专利名称：丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法
技术领域：
本发明涉及安培免疫传感器中的丝网印刷电极，具体涉及丝网印刷电极的癌胚抗 原工作电极的制备方法。
背景技术：
癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种多糖蛋白复合物，属于非器官 特异性肿瘤相关抗原，是肿瘤诊断和病情监测中最常用的肿瘤标志物之一。分泌CEA的肿 瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。正常情况下，CEA经胃肠道代谢，而肿 瘤状态时的CEA则进入血液和淋巴循环，引起血清CEA异常增高，如结/直肠癌、肺癌、乳腺 癌、膀胱癌和卵巢癌患者中，血清CEA量会明显升高，尤其是CEA被临床认为是结/直肠癌 的特异性肿瘤标志物。目前临床检测血清中CEA方法，主要有放射免疫法(RIA)、化学发光 法(CL)、时间分辨免疫荧光分析法(TRFIA)以及酶联免疫吸附试验法(ELISA)。RIA法虽然 有较好的灵敏度，但稳定性欠佳，且有放射性污染之嫌，操作时间长。CL法虽然有较好的灵 敏度和稳定性，但目前试剂和仪器全部为进口产品，成本相对较高。TRFIA法需要稀土离子 标记抗原或抗体，标记物制备复杂，耗时且由于各批次检测结果均采用同一标准曲线定量， 所以标准曲线要求很高。ELISA法灵敏度及稳定性不够好，假阳性较高。安培免疫传感器中的丝网印刷电极(SPCEs)结合了电化学检测的高灵敏度和免 疫分析的高特异性，具有样品用量小、检测快速，结果准确等突出优点，已应用于免疫标志 物检测。如公开号为CN1908665的发明专利申请，就公开了该传感器包括反应池、金薄膜的 工作电极、钼薄膜的对电极和参比电极的丝网印刷电极，该工作电极上固定有“混合自组装 膜_纳米金_蛋白质_抗体”组成的生物分子敏感膜，该生物分子敏感膜制备方法是先在 工作电极表面涂上H2O2和H2SO4混合液，其次涂上巯基化合物，然后涂上纳米金溶胶，最后滴 涂有定向固定在蛋白质的待测抗原对应的抗体。另如公开号为CN101532980的发明专利申 请，其公开的丝网印刷电极的工作电极上固定有“酶标记志贺氏菌抗体-碳纳米管-壳聚 糖”组成的敏感膜，该敏感膜制备方法是先将碳纳米管与壳聚糖溶胶混合，再加入酶标记 志贺氏菌抗体得到酶标记志贺氏菌抗体_碳纳米管_壳聚糖混合物，然后将酶标记志贺氏 菌抗体_碳纳米管_壳聚糖混合物涂于丝网印刷电极的工作电极表面，涂膜后的工作电极 用含02 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液保存。但目前安培传感器存在以下不足1、在使用时需要外加二茂铁或铁氰化钾等电子 媒介体(eT)于反应池中进行检测，这增加了免疫分析系统的复杂性，导致工作电极表面的 抗体易失活，灵敏度和使用寿命受到很大影响；2、工作电极多为一次性使用，电极不能再 生，原因是工作电极表面的抗体发生免疫结合反应后，免疫生成物很难除去；3、对背景非常 复杂的具体检测对象(如血清样品)，往往需通过一定的样品提纯处理后再进行检测，增加 了检测时间、检测过程，降低了检测的准确性。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测的血清样品不必提纯处理，使用时无 需外加电子媒介体，每次使用后电极表面可再生的丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制 备方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为丝网印刷电极的癌胚抗原工作电 极的制备方法，包括下述步骤1)将浓度为0. 01 0. Imol · L—1三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液 5 IOmL置于离心管中，再加入浓度为Img · ml/1金磁纳米微粒(简称GMP 以四氧化三铁 为核纳米金为壳，购自美国sigma公司)溶液5 10 μ L和浓度为1 3mg · mL^CEA抗体 溶液10 μ L，在25 37°C下振荡反应20 30分钟；2)将上述离心管置于磁性分离器中，在0. 1 0. 3mT的磁场下磁性分离3 10分 钟，弃上清液，这样CEA抗体就包被在GMP表面；3)再在离心管中加入pH7. 0浓度为0. 2 Imol化―1的磷酸盐缓冲液(PBS) 5mL和 浓度为10 15mg -mr1的牛血清蛋白(BSA)溶液5 μ L，室温下搅拌1小时，在0. 1 0. 