染，该方法以某数值为界来判断某人是否存在结核杆菌潜伏感染，不同的界值可能会对个体的划分产生错误，影响方法的灵敏度和特异度。生化检查方法具有重要的诊断价值，但患者多数入院前已经过抗菌、抗病毒、抗痨甚至激素等治疗，使脑脊液呈不典型改变。结核抗体测定是结核病研究和应用报道最多的方法。MTB患者的脑脊液中抗MTB IgG抗体高于其自身血液中特异性IgG抗体，说明中枢神经系统能局部合成抗体，经受损血脑屏障转送到CSF中。综合多家报道，结核抗体检测的假阳性率在2 15%，假阴性率在5 45%。抗体检测不能鉴别是MTB的急性感染还是以前对MTB的暴露，更不能解决TBM早期诊断的问题。结核抗原测定，由于MTB被吞噬、形成抗原抗体复合物，及抗原量少往往会造成一定的假阴性。另外，在结核抗原的检测中，由于MTB与属内外某些微生物有共同的抗原，往往会造成一定的假阳性。90年代后期发展起来的以PPD为抗原的外周血单个核细胞刺激试验或干扰素(IFN)-Y释放试验明显提高了诊断的灵敏性，但最大的缺陷仍是缺乏特异性抗原。因此，寻找结核特异性抗原对结核病诊断至关重要。目前，TBM呈常年发病、不典型表现病例增多及各年龄组均有分布等特点，其中以不典型的临床表现和不典型的CSF实验室检查结果增多最为突出。加之上述结核杆菌检测方法的缺陷，因此获得一个能够诊断TBM的确切方法成为当务之急。ESAT-6是MTB在感染早期分泌释放于菌体外的一种蛋白，游离于培养基中或存在于感染细胞的吞噬小体内。它仅存在于致病性分支杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分支杆菌及某些非典型分支杆菌(如堪萨斯分支杆菌、苏尔加分支杆菌和海水分支杆菌)。在MTB诸多的分泌蛋白中，ESAT-6在卡介苗和大多数非致病性分支杆菌中缺失， 因此特异性较强。

发明内容
为克服现有临床上结核性疾病诊断方法方面的上述缺陷，本发明提供一种基于传统免疫细胞化学染色法检测结核杆菌分泌抗原ESAT-6的试剂盒，该试剂盒可从少量体液中简单，快捷的检测出结核杆菌。本发明实现过程如下
一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，包括下述部件
1)A液，1管，内装APES;
2)B液，1管，内装丙酮甲醛固定液；
3)C 液，1 管，内装 0. 3% TritonX-IOO ；
4)D液，1管，内装封闭液；
5)E液，1管，内装兔源ESAT-6多克隆抗体；
6)F液，1管，内装抗兔生物素标记抗体；
7)G液，1管，内装辣根过氧化物酶标记链亲和素；
8)H液，2管，内装DAB显色A液和B液，使用前1 1混合；
9)I液，1管，内装苏木素溶液。所述丙酮甲醛固定液的配置方法为将丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸盐缓冲液中，并将PH值调至6. 6，过滤备用；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠20mg和磷酸二氢钾 IOOmg溶于双蒸馏水30ml得到。所述0. 3%TritonX-100 的配置方法为将 30% TritonX-IOO 稀释 100 倍，所述 30% TritonX-IOO由30ml TritonX-IOO加入70ml双蒸水中混勻、过滤得到。所述封闭液的配置方法为将小牛血清白蛋白(BSA)l. 00g，叠氮纳0. 08g, IOml胎牛血清加入70ml 0. OlMPBS中，用盐酸或氢氧化钠调pH值至7. 4，置4°C冰箱保存。所述体液为脑脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。上述检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法所述试剂盒使用时需要用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞；采用1 3-氨丙基-3-乙氧甲硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilance, APES)挂胶的载玻片；并采用 0. 3%TritonX-100 处理细胞。所述制作APES挂胶的载玻片操作步骤为
1)将载玻片在碱性洗涤液中清洗晾干后，载玻片过酸清洗晾干；
2)将晾干的载玻片浸入经丙酮1 50稀释的APES胶中30s，后经丙酮溶液浸泡30s， 涮去未结合的APES，浸泡两次；
3)将挂好胶的载玻片晾干装盒备用。具体地说，检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法包括以下步骤
1)将APES挂胶的载玻片装载于细胞玻片离心沉淀仪上；
2)将体液细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加于载玻片上，于细胞玻片离心沉淀仪 52g离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；
3)B液固定30秒，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗；
4)滴加C液于细胞面上处理细胞30分钟，后用pH7. 4的0. OlM磷酸盐缓冲液洗涤3 次，每次3-5min ；
5)滴加3% 于细胞面上，置37°C湿盒内避光孵育10-30分钟，后用0.OlM PBS洗涤 3次，每次3-5min ；
6)滴加D液于细胞面上，置37°C湿盒内孵育15-30分钟，后弃去D液；
7)滴加E液(1 200稀释)，置4°C冰箱，湿盒内孵育12小时，后弃去E液，0. OlM PBS 洗涤3次，每次3-5分钟；
