专利名称：一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，简称SPR) 传感器检测睾酮的方法，属于激素检测分析技术领域。
背景技术：
睾酮是一种类固醇类激素，准确检测其含量在环境监测、食品安全等方面具有重 要的意义和作用。目前应用于睾酮素检测的方法主要有气相色谱/质谱、同位素稀释质谱法、薄层 色谱、化学发光、高效液相色谱、酶联免疫分析法、放射免疫分析法等。由于气相、液相色谱 与质谱仪器昂贵、操作麻烦，而薄层色谱的灵敏度较低，不适合定量分析。因此，对睾酮的检 测多是采用自60年代发展起来的放射免疫分析方法和80年代兴起的酶联免疫分析法。放 射免疫分析法必须采用放射性标记物，检测设备复杂，必需用专门的放射性探测器进行测 定，对操作人员也有放射性污染与伤害，需要特殊的防护和去污设备，此外，因所使用的放 射性标记物的放射性核素时刻都在发生衰变，特别是如常用的碘-125、碘-131和磷-32等 半衰期短的核素，其保存时期不长，也给测试带来了不便。酶联免疫分析法虽然避免了放射 免疫分析法的污染、繁琐、保存期短等问题，但由于其检测范围窄、灵敏度低等缺点仍不能 满足需求。在此背景下，国内外学者积极开发新的检测技术和样品预处理方法，通过不同途 径进行努力，以寻求建立灵敏、准确、经济、快速的检测方法。在这方面，表面等离子体共振 传感器显示出很大的优势。表面等离子体共振是一种物理光学现象，它通过测量金属表面物质折射率的变化 来研究物质的化学和物理吸附性质。基于该效应的生物传感技术已广泛应用于免疫学、药 物筛选等多个生化研究领域。与常规检测技术相比，表面等离子体共振具有高灵敏度、响应 快、检测过程快捷、能够获得实时数据、操作方便、无需标记、可保持分子的生物活性等突出 优点，因此受到人们的广泛关注。免疫分析方面的研究是表面等离子体共振传感技术应用 时间最早、应用范围最广并且发展最为完善的领域之一，然而由于该技术对检测环境要求 苛刻、造价昂贵以及芯片重复使用性能较差等难以克服的缺点，限制了表面等离子体共振 技术在实际检测中的应用。为了进一步改善表面等离子体共振传感器的性能和应用范围， 科研工作者们开始将分子印迹技术与表面等离子体共振技术相结合，制备出新型的表面等 离子体共振传感器。这种新型的传感器不仅仅局限于生物样品分子，不再受到生物活性探 针分子的限制，而且还提高了传感器芯片的重复使用率。本发明利用光接枝分子印迹聚合物膜的方法制备了表面等离子体共振传感器芯 片，并利用该芯片对睾酮进行了检测。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有的检测睾酮含量的方法存在的不足，提供一种利用 表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，可以应用于睾酮超低含量的检测。
本发明的原理是将一种睾酮分子印迹识别敏感芯片作为表面等离子体共振传感 器的传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，根据表面等离子体共振原理，芯片共振角 的变化值与待测样品的浓度成正比，因此根据共振角变化值可以测出样品中睾酮的含量。一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，以睾酮分子印迹识别敏感芯 片作为表面等离子体共振传感器的传感芯片，睾酮分子印迹识别敏感芯片包括玻璃基片、 金膜层、单分子烷基链层和分子印迹聚合物膜；该芯片由下往上依次为玻璃基片、金膜层、 单分子烷基链层和分子印迹聚合物膜；所述的单分子烷基链层的结构式为Au-(CH2)nCH3，其中η = 5-17 ；所述分子印迹聚合物膜由目标睾酮模板分子、功能单体、交联剂、制孔剂以及光引 发剂经光照聚合反应得到，所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯 酸羟乙酯中的一种或两种；所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N, N-二甲基丙烯酰胺、 Ν，Ν-亚甲基二丙烯酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基 丙烯酸酯、二乙烯基苯中的一种；所述制孔剂为二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲 酰胺、二甲基亚砜中的一种；光引发剂为二苯甲酮、安息香双甲醚、安息香叔丁醚中的一种 或几种。一种表面等离子体共振传感器芯片的制备方法，其具体步骤为1)采用真空蒸镀或溅射的方法在玻璃基片上镀金膜层；2)将步骤1)中得到的玻璃基片浸入烷基硫醇溶液中，室温放置5 24h，浸泡完 成后在金膜层2上自组装一层单分子烷基链层；3)将步骤2)中得到的玻璃基片装入表面等离子体共振传感器中，表面等离子体 共振传感器中的流通池用透紫外光玻璃片盖住，在透紫外光玻璃片背后安装紫外灯；向表 面等离子体共振传感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用紫外灯照射聚合溶液，光照时 间根据所需分子印迹聚合物膜的厚度决定；4)在步骤3)得到的玻璃基片用制孔剂与乙酸配制的高极性洗脱剂洗脱睾酮模板 分子，在分子印迹聚合物膜上留下具有选择性的空穴和结合位点，得到基于光接枝分子印 迹聚合物膜的表面等离子体共振传感器芯片；步骤2)中所述烷基硫醇溶液的溶剂为乙醇、甲醇或三氯甲烷中的一种，所述烷基 硫醇溶液浓度为1 lOOmmol/L，所述烷基硫醇的化学式为HS (CH2)nCH3，其中η = 5-17 ；步骤3)中所述聚合溶液由浓度为0. 01-0. 