3mT 的磁场下磁性分离3 10分钟，弃上清液，重复本步骤3次，得到金磁纳米微粒-CEA抗体 溶液备用；经本步骤3次，进一步封闭包被CEA抗体，同时未包被的CEA抗体被分离；4)在工作电极表面滴涂含有普鲁斯蓝浓度为2 5mol ·厂1和聚四氟乙烯质量百 分浓度为5%的水溶液2-5μ L，室温干燥后，得到固定有聚四氟乙烯阳离子交换膜(Nafion 膜)的工作电极；一般干燥5-10分钟，工作电极表面就形成Nafion膜；上述含普鲁斯蓝和 聚四氟乙烯的水溶液的用量依工作电极大小而定，以滴涂完工作电极表面为准；5)在20 25 μ L浓度为0. 2 Imol · L—1的磷酸盐缓冲液中，加入上述金磁纳米 微粒-CEA抗体溶液2 5 μ L，然后将固定有聚四氟乙烯阳离子交换膜的工作电极浸入该磷 酸盐缓冲液中，同时在该工作电极的背面加上0. 1 0. 3mT的磁场，让金磁纳米微粒-CEA 抗体吸附于聚四氟乙烯的阳离子交换膜上，磁场作用10分钟，得到金磁纳米微粒-CEA抗 体-聚四氟乙烯阳离子交换膜的癌胚抗原工作电极。所述的CEA抗体为辣根过氧化物酶标记鼠抗人CEA单克隆抗体、辣根过氧化物酶 标记羊抗人CEA单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记羊抗鼠CEA单克隆抗体(这些CEA单克 隆抗体均购自美国sigma公司)。所述金磁纳米微粒的直径为10-50纳米。上述GMP溶液、CEA抗体溶液、BSA溶液都为水溶液。与现有技术相比，本发明的优点在于丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方 法，通过CEA抗体和金磁纳米微粒的溶液混合，然后经CEA抗体包被在金磁纳米微粒表面的 封闭处理，包被的CEA抗体被封闭固定，未包被的CEA抗体被分离，得到金磁纳米微粒-CEA 抗体溶液，另外通过工作电极表面形成Nafion膜，然后将得到的金磁纳米微粒-CEA抗体吸 附于Nafion膜上，得到金磁纳米微粒-CEA抗体-聚四氟乙烯的阳离子交换膜的癌胚抗原 工作电极；该癌胚抗原工作电极可用于定性定量测定血清中的癌胚抗原的免疫传感器中， 在测定时反应池中无需外加电子媒介体(如二茂铁或铁氰化钾等)，血清样品也不必提纯 处理，直接加入反应池中就可以进行免疫应答反应，使用后只需移去外加磁场，即可将其表 面免疫生成物洗脱而实现电极表面更新，达到工作电极可再生利用；因此本发明是一种检测的血清样品不必提纯处理，使用时无需外加电子媒介体，每次使用后电极表面可再生的 丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法。


图1为装有本发明的癌胚抗原工作电极的安培免疫传感器示意图；图2为CEA抗原浓度与电流下降绝对值的线性关系示意图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1一种丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法，包括下述步骤1)将浓度为0. 01 0. Imol · L^Tris-HCl缓冲液5 IOmL置于离心管中，然后 加入浓度为Img ' ιιΓ1直径为10-50纳米的GMP溶液5 10 μ L和浓度为1 3mg Γ1的 辣根过氧化物酶标记鼠抗人CEA单克隆抗体溶液10 μ L，在25 37°C下振荡反应20 30 分钟；2)将上述离心管置于磁性分离器中，在0. 1 0. 3mT的磁场下磁性分离3 10分 钟，弃上清液，这样CEA抗体就包被在GMP表面；3)再在离心管中加入pH为7. 0浓度为0. 2 Imol · L—1的PBS缓冲液5mL和浓 度为10 15mg · ml/1的BSA溶液5 μ L，室温下搅拌1小时，在0. 1 0. 3mT的磁场下磁性 分离3 10分钟，弃上清液，第二次加相同的PBS缓冲液和BSA溶液、搅拌、磁性分离和弃 上清液，第三次加相同的PBS缓冲液和BSA溶液、搅拌、磁性分离和弃上清液，这样经3次重 复磁性分离，进一步封闭包被CEA抗体，同时未包被的CEA抗体被分离，最后得到金磁纳米 微粒-CEA抗体溶液备用；4)在工作电极表面滴涂含有普鲁斯蓝浓度为2 5mol ·厂1和聚四氟乙烯质量百 分浓度为5%的水溶液2-5μ L，室温干燥后，得到固定有聚四氟乙烯阳离子交换膜(Nafion 膜)的工作电极；一般干燥5-10分钟，工作电极表面就形成Nafion膜；5)在20 25 μ L浓度为0. 2 Imol · L—1的PBS缓冲液中，加入上述金磁纳米微 粒-CEA抗体溶液2 5 μ L，然后将固定有Nafion膜的工作电极浸入该磷酸盐缓冲液中，同 时在该工作电极的背面加上0. 1 0. 3mT的磁场，让金磁纳米微粒-CEA抗体吸附于Nafion 膜上，磁场作用10分钟，得到金磁纳米微粒-CEA抗体-聚四氟乙烯阳离子交换膜的癌胚抗 原工作电极。