8)滴加F液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置37°C湿盒内温浴1小时，后弃去F液， 0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；
9)滴加G液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置湿盒内37V温浴1小时，后弃去G液， 0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；
10)滴加配制好的H液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，避光显色5-10分钟，后自来水冲洗，终止反应，I液复染3-5分钟，后自来水冲洗，并浙去载玻片上剩余的水，待载玻片干燥后镜检。本发明试剂盒可从少量体液中简单，快捷，准确的检测出细胞内的ESAT6抗原。在本发明中，所述的检测体液细胞结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒采用FUM-6型细胞玻片离心沉淀仪收集细胞，沉淀仪的使用极大的提高了细胞收集率，再加上载玻片上黏附剂APES的使用，即减少了样本的使用量，同时又提高了细胞收集率；使用 TritonX-100，增强细胞通透性，利于细胞内外结合杆菌分泌的EAST-6抗原与抗体结合，其有效地提高了患者体液中结核杆菌的检出率。


图1为采用本发明试剂盒检测结核性脑膜炎患者脑脊液中结核抗原ESAT-6的免疫细胞化学染色法镜检图2为采用本发明试剂盒免疫细胞化学染色方法检测结核性脑膜炎和非结核性脑膜炎患者脑脊液细胞中结核杆菌分泌抗原PPD，38-kD，Ag85以及ESAT-6在单核细胞中检测到的阳性率。
具体实施例方式本试剂盒是基于传统的免疫细胞组织化学染色方法检测体液细胞结核杆菌分泌抗原ESAT-6。TBM患者CSF白细胞数目较多，本试剂盒采用FMU-5型的小腔型CSF细胞玻片离心沉淀器(孔径5mm、容量约200ul)收集细胞，制作标本所需CSF量较少，使用APES或明胶挂胶的载玻片以及0. 3%TritonX-100处理细胞，实现从少量体液细胞中简单，快捷，准确的检测出ESAT-6抗原，从而利于结核性疾病的诊断。在本发明的一个具体实施方案中，以脑脊液为例，采用本发明试剂盒进行如下步骤
1)将挂胶载玻片装载于FUM-6型细胞涂片离心沉淀器上，使离心沉淀器与载玻片之间松紧适度且用力均勻；
2)将脑脊液经细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加适量于沉淀器中的载玻片上，于 FUM-6型细胞玻片离心沉淀仪52g离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；
3)丙酮甲醛固定液固定30秒，后蒸馏水自玻片一端轻缓冲洗；
4)滴加权利要求1所述的0.3%TritonX-100于细胞面上处理细胞30分钟，后用0. OlM CpH 7.4)磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3-5min ；
5)滴加3% 于细胞面上，置37°C湿盒内避光孵育10-30分钟，后用0.OlM PBS洗涤 3次，每次3-5min ；
6)滴加正常山羊血清封闭液于细胞面上，置37°C湿盒内孵育15-30分钟，后弃去封闭
液；
7)滴加兔源ESAT-6多克隆抗体(1 200稀释)，置4°C冰箱，湿盒内孵育12小时，后弃去ESAT-6多克隆抗体，0. OlM PBS洗涤3次，每次3_5分钟；
8)滴加抗兔生物素标记抗体于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置37°C湿盒内温浴1小时，后弃去抗兔生物素标记抗体，0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；
9)滴加辣根过氧化物酶标记链亲和素于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置湿盒内37。C 温浴1小时，后弃去辣根过氧化物酶标记链亲和素，0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；
10)滴加DAB于细胞面上，并完全覆盖细胞面，避光显色5-10分钟，后自来水冲洗，终止反应，苏木素复染3-5分钟，后自来水冲洗，并浙去玻片上剩余的水，待玻片干燥后镜检。如图1所示，其中单核细胞内棕色颗粒状物质为结核抗原ESAT-6。如图2所示，结核杆菌分泌抗原PPD，38-kD，Ag85以及ESAT-6在结核性脑膜炎患者的脑脊液单核细胞中检测到的阳性率均高于非结核性脑膜炎患者，P值小于0. 05，差异显著。抗原38-kD的差异度最高，ROC曲线下面积为0. 874 (95% Cl, 0. 805 -0. 964)；抗原ESAT-6的ROC曲线下面积为 0. 869 (Cl, 0.783 to 0.955)；抗原 PPD 的 ROC 曲线下面积为 0. 816 (Cl, 0. 721-0. 968)以及抗原Ag85的ROC曲线下面积为0. 795 (Cl, 0. 733-0. 933)。由此可见，在脑脊液单核细胞中检测抗原38-kD和ESAT-6有利于结核性脑膜炎的诊断。
权利要求