05mol/L的睾酮模板分子、功能单体、交 联剂、制孔剂、光引发剂及溶剂组成，其中睾酮模板分子与功能单体的浓度比为1 2 4， 睾酮模板分子与交联剂的浓度比为1 4 10，所述光引发剂的浓度为0.1% l%g/ml;所述功能单体为丙烯酸、甲基丙烯酸、亚甲基丁二酸、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种 或两种，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二丙烯 酰胺、季戊四醇三丙烯酸酯、季戊四醇四丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯 基苯中的一种，所述制孔剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基 亚砜中的一种，所述光引发剂为二苯甲酮、安息香双甲醚、安息香叔丁醚中的一种或几种。本发明的一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，其具体步骤为1)将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，将有机溶剂 注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使有机溶剂在流通池和表面等离子体共振传感器中的溶剂瓶中循环，当表面等离子体共振传感器的反射光强稳定不变时，对芯片进行角 度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到芯片在有机溶剂中的共振角度θ 1 ；2)利用有机溶剂分别配制不同浓度的睾酮标准溶液，然后按照由低到高的浓度顺 序，分别单独注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使睾酮标准溶液在流通池和试剂 瓶中循环；每注入一种标准溶液后，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定不变时，再次注 入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振 光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θη;3)利用表面等离子体共振光谱图计算每种标准溶液相对于有机溶剂的共振角度 θ 1的角度位移值Δ θ，Δ θ = θ η- θ \然后以Δ θ为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为 横坐标绘制标准曲线；4)将待测样品溶液注入流通池，使待测样品溶液在流通池和样品瓶中循环，监测 动力学吸附曲线，待反射光强稳定时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对 芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到待测样品的共振角度θχ，计算待 测样品相对于有机溶剂的共振角度θ 1的角度位移值Δ θ % Δ θ χ = θ ι θ S根据Δ θ χ在 标准曲线上得到睾酮的含量；上述步骤1)、步骤2)及步骤4)中的有机溶剂均相同，为二氯甲烷、正己烷、三氯甲 烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜类化合物或杂环类化合物中的一种或两种。有益效果本发明利用一种睾酮分子印迹识别敏感芯片作为表面等离子体共振传感器的传 感芯片，采用表面等离子体共振检测法测定样品中睾酮的含量；该测试方法具有响应快速， 一般5-10分钟内即可出结果；选择性高，能够有效测定样品中睾酮的超低含量；相对于免 疫学的方法而言，本方法对于检测环境要求不是特别苛刻，扩大了应用范围，传感器芯片可 以重复利用，降低了检测成本。


图1为表面等离子体共振仪芯片结构示意图；图2为实施例1中的标准曲线；1-玻璃片基片，2-金膜层，3-单分子烷基链层，4-分子印迹聚合物膜层。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。实施例1一种表面等离子体共振传感器芯片，如图1所示，包括玻璃基片1、金膜层2、单分 子烷基链层3和分子印迹聚合物膜4 ；该芯片由下往上依次为玻璃基片1、金膜层2、单分子 烷基链层3和分子印迹聚合物膜4 ；所述的单分子烷基链层3的结构式为Au- (CH2) nCH3 ；所述分子印迹聚合物膜4由模板分子、功能单体、交联剂、制孔剂以及光引发剂经 光照聚合反应得到，模板分子为所要印迹的目标分子睾酮，功能单体为甲基丙烯酸；交联剂 为乙二醇二甲基丙烯酸酯；制孔剂为乙腈；
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一种表面等离子体共振传感器芯片的制备方法，其具体步骤为1)采用真空蒸镀的方法在玻璃基片1上镀金膜层2 ；具体蒸镀的方法为将 2. 5X 30cm的LASFN9玻璃片放入立式染色缸里，采用2%的去污剂水超声清洗15分钟，然 后在二次蒸馏水中超声浸泡15分钟，最后用乙醇清洗2次，将载玻片用氮气吹干；之后在新 制的Piranha溶液即H2SO4与30% H2O2的体积比为3 1的溶液中于60°C加热一个小时； 再依次用蒸馏水、乙醇冲洗，用氮气吹干；将清洗好的玻璃片进行真空蒸镀99. 99%的金， 真空度为1 X ΙΟ"5以上，蒸镀速率为1A/S，厚度为47nm ；2)将步骤1)中得到的玻璃基片1浸入十二烷基硫醇乙醇溶液中，室温放置24h， 浸泡完成后在金膜层2上自组装一层单分子烷基链层3 ；3)将步骤2)中得到的玻璃基片1装入表面等离子体共振传感器中，表面等离子 体共振传感器中的流通池用透紫外光的BK7玻璃片盖住，在BK7玻璃片背后安装波长λ为 365nm的UV-LED点光源；向表面等离子体共振传感器中的流通池中注入聚合溶液，然后用 波长λ为365nm的UV-LED点光源照射聚合溶液，光照70分钟后停止光照；溶液的组成为 25mM睾酮模板分子，IOOmM甲基丙烯酸，150mM 二甲基丙烯酸乙二醇酯交联剂以及0. 