上述Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、BSA溶液的浓度大小，用量多少与GMP溶液浓 度和CEA抗体溶液的量成正相关。实施例2与实施例1基本相同，所不同的只是辣根过氧化物酶标记鼠抗人CEA单克隆抗体 由辣根过氧化物酶标记羊抗人CEA单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记羊抗鼠CEA单克隆抗 体替代。应用例首先将本发明的癌胚抗原工作电极制成如图1所示的安培免疫传感器，该安培免疫传感器包括丝网印刷电极、电极接头e、绝缘层d和连接导线f，连接导线f可与电化学工 作站相连，该丝网印刷电极包括癌胚抗原工作电极a、参比电极b和碳对电极c，然后用该 安培免疫传感器检测添加有不同CEA抗原浓度(0，0. 1,0. 5,1. 5,3. 5,5. 0，10，20，40，60和 80ng/mL)的血清样品，检测方法为在反应池中先加入pH 6. 5含有H2O2的磷酸盐缓冲溶 液，再加入3 20 μ L血清样品，并在25 35°C下温育10 15min，采用示差脉冲伏安法 (DPV)测定还原峰电流。由于溶液中CEA抗原与电极表面CEA抗体发生免疫反应，如图2所 示当被测CEA抗原浓度越高时DPV响应电流也越小。这是因为CEA抗原浓度提高后，溶液 中恒量的CEA抗体与电极表面CEA抗原结合形成免疫复合物机会增大，对电子媒介体电子 传递阻碍增加，因此DPV还原峰电流随着CEA抗原浓度的增加不断下降。
权利要求
丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)将浓度为0.01～0.1mol·L 1的三羟甲基氨基甲烷 盐酸缓冲液5～10mL置于离心管中，再加入浓度为1mg·mL 1的金磁纳米微粒溶液5～10μL和浓度为1～3mg·mL 1的CEA抗体溶液10μL，在25～37℃下振荡反应20～30分钟；2)将上述离心管置于磁性分离器中，在0.1～0.3mT的磁场下磁性分离3～10分钟，弃上清液；3)再在离心管中加入pH7.0浓度为0.2～1mol·L 1的磷酸盐缓冲液5mL和浓度为10～15mg·mL 1的牛血清蛋白溶液5μL，室温下搅拌1小时，在0.1～0.3mT的磁场下磁性分离3～10分钟，弃上清液，重复本步骤3次，得到金磁纳米微粒 CEA抗体溶液备用；4)在工作电极表面滴涂含有普鲁斯蓝浓度为2～5mol·L 1和聚四氟乙烯质量百分浓度为5％的水溶液2 5μL，室温干燥后，得到固定有聚四氟乙烯阳离子交换膜的工作电极；5)在20～25μL浓度为0.2～1mol·L 1的磷酸盐缓冲液中，加入上述金磁纳米微粒 CEA抗体溶液2～5μL，然后将固定有聚四氟乙烯阳离子交换膜的工作电极浸入该磷酸盐缓冲液中，同时在该工作电极的背面加上0.1～0.3mT的磁场，让金磁纳米微粒 CEA抗体吸附于聚四氟乙烯的阳离子交换膜上，磁场作用10分钟，得到金磁纳米微粒 CEA抗体 聚四氟乙烯阳离子交换膜的癌胚抗原工作电极。
2.如权利要求1所述的丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法，其特征在于所 述的CEA抗体为辣根过氧化物酶标记鼠抗人CEA单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗人 CEA单克隆抗体或辣根过氧化物酶标记羊抗鼠CEA单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法，其特征在于所 述的金磁纳米微粒的直径为10-50纳米。
全文摘要
本发明公开了丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法，通过CEA抗体和金磁纳米微粒的溶液混合，然后经CEA抗体包被在金磁纳米微粒表面的封闭处理，包被的CEA抗体被封闭固定，未包被的CEA抗体被分离，得到金磁纳米微粒-CEA抗体溶液，另外通过工作电极表面形成Nafion膜，然后将得到的金磁纳米微粒-CEA抗体吸附于Nafion膜上，得到金磁纳米微粒-CEA抗体-聚四氟乙烯的阳离子交换膜的癌胚抗原工作电极；本发明是一种检测的血清样品不必提纯处理，使用时无需外加电子媒介体，每次使用后电极表面可再生的丝网印刷电极的癌胚抗原工作电极的制备方法。
文档编号G01N33/543GK101923092SQ20101021652
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者余淑萍, 周瑾, 姜晶晶, 干宁, 杨欣 申请人:宁波大学