1.一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于包括下述部件1)A液，1管，内装APES;2)B液，1管，内装丙酮甲醛固定液；3)C 液，1 管，内装 0. 3% TritonX-IOO ；4)D液，1管，内装封闭液；5)E液，1管，内装兔源ESAT-6多克隆抗体；6)F液，1管，内装抗兔生物素标记抗体；7)G液，1管，内装辣根过氧化物酶标记链亲和素；8)H液，2管，内装DAB显色液；9)I液，1管，内装苏木素溶液。
2.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于丙酮甲醛固定液的配置方法为将丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸盐缓冲液中，并将PH值调至6. 6，过滤备用；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠20mg和磷酸二氢钾IOOmg溶于双蒸馏水30ml得到。
3.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于0. 3%TritonX-100的配置方法为将30% TritonX-IOO稀释100 倍，所述30% TritonX-IOO由30ml TritonX-IOO加入70ml双蒸水中混勻、过滤得到。
4.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于封闭液的配置方法为将小牛血清白蛋白l.OOg，叠氮化钠0. 08g, IOml胎牛血清加入70ml 0. OlMPBS中，用盐酸或氢氧化钠调pH值至7. 4，置4°C冰箱保存。
5.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于所述体液为脑脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。
6.权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于所述试剂盒使用时需要用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞； 采用21 3-氨丙基-3-乙氧甲硅烷APES挂胶的载玻片；并采用0. 3%TritonX-100处理细胞。
7.根据权利要求6所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于制作APES挂胶的载玻片操作步骤为1)将载玻片在碱性洗涤液中清洗晾干后，载玻片过酸清洗晾干；2)将晾干的载玻片浸入经丙酮1 50稀释的APES胶中30s，后经丙酮溶液浸泡30s， 涮去未结合的APES，浸泡两次；3)将挂好胶的载玻片晾干装盒备用。
8.根据权利要求6所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤1)将APES挂胶的载玻片装载于细胞玻片离心沉淀仪上；2)将体液细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加于载玻片上，于细胞玻片离心沉淀仪离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；3)B液固定30秒，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗；4)滴加C液于细胞面上处理细胞30分钟，后用pH为7.4的0. OlM磷酸盐缓冲液洗涤 3次，每次3-5min ；5)滴加3% 于细胞面上，置37°C湿盒内避光孵育10-30分钟，后用0.OlM PBS洗涤 3次，每次3-5min ；6)滴加D液于细胞面上，置37°C湿盒内孵育15-30分钟，后弃去D液；7)滴加E液，置4°C冰箱，湿盒内孵育12小时，后弃去E液，0.OlM PBS洗涤3次，每次 3-5分钟；8)滴加F液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置37°C湿盒内温浴1小时，后弃去F液， 0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；9)滴加G液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置湿盒内37V温浴1小时，后弃去G液， 0. OlM PBS洗涤3次，每次3-5分钟；10)滴加H液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，避光显色5-10分钟，后自来水冲洗，终止反应，I液复染3-5分钟，后自来水冲洗，并浙去载玻片上剩余的水，待载玻片干燥后镜检。
全文摘要
本发明公开了一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，包括丙酮甲醛固定液、0.3%TritonX-100、封闭液、兔源ESAT-6多克隆抗体、抗兔生物素标记抗体、辣根过氧化物酶标记链亲和素、DAB显色液和苏木素溶液。本发明试剂盒可从少量体液中简单，快捷，准确的检测出细胞内的ESAT6抗原。采用FUM-6型细胞玻片离心沉淀仪收集细胞，沉淀仪的使用极大的提高了细胞收集率，再加上载玻片上黏附剂APES的使用，既减少了样本的使用量，同时又提高了细胞收集率，有效地提高了患者体液中结核杆菌的检出率。
文档编号G01N33/569GK102565393SQ20121001066
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月15日 优先权日2012年1月15日
发明者赵钢 申请人:中国人民解放军第四军医大学