5%克 /毫升二苯甲酮光引发剂的乙腈溶液；4)在步骤3)得到的玻璃基片1用体积比为7 3的乙腈与乙酸混合溶液洗脱模 板分子，得到睾酮分子印迹识别敏感芯片；5)将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，将有机溶剂 乙腈注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使乙腈在流通池和表面等离子体共振传感 器中的溶剂瓶中循环，当表面等离子体共振传感器的反射光强稳定不变时，对芯片进行角 度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到芯片在有机溶剂中的共振角度Q1 = Siocr ；6)利用有机溶剂乙腈分别配制不同浓度的睾酮标准溶液，浓度分别为10_2%01/ L、l(T18mol/L、l(T16mol/L、l(T14mol/L、l(T12mol/L、1 (T1V) 1/L、l(T8mol/L 和 l(T6mol/L，然后按 照由低到高的浓度顺序，分别单独注入流通池，使睾酮标准溶液在流通池和试剂瓶中循环； 每注入一种标准溶液后，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定不变时，再次注入有机溶剂 直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到 每种标准溶液对应的共振角度θ η ；7)利用表面等离子体共振光谱图计算每种标准溶液相对于有机溶剂的共振角度 θ 1的角度位移值Δ θ , Δ θ = θ η-θ S见表1，然后以Δ θ为纵坐标，以睾酮标准溶液的 浓度为横坐标绘制标准曲线，相关系数为R2 = 98. 82% ；如图2所示；8)将待测样品溶液注入流通池，使待测样品溶液在流通池和样品瓶中循环，监 测动力学吸附曲线，待反射光强稳定时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变 时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到待测样品的共振角度θ χ = 69. 46，计算待测样品相对于有机溶剂的共振角度θ 1的角度位移值Δ θ χ = 0. 46，Δ θ χ = θ ι θ\根据Δ θ χ在标准曲线上得到睾酮的含量为l(T13_7m0l/L，如图2所示。表1不同浓度溶液的共振角变化值
权利要求
一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，其特征在于具体步骤为1)将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，将有机溶剂注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使有机溶剂在流通池和表面等离子体共振传感器中的溶剂瓶中循环，当表面等离子体共振传感器的反射光强稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到芯片在有机溶剂中的共振角度θ1；2)利用有机溶剂分别配制不同浓度的睾酮标准溶液，然后按照由低到高的浓度顺序，分别单独注入表面等离子体共振传感器中的流通池，使睾酮标准溶液在流通池和试剂瓶中循环；每注入一种标准溶液后，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定不变时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θn；3)利用表面等离子体共振光谱图计算每种标准溶液相对于有机溶剂的共振角度θ1的角度位移值Δθ，Δθ＝θn-θ1，然后以Δθ为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线；4)将待测样品溶液注入流通池，使待测样品溶液在流通池和样品瓶中循环，监测动力学吸附曲线，待反射光强稳定时，再次注入有机溶剂直至反射光强再次稳定不变时，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到待测样品的共振角度θx，计算待测样品相对于有机溶剂的共振角度θ1的角度位移值Δθx，Δθx＝θx-θ1，根据Δθx在标准曲线上得到睾酮的含量；上述步骤1)、步骤2)及步骤4)中的有机溶剂均相同，为二氯甲烷、正己烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、砜类化合物或杂环类化合物中的一种或两种。
全文摘要
本发明涉及一种利用表面等离子体共振传感器检测睾酮的方法，属于激素检测分析技术领域。将睾酮分子印迹识别敏感芯片固定在表面等离子体共振传感器中，对芯片进行角度扫描，记录表面等离子体共振光谱图，得到共振角度θ1；记录表面等离子体共振光谱图，得到每种标准溶液对应的共振角度θn；以Δθ＝θn-θ1为纵坐标，以睾酮标准溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线；将待测样品溶液注入流通池，记录表面等离子体共振光谱图，得到共振角度θx，计算Δθx＝θx-θ1，根据Δθx在标准曲线上得到睾酮的含量。本发明具有响应快速，一般5-10分钟内即可出结果；选择性高，能测定睾酮的超低含量；传感器芯片可重复利用，降低了检测成本。
文档编号G01N21/41GK101887016SQ20101019304
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月7日 优先权日2010年6月7日
发明者王洋, 韦天新, 魏清泉 申请人:北京理工大学